DC?是“Dendritic Cells”的縮寫，中文全稱為“樹突狀細胞”惫确，因其成熟時伸出許多樹突樣或偽足樣突起而得名摹菠。DC 是由2011 年諾貝爾獎獲得者、加拿大籍科學家Ralph M. Steinman 于1973 年發(fā)現(xiàn)的较雕，是目前發(fā)現(xiàn)的功能最強的抗原遞呈細胞(Antigen Presenting Cells, APC)。已證實挚币，DC 是唯一能夠顯著刺激初始T 細胞(Na?ve T cells)增殖的APC亮蒋，而其它種類的APC(如單核巨噬細胞，B 細胞等)僅能刺激已活化的或記憶性的T 細胞妆毕，因此DC 是機體適應性T 細胞免疫應答的始動者慎玖，在腫瘤免疫中發(fā)揮著極其重要的作用。

? 雖然DC 存在于體內(nèi)多種組織中笛粘，但含量很少趁怔，無法滿足科學研究和臨床治療的需要，所以人們嘗試多種方法來體外培養(yǎng)和擴增DC薪前。對于人润努，最常用的方法是從人外周血單個核細胞(PBMC)誘導DC 的產(chǎn)生。而對于小鼠示括，最常見的方法是從骨髓細胞誘導產(chǎn)生DC铺浇，即骨髓來源的DC(Bone Marrow-Derived Dendritic Cells，BMDC)例诀。

本文主要介紹：

【經(jīng)典的BMDC 培養(yǎng)法】-Inaba 法(改良)?

【BMDC大量制備法】-Son 法

【BMDC 大量制備法】-Lutz 法

【注意事項】

【經(jīng)典的BMDC 培養(yǎng)法】-Inaba 法(改良)?

背景：

1. Inaba 法獲得的BMDC 數(shù)目為5-7 x 106 個/小鼠随抠；

2. Inaba 原法操作比較復雜裁着，需要將骨髓中的淋巴細胞等用抗體+補體法預先去除繁涂，后來的改良法均省卻了這個步驟，其實Inaba 后來自己也說這個步驟雖然可提高BMDC 的純度二驰，但不會對BMDC 的生成產(chǎn)生影響扔罪，可做可不做[10]；

3. Inaba 原法僅用GM-CSF 來誘導BMDC 的產(chǎn)生桶雀，雖然得到的BMDC 在混合淋巴細胞反應中有較強的刺激能力矿酵，但DC 的成熟度不及GM+IL-4 的聯(lián)合誘導唬复，所以后來的改良法中多用GM+IL-4 聯(lián)合誘導。

培養(yǎng)步驟：

1. 小鼠骨髓細胞的獲得

1.1 小鼠(6 - 10 周齡)頸椎脫臼法處死全肮，手術取出所有股骨(femurs)和脛骨(tibias)敞咧，并剪刀和鑷子將骨周圍的肌肉組織盡量去除干凈；

注：不要損傷到骨辜腺。

1.2 將骨移至超凈臺內(nèi)休建，并用盛有70%酒精的無菌培養(yǎng)皿浸泡2-5min，以消毒滅菌评疗，然后用無菌的PBS 洗2 次测砂；

1.3 將骨移入另一個盛有PBS 的新培養(yǎng)皿中，用剪刀剪去骨兩端百匆，再用注射器抽取PBS砌些，針頭分別從骨兩端插入骨髓腔，反復沖洗出骨髓至培養(yǎng)皿中加匈，直至

