Single-cell transcriptomic analysis identifies an immune-prone population in erythroid precursors during human ontogenesis
摘要：
非免疫細(xì)胞在調(diào)節(jié)免疫功能中發(fā)揮著重要的作用映之，但是紅細(xì)胞在人類早期發(fā)育期間的免疫調(diào)節(jié)功能仍舊未知。該研究對卵黃囊，胎兒肝臟毁渗，早產(chǎn)嬰兒的臍帶血始花，正常臍帶血和成人骨髓的早期紅細(xì)胞（有核）進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序脊髓，鑒定出不同子集和不同分化軌跡的早期紅細(xì)胞集峦。但是人類胚胎干細(xì)胞的體外培養(yǎng)中卻沒有檢測到具有免疫功能的紅細(xì)胞仅胞。具有免疫功能的紅細(xì)胞比起其他經(jīng)典的紅細(xì)胞前體而言押赊，具有紅細(xì)胞和免疫調(diào)節(jié)的雙重網(wǎng)絡(luò)饺藤，展現(xiàn)出免疫調(diào)節(jié)功能并且與免疫細(xì)胞進(jìn)行互作。
介紹
人類紅細(xì)胞發(fā)育過程：卵黃囊形成的3-4周即生成原始紅細(xì)胞（表達(dá)胚胎血紅蛋白流礁，并且在不剔除的情況下進(jìn)入循環(huán)）→胎兒5-6周其肝臟就會成為紅細(xì)胞成熟位點(diǎn)→胎兒10-11周其成熟位點(diǎn)會由肝臟轉(zhuǎn)換到骨髓涕俗。（血紅蛋白也會在這之中發(fā)生轉(zhuǎn)變）
除運(yùn)輸氧氣之外，有核的CD71+紅細(xì)胞參與免疫反應(yīng)
材料方法
YS（yolk sac）:卵黃囊
FL（fetal liver）:胎兒肝臟
UCB（umbilical cord blood）:臍帶血
紅細(xì)胞祖細(xì)胞：early: CD34+CD36?CD123?GYPA?; later, CD34?CD36+CD123?GYPA? 神帅；
紅細(xì)胞前體：GYPAloCD71+ and GYPAhiCD71+
質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)：基因表達(dá)在三個細(xì)胞以上再姑，基因表達(dá)數(shù)大于500，線粒體小于10%找御。
結(jié)果
1. 鑒定具有免疫傾向紅細(xì)胞的亞群
首先根據(jù)血紅蛋白的表達(dá)以及氣體傳輸和血紅素生物合成過程（GO）正相關(guān)水平來定義不同樣本來源的紅細(xì)胞前體數(shù)據(jù)（比如元镀，HBE1在卵黃囊中绍填，HBG1/HBG2在胎兒肝臟中，成年人臍帶血共表達(dá)HBG1/HBG2和HBB）栖疑。然后在這些處于不同階段的血紅蛋白亞群中提取GYPA+細(xì)胞（主要是紅細(xì)胞前體讨永，包括：紅系祖細(xì)胞，嗜堿性紅細(xì)胞蔽挠，多染性紅細(xì)胞住闯，嗜酸性紅細(xì)胞）進(jìn)行進(jìn)一步的分析。
GYPA+細(xì)胞被分為四個階段：
C1：信使RNA分解代謝過程澳淑，翻譯啟動和RNA剪接（RPL23, EIF3E and SRSF7）比原；
C2：激活的細(xì)胞循環(huán)，核分裂和有絲分裂細(xì)胞周期過程的顯著富集（MKI67, CDK1 and CDC27）杠巡；
C3：比起C1和C2相對成熟量窘；
C4：富集到了免疫活性相關(guān)的術(shù)語。
C4 標(biāo)記基因包括SRGN（一種參與炎癥反應(yīng)的肥大細(xì)胞和中性粒細(xì)胞分泌顆粒的成分）氢拥，NFKB1A（編碼NF-KB）抑制劑的一個成員蚌铜，控制NF-KB介導(dǎo)的免疫和炎癥活動。
紅系細(xì)胞從C1到C3逐漸成熟嫩海，與成熟度（GO：0043249）評分一致冬殃。
將有核紅細(xì)胞分為經(jīng)典的紅細(xì)胞簇（C1-C3）和免疫紅細(xì)胞簇（C4）
2. 不同階段（YS、FL叁怪、UCB）紅細(xì)胞前體的獨(dú)特特征
C1：
YS：膽固醇的生物合成和有氧糖酵解等過程审葬；
FL：強(qiáng)烈的蛋白質(zhì)合成信號；
UCB：更豐富的珠蛋白基因表達(dá)奕谭。
C2：活躍的細(xì)胞分裂特征
YS：
FL：表達(dá)量最豐富
UCB：
C3
YS：金屬離子穩(wěn)態(tài)相關(guān)的基因的高表達(dá)
FL：
UCB：
YS紅細(xì)胞可能作為支持胚胎發(fā)育的關(guān)鍵轉(zhuǎn)運(yùn)體或作為確保向胚胎提供精確供應(yīng)金屬的庫存
3.人類胚胎干細(xì)胞衍生的紅細(xì)胞缺乏免疫傾向的細(xì)胞
方法：通過IL-3涣觉、SCF（干細(xì)胞因子）、促紅細(xì)胞生成素（Epo）,地塞米松誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞向紅細(xì)胞分化血柳。在第14天官册，吉姆薩染色、球蛋白合成的苯甲胺染色指示难捌，GYPA + CD71 +流式來評估紅系細(xì)胞膝宁。并且收集第4.11,16天的紅細(xì)胞用于單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序。
第4天分化：hESC C1 （與核糖體生物合成有關(guān)）
