hello矩乐，大家好普泡，今天我們要繼續(xù)分享一些單細(xì)胞空間在醫(yī)學(xué)研究中的運(yùn)用，參考文章在Spatially organized multicellular immune hubs in human colorectal cancer仍翰，2021年9月發(fā)表與雜志cell吉嚣，頂級期刊，非常要借鑒價值炒嘲，用到了非常多之前介紹的方法宇姚，包括單細(xì)胞技術(shù)，DSP空間技術(shù)夫凸，RNAscope等時下最熱門的生物學(xué)技術(shù)浑劳，也有很多經(jīng)典的分析方法，我們邊分享夭拌，邊給大家總結(jié)魔熏。

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需要注意的分析點

• 基于鄰域中不同細(xì)胞的重復(fù)共定位的細(xì)胞相互作用網(wǎng)絡(luò)
• 細(xì)胞類型的基因表達(dá)程序
• 細(xì)胞相互作用網(wǎng)絡(luò)
• NMF 對基因程序的從頭識別,轉(zhuǎn)錄程序的相似性，轉(zhuǎn)錄程序的共表達(dá)
• 免疫細(xì)胞與組織腫瘤細(xì)胞的定位問題
• 目標(biāo)細(xì)胞生態(tài)位（這個強(qiáng)調(diào)過很多次了）
• PAGA分析cluster之間的相似性
• 細(xì)胞鄰域分析

In brief

Single-cell transcriptomics-based covariation analysis of human colorectal cancer identifies a spatially resolved myeloid-rich inflammatory hub that is shared by mismatch repair-deficient (MMRd) and mismatch repair-proficient (MMRp) tumors and CXCR3-ligand+ multicellular foci distinct for MMRd tumors.

SUMMARY

對癌癥的免疫反應(yīng)是高度可變的鸽扁，mismatch repair-deficient (MMRd) 腫瘤比mismatch repair-proficient(MMRp) 腫瘤表現(xiàn)出更多的抗腫瘤免疫力蒜绽。為了理解控制這些不同反應(yīng)的規(guī)則，轉(zhuǎn)錄分析了來自 28 個 MMRp 和 34 個 MMRd 個體的結(jié)直腸腫瘤和鄰近正常組織的 371,223 個細(xì)胞献烦。對 88 個細(xì)胞亞群及其 204 個相關(guān)基因表達(dá)程序的分析揭示了跨腫瘤的廣泛轉(zhuǎn)錄和空間重塑滓窍。為了發(fā)現(xiàn)相互作用的惡性細(xì)胞和免疫細(xì)胞的hub卖词，分析確定了不同細(xì)胞類型中的表達(dá)程序巩那，這些細(xì)胞類型在受影響個體的腫瘤中共變，并使用空間分析來定位協(xié)調(diào)程序此蜈。在腫瘤-管腔界面處發(fā)現(xiàn)了一個與組織損傷相關(guān)的髓樣細(xì)胞吸引hub和腫瘤內(nèi)富含 MMRd 的免疫h(yuǎn)ub即横，激活的 T 細(xì)胞與表達(dá) T 細(xì)胞與吸引趨化因子的惡性細(xì)胞和髓樣細(xì)胞一起。通過識別相互作用的細(xì)胞程序裆赵，揭示了空間組織的免疫惡性細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)的潛在邏輯东囚。

INTRODUCTION

幾乎所有的腫瘤都被免疫細(xì)胞浸潤，但不同癌癥和個體腫瘤之間的免疫反應(yīng)類型及其對腫瘤生長战授、轉(zhuǎn)移和死亡的影響差異很大页藻。 相互作用受到調(diào)節(jié)，并且它們在腫瘤內(nèi)的空間組織方式仍然知之甚少植兰。
結(jié)直腸腫瘤顯示出很大的免疫反應(yīng)動態(tài)范圍份帐，兩種基因不同的亞型之間存在顯著差異：mismatch repair-deficient (MMRd) 結(jié)直腸腫瘤具有高突變負(fù)荷，通常含有毒性 T 細(xì)胞浸潤楣导，并且對免疫檢查點封鎖有 ~50% 的反應(yīng)率废境，而mismatch repair-proficient (MMRp) 腫瘤具有低突變負(fù)荷并且在很大程度上對免疫療法無反應(yīng)。
bulk腫瘤或單細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄譜已被用于將結(jié)直腸癌 (CRC) 分類為亞型，定義它們的細(xì)胞組成噩凹，并根據(jù)受體-配體對的表達(dá)推斷細(xì)胞類型之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)巴元。 然而，這些研究集中在離散的細(xì)胞cluster上驮宴，并沒有捕捉到轉(zhuǎn)錄程序的全部范圍逮刨，這些轉(zhuǎn)錄程序可以作為cluster內(nèi)或跨cluster的程序活動的連續(xù)梯度存在。 最近堵泽，基于成像的研究強(qiáng)調(diào)了基于鄰域中不同細(xì)胞的重復(fù)共定位的細(xì)胞相互作用網(wǎng)絡(luò)禀忆。 然而，這些研究受到預(yù)選標(biāo)記數(shù)量的限制落恼，這些標(biāo)記可以解析關(guān)鍵細(xì)胞類型箩退，但不能解析其更精細(xì)的特征。
在這里佳谦，作者開發(fā)了一種基于單細(xì)胞 RNA 測序 (scRNA-seq) 譜的系統(tǒng)方法來發(fā)現(xiàn)細(xì)胞類型戴涝、它們的基礎(chǔ)程序和細(xì)胞cluster，并將其應(yīng)用于研究人類 MMRd 和 MMRp CRC 的區(qū)別特征钻蔑。在免疫細(xì)胞啥刻、基質(zhì)細(xì)胞和惡性細(xì)胞中鑒定了 88 個細(xì)胞亞群，以及 204 個相關(guān)的基因表達(dá)程序咪笑。揭示了基于個體腫瘤不同細(xì)胞亞群中基因程序活動共變的多細(xì)胞相互作用網(wǎng)絡(luò)可帽，并對預(yù)測的細(xì)胞亞群和程序的關(guān)鍵分子進(jìn)行了成像，以在受影響個體的匹配組織中定位這些相互作用網(wǎng)絡(luò)窗怒。分析發(fā)現(xiàn)基質(zhì)重塑導(dǎo)致 MMRd 腫瘤中產(chǎn)生骨形態(tài)發(fā)生蛋白 (BMP) 的成纖維細(xì)胞減少映跟，以及整個腫瘤中成纖維細(xì)胞衍生的干細(xì)胞生態(tài)位因子的錯誤定位。在原發(fā)性 MMRd 和 MMRp 腫瘤的管腔邊緣發(fā)現(xiàn)了惡性細(xì)胞扬虚、單核細(xì)胞努隙、成纖維細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的炎癥相互作用網(wǎng)絡(luò)，以及 MMRd 特異性免疫活性熱點辜昵，包括與活化 T 細(xì)胞相鄰的表達(dá)趨化因子的惡性和非惡性細(xì)胞荸镊。研究展示了一條發(fā)現(xiàn)多細(xì)胞相互作用網(wǎng)絡(luò)的途徑，這些網(wǎng)絡(luò)是人類癌癥免疫和致瘤過程的基礎(chǔ)堪置。