骨完全變白存璃；

1.4 收集骨髓懸液，用200 目尼龍網(wǎng)濾去小碎片和肌肉組織雕拼；

1.5 濾過液1200 rpm 離心5min有巧，棄上清；

1.6 加入2 ml 氯化銨紅細胞裂解液(1x)悲没，重懸細胞篮迎，室溫孵育3-5min，最長10min示姿；

氯化銨紅細胞裂解液的配制：

1. 先配制10x的貯存液甜橱，配法如下：

稱取82.9g NH4Cl，10.0gKHCO3和0.37g Na2EDTA栈戳，溶于1L的蒸餾水中岂傲，0.22μm濾膜過濾除菌，4oC儲存6個月子檀；

注：可根據(jù)需要配制適量的10x貯存液镊掖，其中各組分需成比例增減。

2. 臨用前褂痰，將10x貯存液用無菌蒸餾水1 : 9稀釋成1x工作液即可亩进。?注：因氯化銨紅細胞裂解液對骨髓細胞有一定的傷害作用，所以要盡量縮短溶血時間缩歪。

1.7 加入10 ml PBS 中和裂解液的作用归薛，然后1200 rpm 離心5min，棄上清;

1.8 PBS 洗1 次，然后用含10% FBS 的RPMI 1640 培養(yǎng)液重懸細胞主籍，至此已獲得小鼠骨髓細胞习贫。

2. BMDC 的誘導分化

2.1 步驟1 中獲得的小鼠骨髓細胞計數(shù)后用含10% FBS 的RPMI 1640 完全培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度為0.5-1 x 106/ml；

2.2 鋪至24 孔培養(yǎng)板內(nèi)千元，每孔1ml 細胞苫昌，同時加入重組小鼠GM-CSF (20ng/ml)和IL-4 (10ng/ml)，37℃幸海，5% CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)蜡歹，此為培養(yǎng)的第0 天；

注：1) 一般一只小鼠大約可收獲4-5 x 107個骨髓細胞涕烧，所以可以鋪至少40-50個24 孔板板孔月而。

? ? ? ? 2) GM-CSF 和IL-4 的使用濃度區(qū)間分別為20-50ng/ml 和10-40ng/ml。

2.3 每2 天輕輕搖晃培養(yǎng)板议纯，然后3/4 體積更換新鮮培養(yǎng)液父款，并補足細胞因子。

2.4 在第5 天和第8 天之間瞻凤，輕柔吹打培養(yǎng)液憨攒，收集懸浮細胞及巰松貼壁生長的細胞；

2.5 1200 rpm 離心5min阀参，棄上清肝集；

2.6 用含10% FBS 的RPMI 1640 完全培養(yǎng)液重懸細胞并計數(shù)，然后調(diào)整細胞濃度至1 x 106/ml蛛壳，并加入重組小鼠GM-CSF (20 ng/ml)和IL-4 (10ng/ml)杏瞻；

2.7 細胞鋪板至100 mm 培養(yǎng)皿(每皿最多10ml)或6 孔培養(yǎng)板(2m/孔)。

2.8 37℃衙荐，5% CO2 培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)1-2 天捞挥；

2.9 收集懸浮細胞，即為較成熟的BMDC忧吟。

3. BMDC 的完全成熟

注：步驟2 中獲得的BMDC 并非完全成熟的DC砌函，若想得到完成成熟的DC，還需LPS溜族，CD40L 或TNF-a 等的誘導讹俊。

3.1 步驟2.4 或2.9 中獲得的BMDC 以1200rpm 離心5min，棄上清煌抒；

3.2 用含重組小鼠GM-CSF (20 ng/ml)和IL-4 (10ng/ml)的RPMI 完全培養(yǎng)液重懸沉淀仍劈，計數(shù)后調(diào)整細胞濃度為1 x 106/ml；

3.3 加入24 孔培養(yǎng)板中摧玫，并加入成熟誘導劑耳奕，如TNF-α (250U/ml)绑青，LPS (1μg/ml)诬像、或CD40L(1μg/ml)等屋群；

3.4 37℃，5% CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 天坏挠；

3.5 收集懸浮細胞及疏松貼壁生長的細胞即為成熟樹突狀細胞芍躏。

【BMDC 大量制備法】-Son 法

背景：

1. 該法可在7 天內(nèi)獲得30-40 x 106 個DC/小鼠，是Inaba 經(jīng)典方法的7-10 倍降狠。DC經(jīng)14.5%甲泛葡胺(Metrizamide)梯度離心后对竣，純度(即CD11c+/I-Ab+細胞)可達85-95%。

2. 該法獲得的DC 的內(nèi)吞能力弱于Inaba 經(jīng)典方法榜配，但分泌的IL-12p70 量相似否纬；

3. 該法獲得的DC 在混合淋巴細胞反應中比Inaba 經(jīng)典方法呈現(xiàn)更強的刺激能力；

4. 該法獲得的DC 能引起更強的特異性T 細胞反應蛋褥；

5. 以上結果提示临燃，該法比經(jīng)典方法能獲得更多、更成熟的BMDC烙心。

培養(yǎng)步驟：

1. 小鼠骨髓細胞的獲得

見Inaba 法(改良)中的相應步驟膜廊。

2. BMDC 的大量制備

2.1 步驟1 中獲得的小鼠骨髓細胞計數(shù)后用含10% FBS 的RPMI 1640 完全培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度為2 x 105/ml；

2.2 鋪至6 孔培養(yǎng)板內(nèi)淫茵，每孔5ml 細胞爪瓜，同時加入重組小鼠GM-CSF (1000U/ml)和IL-4 (1000U/ml)，37℃匙瘪，5% CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)铆铆；

2.3 在培養(yǎng)的第4 天，向培養(yǎng)體系中補充重組小鼠GM-CSF (1000U/ml)和IL-4(1000U/ml)丹喻；

2.4 培養(yǎng)的第7 天收集DC算灸，用2-4ml RPMI 1640 完全培養(yǎng)液重懸，加至等體積的14.5%(w/v) 甲泛葡胺上驻啤，1200 x g 室溫離心20min菲驴；

注：此時的DC 為不完全成熟的BMDC，要想進一步成熟骑冗，請?zhí)敛襟E3赊瞬。

2.5 收集中間層，并用RPMI 1640 完全培養(yǎng)液洗3 次備用贼涩。

3. BMDC 的完全成熟

3.1 步驟 2.4 中收集的BMDC巧涧，重新鋪板，并向培養(yǎng)體系中加入重組小鼠GM-CSF(1000U/ml)和IL-4 (1000U/ml)遥倦，以及LPS (1-10μg/ml)

3.2 37℃谤绳，5% CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 天占锯，獲得成熟的BMDC。

【BMDC 大量制備法】-Lutz 法

背景：

1. Lutz 法與Son 法相似缩筛，均可大量制備BMDC消略，但與Son 法相比，Lutz 法更為廣泛地被采用瞎抛。

2. 該法可獲得更多的BMDC艺演，達1-3 x 108 個/小鼠，而且純度可達90-95%桐臊；

3. 該法比Son 法使用的細胞因子濃度低得多胎撤，僅為200U/ml，而且培養(yǎng)的第8 天到第10 天降為30-100U/ml断凶，這樣可以大幅節(jié)約試劑成本伤提；

4. 該法與Inaba 經(jīng)典方法和Son 法的最大不同是使用細菌培養(yǎng)皿(Petri dish)而非細胞培養(yǎng)板來培養(yǎng)骨髓細胞。Inaba 的解釋是細菌培養(yǎng)皿不容易使骨髓中的巨噬細胞貼壁认烁，從而抑制巨噬細胞的發(fā)育肿男，進而避免巨噬細胞對DC 成熟的抑制作用，這可能是該法能夠以較低鋪板密度獲得大量BMDC 的主要原因砚著。

5. 但該法的培養(yǎng)時間較長次伶，需要10-12 天，一方面是為了獲得更多的BMDC稽穆，另一方面冠王，大多數(shù)粒細胞和淋巴細胞很難存活這么長時間，因此可提高最終獲得的BMDC 的純度舌镶；

6. 該法僅用GM-CSF 進行誘導培養(yǎng)柱彻，得到的BMDC 中未成熟和成熟DC 均有，若要進一步提高成熟度餐胀，需用LPS 或TNF-α再誘導1-2 天哟楷，其中成熟DC 細胞的含量將達到50-70%。