RESULTS

A comprehensive atlas of cell subsets, programs, and multicellular interaction networks in MMRd and MMRp CRC（MMRd 和 MMRp CRC 中細(xì)胞亞群躬存、程序和多細(xì)胞相互作用網(wǎng)絡(luò)的綜合圖譜 ）

為了發(fā)現(xiàn)惡性、免疫和基質(zhì)細(xì)胞如何在 MMRd 和 MMRp CRC 中相互作用舀锨，分析了來自 34 個 MMRd 和 28 個 MMRp 個體（另外收集了 2 個個體的lesion）以及鄰近的正常結(jié)腸組織的 36 個未治療的原發(fā)性腫瘤樣本岭洲。 對分離的新鮮組織進(jìn)行了基于液滴的 scRNA-seq，保留了 371,223 個高質(zhì)量細(xì)胞雁竞，包括 168,672 個上皮細(xì)胞（非惡性和惡性）钦椭、187,094 個免疫細(xì)胞和 15,457 個基質(zhì)細(xì)胞拧额。

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• 注：MMR status and clinical characteristics of primary untreated individuals with CRC.

  
  
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• 注：(A) Number of cells in immune (T/NK/ILC, B, Plasma, Mast, Myeloid), stromal (Endothelial cells, Pericytes, Fibroblasts, Smooth Muscle cells, Schwann cells), and epithelial (malignant in tumor and non-malignant in normal specimens) compartment per specimen.(B) Number of cells per cluster (left) and fraction of cells from MMRd, MMRp, and normal specimens (right) within each cluster. Each specimen is indicated by a different color shade and separated by a vertical black line.

通過兩步圖聚類方法定義了細(xì)胞subset和轉(zhuǎn)錄程序。首先彪腔，將所有細(xì)胞分為 7 個主要部分（T/自然殺傷 [NK]/先天淋巴細(xì)胞 [ILC]侥锦、B、血漿德挣、肥大恭垦、髓細(xì)胞、基質(zhì)/內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞）格嗅。其次番挺，在每個分區(qū)內(nèi)，我們使用一致非負(fù)矩陣分解（NMF）推導(dǎo)出cluster（prefix“c”）和轉(zhuǎn)錄程序（具有共變表達(dá)的基因組屯掖，prefix“p”）玄柏。細(xì)胞cluster和基因程序彼此獨立編號。 NMF 對程序的從頭識別實現(xiàn)了多項關(guān)鍵分析：(1) 同時識別跨多種細(xì)胞類型（例如增殖贴铜、代謝和免疫程序）共享的程序式散，特定于細(xì)胞類型（例如漿細(xì)胞樣樹突細(xì)胞 [pDC]程序）买乃，和/或以簇內(nèi)或簇間的連續(xù)梯度表示； (2) 盡管存在強(qiáng)烈的個體特異性轉(zhuǎn)錄狀態(tài)矮冬，但發(fā)現(xiàn)個體間惡性細(xì)胞共有的生物學(xué)特性豁鲤； (3) 識別跨多個腫瘤的共變程序枷邪，以找到反映細(xì)胞相互作用或?qū)餐|發(fā)因素的反應(yīng)的協(xié)調(diào)細(xì)胞或狀態(tài)網(wǎng)絡(luò)没宾。

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• 注：(B) tSNEs (t-distributed stochastic neighbor embedding) by major cell partitions (left), tissue type (middle), or specimen (right). (C) NMF-based gene programs can be cell type specific (example 1, pS02-Fibro matrix/stem cell niche) or shared (example 2, pTNI03-proliferation; example 3, pEpi30-ISGs).

Remodeling of the immune cell compartment in MMRd and MMRp CRC（免疫細(xì)胞compartment的重構(gòu) ）

為了了解 CRC 中差異免疫反應(yīng)的基礎(chǔ)侠讯，首先比較了 MMRd 和 MMRp CRC 與正常結(jié)腸組織的免疫組成，發(fā)現(xiàn)腫瘤和正常組織之間以及 MMRd 和 MMRp 腫瘤之間發(fā)生了顯著的重塑把介。 具體而言勤讽，作為腫瘤（MMRd 或 MMRp）和正常結(jié)腸組織之間所有免疫細(xì)胞的一部分，43 個免疫細(xì)胞cluster中有 37 個differentially abundant劳澄。 腫瘤耗盡了產(chǎn)生免疫球蛋白 A (IgA) 的漿細(xì)胞地技、B 細(xì)胞、IL7R+ T 細(xì)胞和 gd 樣 T 細(xì)胞秒拔，并富含調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞 (Treg)、單核細(xì)胞飒硅、巨噬細(xì)胞和相對于正常結(jié)腸可能的中性粒細(xì)胞

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• 注：Compositional changes in immune cell clusters in MMRpandMMRd tumors relative to adjacent normal tissue. Kruskal-Wallis false discovery rate (FDR) < 0.05 for MMRp versus MMRd are marked with asterisks.