培養(yǎng)步驟：

1. 小鼠骨髓細胞的獲得

見Inaba 法(改良)中的相應步驟否灾，注意省去溶血步驟卖擅。

2. BMDC 的大量制備

2.1 步驟1 中獲得的小鼠骨髓細胞計數(shù)后用含10% FBS 的RPMI 1640 完全培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度為2 x 105/ml；

2.2 鋪至100mm 細菌培養(yǎng)皿(Petri Dish)中墨技，每皿10ml 細胞惩阶，同時加入重組小鼠GM-CSF (200U/ml，對于PeproTech 的GM-CSF扣汪，相當于20ng/ml)断楷，37℃，5%CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)崭别；

注：此處使用的是細菌培養(yǎng)皿冬筒，而非細胞培養(yǎng)板恐锣。

2.3 第3 天時，向培養(yǎng)皿中再加入10ml 含20ng/ml 重組小鼠GM-CSF 的完全培養(yǎng)液舞痰；

2.4 第6 天和第8 天分別半量換液土榴，即收集舊培養(yǎng)液，離心后用含20ng/ml 重組小鼠GM-CSF 的完全培養(yǎng)液重懸細胞沉淀匀奏，然后再將細胞懸液放回原皿鞭衩；

2.5 第10 天時可收集細胞学搜，即為BMDC娃善。

3. BMDC 的完全成熟

3.1 培養(yǎng)第10 天的DC 用移液器輕輕吹打收集懸浮細胞，300 x g 室溫離心5min瑞佩；

3.2 棄上清聚磺，用10ml RPMI 1640 完全培養(yǎng)液重懸細胞沉淀，然后鋪于100 mm 細胞培養(yǎng)板炬丸；

3.3 加入重組小鼠GM-CSF(100U/ml 瘫寝， 相當于PeproTech 的10ng/ml) 和TNF-α (500U/ml)，或重組小鼠GM-CSF(100U/ml稠炬，相當于PeproTech 的10ng/ml)和LPS (1μg/ml)焕阿；

3.4 37℃，5% CO2 培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)1-2 天首启。

【BMDC 的鑒定】

1. 形態(tài)學觀察：BMDC 多數(shù)呈集落生長暮屡，細胞有多個樹突樣突起，成熟的BMDC 更加明顯毅桃；

2. 細胞表型分析：流式細胞術檢測DC 細胞表面CD11c褒纲，CD40，CD80钥飞，CD86莺掠，MHCII 類分子(I-A/I-E)等的表達，BMDC 高表達這些分子读宙，完全成熟的BMDC 中這些分子的表達會進一步提高彻秆。

3. 混合淋巴細胞反應(MLR)：BMDC 具有較強的刺激能力，且成熟度越高结闸，刺激能力越強唇兑。

【注意事項】

1. 小鼠品系和性別：

多數(shù)研究表明，所使用的小鼠品系與獲得BMDC 的數(shù)量和成熟度關系不大膀估，但也有研究表明C57BL/6 小鼠可能更好幔亥。

Lutz 表示從C57BL/10，DBA/2察纯，C3H/J 和129 等小鼠品系均可獲得足夠數(shù)量和純度的BMDC帕棉，但Lutz 在其實驗中更傾向于使用C57BL/6针肥，ICR 和BALB/c 小鼠，且發(fā)現(xiàn)C57BL/6 小鼠的BMDC 產(chǎn)量最高香伴，而且ICR 小鼠和C57BL/6 小鼠的BMDC 對LPS的成熟誘導敏感度高于BALB/c 小鼠慰枕。

關于小鼠的性別，Inaba 認為雄性小鼠更好些即纲，因為他們的骨骼更大具帮，從而可以獲得更多的前體細胞，但多數(shù)學者更傾向于使用雌性小鼠低斋。因此蜂厅，目前培養(yǎng)BMDC 用的比較多的小鼠是雌性或雄性C57BL/6 小鼠。

2. 單獨使用GM-CSF 還是聯(lián)合使用IL-4?