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• 注：(A) Heatmaps showing selected unbiased and well-established marker genes for immune clusters as mean expression in normalized log2(TP10K+1). Clusters with differences in frequency between MMRp and MMRd tumors with Kruskal-Wallis false discovery rate (FDR) < 0.05 are marked with *. A comprehensive list of DEGs for each cluster can be found in Table S2. (B) Changes in immune cell clusters in MMRp and MMRd tumors relative to adjacent normal tissue, showing frequency of immune cells (dot size) and enrichment/depletion (Pearson residual, colored squares). Clusters with differences in frequency between MMRp and MMRd tumors with Kruskal-Wallis false discovery rate (FDR) < 0.05 are marked with *.

腫瘤中單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞顯著擴(kuò)增砂缩。 單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞上調(diào)腫瘤特異性 NMF 衍生的轉(zhuǎn)錄程序，其特征在于可以放大炎癥的基因（pM02 中的 MMP12 和 MMP9）三娩、募集骨髓細(xì)胞（pM10 中的趨化因子 CCL2 和 CCL7）庵芭、刺激生長（pM14 中的生長因子 VEGFA 和 EREG ），并解決炎癥（APOEin pM06）雀监。 來自 MMRd 腫瘤的骨髓細(xì)胞顯示出更高的糖酵解基因程序活性 (pM03)双吆、免疫激活警報蛋白如 S100A8/9/12 (pM16) 和吸引單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的趨化因子 (pM20)眨唬。 總體而言，單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞在腫瘤中進(jìn)行了重塑好乐，并在 MMRd 腫瘤中表達(dá)了更多的免疫激活程序匾竿。

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• 注：(B) tSNEs of myeloid cells in all normal and tumor samples. (C) Activities of selected myeloid gene programs with high activities in monocytes and macrophages. Each dot indicates the 75th percentile of the program activity in the myeloid cells of one specimen. GLME (generalized linear mixed model) FDR: **** %0.0001, *** %0.001, ** %0.01, * %0.05, not significant (ns) for > 0.05. tSNEs below show program activities within the myeloid compartment. For each program, the top genes are listed below, with circle size indicating the relative weight of each gene within the program.

T cell compartment differences between MMRd and MMRp tumors

MMRd 與 MMRp 腫瘤的免疫組成的主要變化發(fā)生在 T 細(xì)胞compartment中。 在 MMRd 腫瘤中富集的cluster中有 CXCL13+ T 細(xì)胞和 PDCD1+ gd 樣 T 細(xì)胞蔚万，而 IL17+ T 細(xì)胞在 MMRp 腫瘤中富集岭妖。 T 細(xì)胞中的 CXCL13 在其他 CRC 和黑色素瘤單細(xì)胞研究中已被注意到，并且最近已成為人類腫瘤反應(yīng)性 CD8+ T 細(xì)胞和免疫治療反應(yīng)的標(biāo)志物反璃。因此昵慌，假設(shè)抗腫瘤 T 細(xì)胞免疫可能在 MMRd 中經(jīng)常發(fā)生，但在 MMRp 腫瘤中很少發(fā)生.

富含 MMRd 與 MMRp T 細(xì)胞的程序包括兩個程序（pTNI18 與 CXCL13淮蜈、PDCD1斋攀、TOX；pTNI06 與主要組織相容性復(fù)合體 [MHC] II 類梧田、IFNG 和 LAG3）在 T 細(xì)胞受體 [TCR] αβ- 和 TCR γσ- 樣 T 細(xì)胞中具有高和中等活性細(xì)胞蜻韭，以及 CD8+、γσ-樣柿扣、PLZF+ (ZBTB16) T 細(xì)胞和 NK 細(xì)胞共享的一種細(xì)胞毒性程序 (pTNI16)肖方。 PLZF+ T 細(xì)胞和 NK/ILC3 細(xì)胞被先天 T 細(xì)胞程序 (pTNI08) 選擇性標(biāo)記，與正常組織相比未状，該程序在 MMRd 和 MMRp 腫瘤中減少俯画。 在三個外部 CRC 隊列中證實了 CXCL13 和細(xì)胞毒性程序（僅可歸因于 T/NK/ILC 分區(qū)，使我們能夠分析大量數(shù)據(jù)）的更高 MMRd 活性司草。 因此艰垂，在 MMRd 腫瘤中，T 和 NK 細(xì)胞亞群獲得細(xì)胞溶解特性（GNLY埋虹、GZMB 和 PRF1）猜憎，并且 T 細(xì)胞獲得與慢性刺激相關(guān)的耗竭標(biāo)志物（例如，PDCD1搔课、TOX胰柑、LAG3 和 HAVCR2）。

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CXCL13+ T cells localize within MMRd tumors

鑒于 CXCL13+ T 細(xì)胞在 MMRd 腫瘤中的富集及其先前與免疫治療反應(yīng)的關(guān)聯(lián)以及肺癌中三級淋巴結(jié)構(gòu) (TLS) 的定位爬泥，用靶向 CXCL13 和 CD3E 的 RNA 探針對隊列中的組織切片進(jìn)行了染色柬讨。 在整個 MMRd 腫瘤中發(fā)現(xiàn)了豐富的 CXCL13+ T 細(xì)胞，TLS 之外袍啡，通常在侵襲性邊界處發(fā)現(xiàn)踩官。 TLS 相關(guān)的 CXCL13 主要存在于網(wǎng)狀模式的非 T（CD3E 陰性）細(xì)胞中，這與基質(zhì)和濾泡樹突細(xì)胞作為 TLS 中 CXCL13 來源的報道一致境输。 表達(dá) CXCL13 的常規(guī) CD4+ 和 CD8+ T 細(xì)胞位于淋巴結(jié)構(gòu)之外蔗牡，但靠近癌細(xì)胞颖系，與effector activity一致。

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• 注：Localization of CXCL13+ T cells in tumor center versus lymphoid structure. Left: H&E. Right: CD3E and CXCL13 RNA in situ hybridization (ISH). Scalebar, 200 mm.

Highly altered endothelial cells in MMRd and MMRp tumors

基質(zhì)compartment在兩種腫瘤類型中都被重塑辩越，內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞作為基質(zhì)細(xì)胞的一部分增加嘁扼，而淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞作為腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞與正常細(xì)胞的一部分相比減少。除了腫瘤和正常細(xì)胞之間共享的一個cluster外区匣，還發(fā)現(xiàn)了 8 個腫瘤特異性內(nèi)皮細(xì)胞cluster偷拔，在MMRd 和 MMRp 腫瘤之間沒有顯著差異。量化腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞cluster與正常結(jié)腸細(xì)胞之間的相似性（使用基于分區(qū)的圖形抽象 [PAGA]）亏钩，發(fā)現(xiàn)了動脈和靜脈細(xì)胞的改變版本以及幾個未映射回正常細(xì)胞的cluster莲绰，例如尖端細(xì)胞和增殖細(xì)胞。有趣的是姑丑，這些增殖的內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá) HIF1A 和 CSF3蛤签，表明存在代謝和炎癥變化。具有基底膜膠原蛋白栅哀、促血管生成分子和尖端細(xì)胞標(biāo)記物的 pS10 程序在所有腫瘤特異性cluster中上調(diào)震肮，而干擾素刺激基因 (ISG)/抗原呈遞 (pS05) 程序被抑制，如前所述留拾。因此戳晌，內(nèi)皮細(xì)胞在腫瘤中高度改變，具有更多的血管生成程序活性和免疫相關(guān)基因表達(dá)的變化痴柔。

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Inflammatory fibroblasts localize to the luminal surface of tumors

成纖維細(xì)胞分為 11 個subgroup沦偎，其中 6 個在腫瘤中占優(yōu)勢，5 個在正常結(jié)腸樣本中咳蔚。 與之前描述的肌成纖維細(xì)胞癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞類似豪嚎，3 個癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞亞群 (cS26-cS28)（和腫瘤周細(xì)胞）表達(dá)了一種收縮程序（pS03），其中包括平滑肌肌動蛋白（ACTA2）谈火，其中一個亞群（cS26侈询，肌成纖維細(xì)胞）與平滑肌程序（pS01）一起高度表達(dá)，與平滑肌細(xì)胞和周細(xì)胞共享糯耍。

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• 注：Selected programs in fibroblast and pericyte subtypes shown as in (D). Shown below are PAGA-based connectivity weights > 0.25.

  
  
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• 注Activities of pS03 (ACTA2), pS13 (inflammation), and pS17 (BMP fibro) in fibroblasts and pS03 and pS13 in pericytes, shown as in (E)扔字。

兩個癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞 (CAF) 亞群（cS28 和 cS29）在兩種腫瘤類型中都表達(dá)了炎癥程序 (pS13)，在 MMRd 腫瘤中具有更高的活性谍肤。 該程序反映了之前描述的炎癥性 CAF 和炎癥性腸病中的炎癥性成纖維細(xì)胞啦租，包括組織重塑因子（MMP1 和 MMP3）和中性粒細(xì)胞吸引趨化因子（CXCL8 和 CXCL1）。 8 個 CRC 標(biāo)本（4 個 MMRd 和 4 個 MMRp）中 MMP3 和無處不在的成纖維細(xì)胞標(biāo)志物 COL1A1 的組織染色顯示荒揣，這些高度炎癥的成纖維細(xì)胞在 MMRd 和 MMRp 腫瘤的結(jié)腸腔邊緣（LM）擴(kuò)張血管周圍顯著富集。

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BMP-expressing CAFs are reduced in MMRd CRC, whereas CAF-derived stem cell niche factors are abnormally present throughout tumors

為了進(jìn)一步了解 CAF 的功能改變焊刹，基于共享程序和基于 PAGA 的cluster之間的相似性系任，將 CAF 與來自正常結(jié)腸組織的成纖維細(xì)胞進(jìn)行了比較 恳蹲。鑒定了表達(dá) BMP 的成纖維細(xì)胞 (c23、c24) 的 CAF 等效物 (cS27)俩滥，這些細(xì)胞排列在正常結(jié)腸上皮細(xì)胞中嘉蕾，并通過 BMP 和 Wnt 拮抗劑（如 FRZB）抑制 Wnt 來驅(qū)動上皮細(xì)胞分化。 這些可能對應(yīng)于小腸中 PDGFRA 高的端細(xì)胞亞群霜旧。 通過 CXCL14 表達(dá)將表達(dá) BMP 的 CAF 與其他 CAF subset區(qū)分開來错忱。CXCL14+ 成纖維細(xì)胞排列在正常組織和腫瘤的上皮細(xì)胞中。先前的bulk RNA-seq 研究報告了 MMRd 與 MMRp CRC 中 CXCL14 的表達(dá)降低挂据，但表明這是由于惡性上皮細(xì)胞中的差異表達(dá)以清。 盡管 MMRd 與 MMRp 惡性細(xì)胞中的 CXCL14 表達(dá)顯著但適度（減少 ~1.25 倍），但 CXCL14 在惡性細(xì)胞中很少表達(dá)（~9.2% 的 MMRp 和 1.5% 的 MMRd 惡性細(xì)胞）崎逃，只有一個例外（ MMRp個體C103）掷倔。

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• 注：(J) Quantification of CXCL14+, GREM1+, and MMP3+ CAFs among COL1A1/COL1A2+ fibroblasts based on whole-slide scans of 5 MMRd and 4 MMRp CRC specimens from (I); Mann-Whitney-Wilcoxon test. Rightmost graph: MMP3+ cells among all COL1A1/COL1A2+ cells outside or inside of the LM (defined as % 360 mm from the luminal border of the tumor); Wilcoxon matched-pairs signed rank test. Only 8 samples are included on the right because one clinical paraffin block did not contain LM. (K) Gene signature scores of top differentially expressed genes from CXCL14+ CAFs, GREM1+ CAFs, MMP3+ CAFs, and all fibroblasts in bulk RNA-seq from TCGA-CRC (COADREAD). Mann-Whitney-Wilcoxon test: ****p %0.0001, ***p %0.001, **p %0.01, *p %0.05, ns for > 0.05.