Inaba 經(jīng)典法和Lutz 大量制備法中均僅用GM-CSF 即可誘導出相當數(shù)量的BMDC膊畴，而且也在混合淋巴細胞反應中表現(xiàn)出較強的刺激作用掘猿，但其實這些BMDC 的成熟度并不足夠高。

研究顯示唇跨，GM-CSF+IL-4 聯(lián)合誘導比GM-CSF 單獨誘導產(chǎn)生的BMDC 表達更高的MHC II 類分子和共刺激分子CD80 和CD86 等稠通，提示前者具有更強的抗原遞呈能力，而且前者在混合淋巴細胞反應中表現(xiàn)出更有效的刺激能力买猖。在動物實驗中也發(fā)現(xiàn)改橘，GM-CSF+IL-4 聯(lián)合誘導的BMDC 可產(chǎn)生保護性抗腫瘤免疫反應，而GM-CSF 單獨誘導的BMDC 的保護性較弱玉控，這些都說明GM-CSF+IL-4 聯(lián)合誘導的BMDC 的成熟度高于GM-CSF 單獨誘導的BMDC飞主。

德國明斯特大學(University of Munster)的Labeur 研究也表明，單獨用GM-CSF 誘導的BMDC 為未成熟DC奸远，GM-CSF 和IL-4 聯(lián)合誘導產(chǎn)生的BMDC 的成熟度居中既棺，添加CD40L 或LPS 可進一步誘導BMDC 完全成熟。

因此筆者認為懒叛，要想獲得功能更好的BMDC丸冕，最好用GM-CSF 和IL-4 聯(lián)合誘導骨髓細胞。而且薛窥，如果能在Inaba 經(jīng)典法和Lutz 大量制備法中添加IL-4胖烛，應該會獲得更加成熟、有效的BMDC诅迷。

3. 成熟誘導劑的選擇

LPS佩番，CD40L 和TNF-α無論對人DC 還是小鼠DC 均是常用、有效的成熟誘導劑罢杉，那么應該選擇哪個呢趟畏？

TNF-a 誘導DC 的成熟能力在三者中最弱[7,8]。LPS 和CD40L 均是DC 體外完全成熟的強誘導劑滩租，兩者誘導DC 的成熟度相似赋秀，但誘導產(chǎn)生的細胞因子譜有差異利朵。CD40L誘導成熟的BMDC 在體內(nèi)顯示出最強的免疫調(diào)節(jié)能力，包括保護性和治療性腫瘤免疫反應的產(chǎn)生猎莲。

用LPS 刺激DC 完全成熟所用的濃度一般為1-10μg/ml绍弟，但其實0.1 μg/ml 已經(jīng)有非常強的作用，但保險起見著洼，一般選用1μg/ml樟遣。

對于CD40L 需要注意的是，CD40L 分子屬于TNF 配體家族身笤，該家族的特點是在形成三聚體后才能發(fā)揮作用豹悬。所以最好能用重組的CD40L 三聚體蛋白來刺激DC，這樣會有很好的效果展鸡。如果用CD40L 單體來刺激DC屿衅，多數(shù)情況下成熟度并不是很高埃难。

4. 培養(yǎng)方法的選擇

【BMDC 相關試劑推薦】

注：用于DC 鑒定的表面標志物的表達在流式圖上均呈現(xiàn)單個峰莹弊，且多數(shù)情況下不能與陰性峰完全區(qū)分開來。為避免多色分析時補償調(diào)節(jié)不好導致結果的不準確性涡尘，建議最好用單標忍弛，最多用雙標來做DC 表面標志的分析，而且必須使用同型對照考抄，而非空白細胞對照來排除背景染色细疚。

因本文涉及技術內(nèi)容較多，如大家對實驗步驟有疑問川梅，可查看原文出處：http://www.nbs-bio.com/xwzx_936.html疯兼。

注：本文僅供參考