CAF 還有助于干細(xì)胞生態(tài)位因子的表達(dá)勒葱，例如 RSPO3 和 GREM1，它們在整個腫瘤中廣泛表達(dá)巴柿，而它們在正常組織中的隱窩相關(guān)表達(dá)較低凛虽。 具體而言，在非腫瘤組織中广恢，RSPO3 和 GREM1 的表達(dá)受到嚴(yán)格限制到隱窩底部以下的區(qū)域凯旋，最突出的是沿著類似于粘膜肌層的分布。相比之下袁波，GREM1+ 和 RSPO3+ 細(xì)胞出現(xiàn)在從基底向上延伸到腫瘤體的基質(zhì)帶中瓦阐。在 MMRd 標(biāo)本中，這些細(xì)胞也占據(jù)與表達(dá) CXCL14+ BMP 的成纖維細(xì)胞的上皮細(xì)胞相似的位置篷牌。 RSPO3 的高表達(dá)可驅(qū)動腫瘤生長睡蟋，并且可能由一小部分人 CRC 中的 PTPRK-RSPO3 融合事件引起。分析的數(shù)據(jù)表明枷颊，增加獲得干細(xì)胞生態(tài)位因子（如 RSPO3）的更常見機(jī)制可能是通過基質(zhì)細(xì)胞和/或其程序（尤其是 CAF）的空間重新分布發(fā)生的戳杀。

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Malignant cells are actively engaged in the immune response

由于惡性細(xì)胞通常按個體分組（與按細(xì)胞亞群聚集的正常上皮細(xì)胞相反），識別它們的共同特性可能更具挑戰(zhàn)性夭苗。 因此信卡，我們推導(dǎo)出并分析了惡性細(xì)胞中 43 個表達(dá)程序的活動，這些程序并非特定于單個個體题造。 我們還根據(jù)與正常結(jié)腸上皮細(xì)胞亞型的相似性對惡性細(xì)胞進(jìn)行了分類傍菇，以更好地了解它們的功能特性。
許多程序在惡性和正常上皮細(xì)胞之間具有不同的活性界赔。 例如丢习，與正常上皮細(xì)胞相比牵触，惡性上皮細(xì)胞的成熟腸上皮細(xì)胞程序減少，增殖程序增加咐低，這與絕大多數(shù)惡性細(xì)胞被歸類為干/轉(zhuǎn)運(yùn)擴(kuò)增 (TA) 樣細(xì)胞一致揽思。 在差異活躍的程序中，與 MMRp 相比见擦，有 10 個在 MMRd 中的活性更高钉汗，6 個更低，在 3 個外部數(shù)據(jù)集中驗證了這一發(fā)現(xiàn)鲤屡，以及我們的隊列和癌癥基因組圖譜 (TCGA) 中的類似程序分組损痰。
特別是，3 個免疫相關(guān)程序顯示 MMRd 和 MMRp 惡性細(xì)胞之間的活性升高：ISG（包括干擾素 γ targets）和 MHC II 類基因程序（pEpi34）在 MMRd 中比 MMRp 腫瘤更活躍（3.4 倍）执俩，ISG （I 型干擾素靶點）和 MHC I 類基因程序（pEpi30）在 MMRd 與 MMRp 相比輕度升高（1.6 倍徐钠，在正常上皮細(xì)胞中也有一些活性），以及中性粒細(xì)胞和免疫吸引趨化因子程序（CXCL1役首、CXCL2 尝丐、CXCL3 和 CCL20) (pEpi06) 在 MMRd 與 MMRp 腫瘤（1.6 倍）和兩種腫瘤類型中均高于正常細(xì)胞。 因此衡奥，惡性細(xì)胞爹袁，尤其是在 MMRd 腫瘤中，表達(dá)可能介導(dǎo)與免疫系統(tǒng)相互作用的免疫相關(guān)程序矮固。

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Co-variation of program activities across individuals predicts multicellular immune hubs

接下來假設(shè)一種細(xì)胞類型中基因程序的一些變化可能與另一種細(xì)胞類型的變化有關(guān)失息，要么是因為一種細(xì)胞類型對另一種細(xì)胞類型的直接影響，要么是因為共同影響兩種細(xì)胞類型的共享信號或鄰域
為了找到這樣的多細(xì)胞協(xié)調(diào)程序網(wǎng)絡(luò)档址，搜索了與受影響個體樣本相關(guān)的程序活動（以下稱為共變程序）盹兢，分別分析 MMRd 和 MMRp 以更好地捕捉兩種免疫學(xué)不同的腫瘤類型之間的差異。 使用 22 個髓系守伸、21 個 T/NK/ILC 細(xì)胞基因程序和 MMRd 或 MMRp 衍生的惡性上皮程序（pEpiTd 和 pEpiTp）計算了每組樣本中程序活動的成對相關(guān)性绎秒。 不包括基質(zhì)細(xì)胞，因為每個樣品的基質(zhì)細(xì)胞數(shù)量不足以進(jìn)行共變分析尼摹。 最后见芹，我們使用基于圖的程序聚類來識別 MMRd 中的 7 個共變多細(xì)胞hubs和 MMRp 樣本中的 9 個。 這些hubs由跨細(xì)胞類型表達(dá)的多個程序組成蠢涝，揭示了多細(xì)胞相互作用網(wǎng)絡(luò)
為了識別彼此相似的程序玄呛，因此更有可能由共同機(jī)制觸發(fā)，計算了程序之間top基因的重疊和二。 該分析揭示了不同細(xì)胞類型的免疫徘铝、代謝和其他程序相似。 分析注意到共變程序不需要彼此相似（盡管它們可以）并且通常以不同的top基因集為特征。
為了研究惡性細(xì)胞和免疫細(xì)胞之間的相互作用庭砍，我們關(guān)注了 2 個 MMRd 衍生的多細(xì)胞hubs（hubs 3 和 6）场晶，其中在免疫細(xì)胞中活躍的程序與在惡性細(xì)胞中活躍的免疫相關(guān)程序共變混埠。

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Malignant cells, fibroblasts, monocytes, and neutrophils engage in inflammatory responses at the luminal surface of primary MMRd and MMRp tumors（惡性細(xì)胞怠缸、成纖維細(xì)胞、單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞在原發(fā)性 MMRd 和 MMRp 腫瘤的管腔表面參與炎癥反應(yīng) ）

Hub 3 的特點是惡性細(xì)胞和單核細(xì)胞中的炎癥程序與中性粒細(xì)胞程序共變钳宪，與正常組織相比揭北，所有這些程序在 MMRd 和 MMRp 腫瘤中都高度活躍。 在hub也發(fā)現(xiàn)了 Treg 和 IL17 T 細(xì)胞程序吏颖。 Hub 3 在 MMRp 樣本中很活躍搔体，它的程序及其相關(guān)性在外部單細(xì)胞隊列中被概括。 基于炎性骨髓半醉、間質(zhì)和惡性程序的相似性疚俱，顯示重疊基因和共享轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測，如核因子 kB (NF-κB) 和 CEPBP缩多，還包括間質(zhì)程序 pS13（在 GREM1+ 和 MMP3+ CAF 中活躍) 在我們對hub 3 的分析中呆奕。
為了了解驅(qū)動這些惡性/免疫/基質(zhì)細(xì)胞相互作用的通訊途徑，檢查了在炎癥和共變中性粒細(xì)胞程序的top基因中發(fā)現(xiàn)的所有趨化因子和細(xì)胞因子衬吆。 該分析表明梁钾，惡性細(xì)胞、GREM1+ 和 MMP3+ CAF逊抡、單核細(xì)胞和表達(dá)同源趨化因子 (CXCL1/2/3/5/6/8) 的中性粒細(xì)胞協(xié)同吸引 CXCR1/2+ 中性粒細(xì)胞姆泻。 在體外用hub 3 炎癥單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞程序中發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞因子刺激時，CRC 衍生的成纖維細(xì)胞和 CRC 惡性細(xì)胞中相同的趨化因子冒嫡，如 IL1B拇勃。因此，惡性細(xì)胞孝凌、CAF方咆、單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞似乎協(xié)同工作募集骨髓細(xì)胞并通過炎性細(xì)胞因子放大骨髓細(xì)胞的募集。
為了在腫瘤組織中定位這個炎癥hub胎许，對 MMRd 和 MMRp 標(biāo)本進(jìn)行染色峻呛，以獲得中性粒細(xì)胞、骨髓細(xì)胞和惡性上皮細(xì)胞的標(biāo)志物以及 IL1B 和 CXCL1 轉(zhuǎn)錄物辜窑。 8 個檢查的樣本中有 7 個顯示在惡性細(xì)胞與結(jié)腸腔的界面處钩述，尤其是在大量壞死的部位，中性粒細(xì)胞以及 IL1B+ 和 CXCL1+ 細(xì)胞顯著積聚穆碎。盡管在惡性細(xì)胞和骨髓細(xì)胞中觀察到了 CXCL1牙勘，但在既不是骨髓細(xì)胞也不是上皮細(xì)胞的細(xì)胞中存在強(qiáng)烈的 CXCL1 信號。盡管這些細(xì)胞很可能是 MMP3+ CAF，因為它們通過 scRNA-seq 表達(dá)最高水平的 CXCL1方面，并且主要在管腔表面發(fā)現(xiàn)放钦，但需要進(jìn)一步的成像研究來證實這一預(yù)測。鑒于該炎癥hub的細(xì)胞和分子定位以及管腔邊界處的基質(zhì)重塑恭金，分析認(rèn)為原發(fā)性 CRC 管腔邊緣的損傷可能有助于正炎癥反饋回路操禀，從而驅(qū)動富含髓細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的環(huán)境在這些腫瘤中。

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A coordinated network of CXCL13+ T cells with myeloid and malignant cells（坐標(biāo)網(wǎng)絡(luò)）

Hub 6 由在髓細(xì)胞和惡性細(xì)胞中表達(dá)的 ISG/MHC II 類基因程序組成（可能由干擾素 g[IFNg] 誘導(dǎo)并由 IRF/STAT 轉(zhuǎn)錄因子驅(qū)動）横腿，其與 IFNG/MHC-II 和 CXCL13/ PDCD1 T 細(xì)胞程序颓屑。 這些 T 細(xì)胞程序包括激活和耗竭的標(biāo)志物，已知這些標(biāo)志物可以標(biāo)記慢性刺激的腫瘤反應(yīng)性 T 細(xì)胞耿焊。
重要的是揪惦，當(dāng)將網(wǎng)絡(luò)投影到 MMRp 特定分析中時，沒有在特定于 MMRp 的分析中推導(dǎo)出這個hub罗侯，并觀察到核心程序的活動較弱器腋，并且網(wǎng)絡(luò)的連接性降低（例如，惡性 pEpiTd19 和 T 細(xì)胞 pTNI18 程序之間的聯(lián)系丟失） 數(shù)據(jù)集中的 MMRp 腫瘤和外部 scRNA-seq 數(shù)據(jù)集钩杰，與 MMRp 腫瘤較弱的免疫原性一致 纫塌。
為了驗證 ISG/MHC-II 惡性和 CXCL13 T 細(xì)胞程序的協(xié)同活性，對來自 3 個腫瘤的組織切片進(jìn)行了空間索引轉(zhuǎn)錄分析（GeoMx 數(shù)字空間分析榜苫，DSP）护戳，這些腫瘤在匹配 scRNA-seq 中顯示出高 CXCL13 T 細(xì)胞程序活性。 我們分析了每個腫瘤切片的 45 個感興趣區(qū)域 (ROI)垂睬，并進(jìn)一步將每個區(qū)域劃分為上皮和非上皮區(qū)域媳荒。 我們觀察到每個腫瘤所有區(qū)域的惡性上皮區(qū)域的 ISG 表達(dá)與相鄰非上皮區(qū)域的 CXCL13 表達(dá)之間呈正相關(guān)，進(jìn)一步支持該hub惡性和 T 細(xì)胞之間的潛在相互作用驹饺。
除了由衰竭的 T 細(xì)胞表達(dá)的抑制性受體外钳枕，惡性 ISG/MHC-II 程序還具有抑制性分子，包括編碼酶 IDO1 和 CD38 的轉(zhuǎn)錄物赏壹。 IDO1 和 CD38 在 4 個個體的惡性 ROI 中的表達(dá)與通過 scRNA-seq 測量的相同個體的表達(dá)相當(dāng)鱼炒。 此外，IDO1 或 CD38 表達(dá)與這兩個基因的高 scRNA-seq 衍生表達(dá)和 CXCL13 T 細(xì)胞程序的個體的 ISG 評分在空間上相關(guān)蝌借。 這些結(jié)果表明昔瞧，負(fù)反饋是中樞功能的一部分，并受每個腫瘤中患者特異性和區(qū)域特異性因素的調(diào)節(jié)菩佑。

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CXCL13+ T cells are localized within foci of CXCL10/CXCL11-expressing cells throughout the tumor

鑒于非惡性區(qū)域中具有 CXCL13 的惡性細(xì)胞中 ISG 的空間相關(guān)表達(dá)自晰，我們假設(shè) T 細(xì)胞將在空間上組織在表達(dá) T 細(xì)胞吸引趨化因子的細(xì)胞周圍。 我們檢查了 hub 6 基因程序中的所有趨化因子稍坯，發(fā)現(xiàn)髓系酬荞、惡性和間質(zhì) ISG 程序包括趨化因子 CXCL9、CXCL10 和 CXCL11，并且它們的同源受體 CXCR3 在活化的 T 細(xì)胞和某些樹突狀細(xì)胞 (DC) 亞群中上調(diào) .使用我們的三個高度 T 細(xì)胞浸潤樣本（個體 C107混巧、C110 和 C132）的空間索引轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)集枪向，我們通過發(fā)現(xiàn)非上皮細(xì)胞中的 CXCL13 表達(dá)與相同 ROI 的惡性細(xì)胞中的 CXCR3 配體表達(dá)相關(guān)聯(lián)來驗證這一觀察結(jié)果。
為了在單細(xì)胞分辨率下進(jìn)一步驗證這種空間關(guān)聯(lián)咧党，我們對來自 scRNA-seq 隊列的 9 個 CRC 標(biāo)本進(jìn)行了全切片染色秘蛔。 我們發(fā)現(xiàn) CXCL10/CXCL11 陽性細(xì)胞聚集成大病灶，富含表達(dá) CXCL13 和/或 IFNG 的細(xì)胞以及 CD3E+ T 細(xì)胞凿傅。 有趣的是缠犀，具有高（3 MMRd 和 1 MMRp）與低（2 MMRd 和 3 MMRp）CXCL13+ T 細(xì)胞程序活性的標(biāo)本中的病灶傾向于分別在惡性細(xì)胞和非上皮細(xì)胞中顯示 CXCL10/CXCL11 表達(dá)，但需要額外的研究確認(rèn)這個觀察 聪舒。
在所有樣本中，與 CXCL10/CXCL11 陰性對應(yīng)物相比虐急，CXCL10/CXCL11+ 惡性細(xì)胞平均更接近 CD3E+箱残、CXCL13+ 和 IFNG+ 細(xì)胞，并且這些距離在病灶內(nèi)特別小止吁。 最后被辑，pTNI18（CXCL13 程序）和 pEpiTd19（ISG 程序）具有更高 scRNA-seq 活性的樣本有更多細(xì)胞參與 CXCL10/CXCL11 病灶。 因此敬惦，我們的研究結(jié)果揭示了激活的 IFNG+ 和 CXCL13+ T 細(xì)胞以及 CXCL10/CXCL11+ 骨髓和惡性細(xì)胞的空間組織病灶盼理，提供了一個正反饋回路的證據(jù)——T 細(xì)胞衍生的 IFNγ 誘導(dǎo) CXCR3 配體的表達(dá)以吸引更多的 T 細(xì)胞——可能是對于在腫瘤內(nèi)形成這些免疫細(xì)胞熱點至關(guān)重要。

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DISCUSSION

腫瘤是異質(zhì)的俄删，但腫瘤內(nèi)的免疫細(xì)胞可塑性較差宏怔，表現(xiàn)出的行為也更為有限。 在這里畴椰，我們確定了重復(fù)的臊诊、空間組織的細(xì)胞-細(xì)胞相互作用，這些相互作用有助于 MMRd 和 MMRp 腫瘤中協(xié)調(diào)的多細(xì)胞免疫反應(yīng)斜脂。
這里的研究表明抓艳，T 細(xì)胞組織在人類腫瘤內(nèi)的結(jié)構(gòu)化細(xì)胞鄰域中。 hubs的形成可能取決于正反饋回路帚戳，其中 T 細(xì)胞表達(dá)的 IFNG 驅(qū)動 CXCR3 趨化因子（作為 ISG 反應(yīng)的一部分）的誘導(dǎo)玷或，然后吸引更多的 T 細(xì)胞和其他細(xì)胞。 最近的研究表明片任，在小鼠檢查點抑制劑治療后偏友，誘導(dǎo)抗腫瘤 T 細(xì)胞反應(yīng)需要骨髓細(xì)胞中 CXCR3 趨化因子的表達(dá)來支持這一觀點。 此外蚂踊，幾項研究已將 CXCR3 趨化因子系統(tǒng)與 T 細(xì)胞進(jìn)入組織聯(lián)系起來约谈，包括黑色素瘤中的 CD8+ T 細(xì)胞募集、病毒感染和疫苗接種，其中局部 CXCL9 和 CXCL10 給藥將活化的 T 細(xì)胞募集到上皮組織中棱诱，即使沒有抗原泼橘。在human樣本中，與我們在 hub 6 程序中觀察到的基因重疊的 IFNγ 誘導(dǎo)特征與多種人類腫瘤類型中對 PD-1 阻斷的有利反應(yīng)相關(guān)迈勋。 此外炬灭，最近對 7 種腫瘤類型（包括 CRC）的meta-analysis發(fā)現(xiàn)，克隆性 TMB 和 CXCL9/CXCL13 表達(dá)是檢查點抑制劑反應(yīng)的最強(qiáng)預(yù)測因子靡菇。 與正反饋回路相反重归，腫瘤中持續(xù)的 ISG hub可能會驅(qū)動免疫抑制，因為負(fù)反饋會上調(diào)共抑制因子厦凤，如 PD1/PDL1鼻吮、Lag3/MHC-II、Tim3/LGALS9 和 IDO1较鼓。 事實上椎木，B16 黑色素瘤小鼠模型中的機(jī)械工作表明 IFNg 可以驅(qū)動多基因抗性程序。 正反饋還是負(fù)反饋在特定位置或時間占主導(dǎo)地位對于確定跨腫瘤和治療很重要博烂。
另一個重要問題是這些多細(xì)胞免疫形成是否與先前觀察到的組織結(jié)構(gòu)相似香椎。 TLSs 通常位于腫瘤浸潤邊緣以下，含有hub B 細(xì)胞禽篱，并且與高 T 細(xì)胞活性畜伐、良好的預(yù)后和對免疫治療的有效反應(yīng)有關(guān)。相比之下躺率，hub 6 被發(fā)現(xiàn)在腫瘤hub并且沒有生發(fā)hub玛界，并且相對于正常結(jié)腸，腫瘤耗盡了 B 細(xì)胞肥照。一些研究觀察到不太可能是 TLS 的聚合脚仔。在黑色素瘤免疫的早期研究中，IFNg舆绎、T 細(xì)胞和 PD-L1 的染色顯示它們在腫瘤中的空間接近性鲤脏。另一組觀察到干細(xì)胞樣 CD8+ T 細(xì)胞與 MHC II+ 類細(xì)胞的聚集，這與受影響個體中進(jìn)展較慢的腎癌有關(guān)吕朵。第三項研究表明猎醇，小鼠接種疫苗誘導(dǎo)了表達(dá) CXCL10 的 T 細(xì)胞和骨髓細(xì)胞的 IFNg/CXCR3 依賴性空間hub。這個hub在脈管系統(tǒng)周圍形成努溃，促進(jìn)循環(huán) T 細(xì)胞進(jìn)入組織硫嘶，為 T 細(xì)胞與其他細(xì)胞頻繁接觸以協(xié)調(diào)免疫反應(yīng)提供平臺。

另一個hub以炎癥 CAF梧税、單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞之間的炎癥正反饋回路為hub沦疾，位于管腔表面称近。結(jié)腸腫瘤的管腔表面有異常的上皮襯里，腫瘤塊突出到腸腔中哮塞，在那里它可以受到結(jié)腸內(nèi)容物的磨蝕性損傷刨秆。組織損傷可能導(dǎo)致微生物配體進(jìn)入或從死細(xì)胞中釋放免疫刺激配體，從而導(dǎo)致炎癥忆畅。炎癥反應(yīng)可能與可導(dǎo)致肉芽組織的傷口愈合反應(yīng)交織在一起衡未。有趣的是，最近對小鼠的一項研究表明家凯，損傷誘導(dǎo)的白細(xì)胞介素-1 (IL-1) 可以觸發(fā) GREM1+ 間充質(zhì)細(xì)胞中 RSPO3 的表達(dá)缓醋，這表明炎癥中樞與基質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄和空間重塑之間可能存在聯(lián)系我們在人類 CRC 中觀察到的隔室。事實上绊诲，我們在管腔表面觀察到擴(kuò)張的血管送粱，與先前在 CRC 中的研究一致，這些血管被表達(dá)基質(zhì)金屬蛋白酶 (MMP) 的高度炎癥成纖維細(xì)胞包圍驯镊，已知有助于腫瘤血管生成和組織重塑葫督。炎癥hub還具有 Treg 程序和包括 IL-17 在內(nèi)的 T 細(xì)胞程序。 IL-17 已被證明可促進(jìn)小鼠模型中的血管生成和腫瘤擴(kuò)張板惑，包括通過 CAF 激活和募集可支持腫瘤生長的粒細(xì)胞。因此偎快，炎癥hub的多個特征與抑制抗腫瘤反應(yīng)和促進(jìn)腫瘤生長有關(guān)冯乘。

本文的研究提供了豐富的細(xì)胞狀態(tài)、基因程序及其在腫瘤中的轉(zhuǎn)化（例如在基質(zhì)細(xì)胞中觀察到的深刻變化）的豐富數(shù)據(jù)集晒夹，涉及相對較大的 CRC 患者隊列裆馒。 基于基因程序的共變和隨后兩個免疫惡性hub的空間定位對幾個多細(xì)胞hub的預(yù)測將大量細(xì)胞狀態(tài)和程序組織成較少數(shù)量的細(xì)胞和過程協(xié)調(diào)網(wǎng)絡(luò)。 了解這些樞紐背后的分子機(jī)制并研究它們在治療時的時間和空間調(diào)節(jié)對于推進(jìn)癌癥治療至關(guān)重要丐怯。

Method（我們關(guān)注重點方法）

scRNA-seq pre-processing and quality control filtering（這個地方質(zhì)控部分更加精細(xì)）喷好。

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Selection of variable genes, dimensionality reduction and clustering（與我們常規(guī)做法也不太一樣，尤其降維用到了NMF）

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Cluster assignment by gradient boosting and filtering of potential doublets

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Classifying malignant cells by gradient boosting（腫瘤等級與層次读跷，腫瘤研究中非常重要）梗搅。

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Identification of gene expression programs by NMF（識別基因程序，這個之前分享過）

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Identification of shared gene programs in malignant epithelial cells（識別共享的基因程序）

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Calculating NMF transcriptional program activity（原理就是基因集打分）

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Testing for covarying NMF expression programs（共表達(dá)程序）

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Constructing a network of expression program similarity（構(gòu)建表達(dá)程序相似性網(wǎng)絡(luò)）

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Image analysis, neighborhood definition, and clustering（圖像方面的處理）

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生活很好效览，有你更好