第11天分化：hESC C2
第16天分化：hESC C3 （氧氣傳輸和氣體傳輸）
體外分化的細(xì)胞中并未發(fā)現(xiàn)C4免疫類的紅細(xì)胞根吁，說明體外培養(yǎng)的微環(huán)境不利于具有免疫特性的類紅細(xì)胞的分化昆汹。
相關(guān)性分析表明，hESC衍生的類紅細(xì)胞與YS和FL的類紅細(xì)胞相關(guān)性更密切婴栽。
其中满粗，hESC中的C1和C3比起YS中的C1和C3表現(xiàn)出更高的細(xì)胞凋亡、線粒體自噬和鐵死亡愚争。相反映皆，YS中的C1和C3表現(xiàn)則表現(xiàn)出基本的生物學(xué)過程（蛋白質(zhì)折疊挤聘、RNA分解代謝過程和線粒體翻譯延伸）
hESC衍生類紅細(xì)胞的過程中會有缺陷，導(dǎo)致未能出現(xiàn)免疫特征
4. 免疫紅細(xì)胞發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能
CD71+ 有核紅細(xì)胞通過細(xì)胞相互作用或細(xì)胞因子分泌捅彻。
C4高表達(dá)的基因包括：VSIR（encode VISTA）, TGFB1, IL1B, IL7, TNFSF10, 但是與免疫受體活性相關(guān)基因在C4細(xì)胞中表達(dá)普遍較低组去，表明他們產(chǎn)生免疫信號并傳遞給其它細(xì)胞。
單細(xì)胞調(diào)控網(wǎng)絡(luò)推理和聚類（SCENIC）
轉(zhuǎn)錄因子：GATA1由所有簇共享步淹，MYC和MYB在紅細(xì)胞成熟過程中被下調(diào)从隆，而KLF1和TAL1依次被激活以促進(jìn)紅細(xì)胞終末成熟。此外缭裆，C4細(xì)胞高度富集 GATA2键闺，MEF2C，SPI1澈驼、FOS和JUN等調(diào)節(jié)子辛燥。這些調(diào)節(jié)子與趨化因子信號通路、自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性和白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移相關(guān)缝其。
CD63在C4中高表達(dá)挎塌，因此被認(rèn)為可能是C4細(xì)胞的標(biāo)記，因此分選FL中的GYPA+CD71+CD63+進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序内边。
分選UCB-GYPA+CD71+CD63+與PBMC共培養(yǎng)榴都，并用LPS刺激。定量PCR顯示漠其，CD63+細(xì)胞比CD63-細(xì)胞共培養(yǎng)的炎癥相關(guān)基因表達(dá)更高嘴高，另外，在LPS處理后辉懒，CD63+細(xì)胞比CD63-細(xì)胞更高的表達(dá)IL-8阳惹，IL-6谍失，TNF,MIP-1α眶俩，MIP-1β。在CD71+TO+CD63+中也發(fā)現(xiàn)了有限的免疫調(diào)節(jié)能力快鱼。
5. 免疫紅細(xì)胞存在于早產(chǎn)兒的臍帶血中
為檢測早產(chǎn)兒臍帶血（PT-UCB）中是否存在免疫紅細(xì)胞颠印，分別取32,33,35 WPC(我猜測是懷孕天數(shù))的PT-UCB進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序。
結(jié)果：免疫特征基因（TGFB1抹竹、VSIR和MIF）以及免疫調(diào)節(jié)基因（GATA线罕、SPI1、JUN窃判、FOS）都出現(xiàn)在PT-UCB當(dāng)中钞楼。
提出問題：早產(chǎn)新生兒為什么比足月新生兒更容易受到感染？
原因：CXCL8袄琳，S100A9询件、MGST3燃乍、ANXA1、TNFAIP3在后者中有顯著的富集宛琅。
6. 免疫紅細(xì)胞在成人骨髓中持續(xù)存在
從七個健康個體中分離出GYPA+ ITGA4+ SLC4A1+/- 紅細(xì)胞前體進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序刻蟹。
C4中高表達(dá)的基因優(yōu)先與調(diào)節(jié)功能有關(guān)（白細(xì)胞黏附、淋巴細(xì)胞活化或吞噬作用）嘿辟，另外還包括關(guān)鍵免疫功能基因（TGFB1舆瘪、VSIR），調(diào)節(jié)中樞基因（FOS红伦、JUN）和表面標(biāo)記(CD63)的高表達(dá)英古。
目的：為確定成人骨髓中免疫紅細(xì)胞的功能
方法：將成人 BM 分離的 GYPA+CD71+ CD63+和 GYPA+ CD71+ CD63-細(xì)胞與 CD11b+ PBMC（粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞）共培養(yǎng)色建，CD63+刺激的CD11b+細(xì)胞中的TNF表達(dá)增強(qiáng)哺呜。
骨髓紅細(xì)胞也有免疫調(diào)節(jié)功能，例如促進(jìn)促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生的能力箕戳。
結(jié)果顯示：YS某残、FL和新生兒UCB階段的免疫紅細(xì)胞具有更大的相似性，相反陵吸，成年期是更為復(fù)雜的存在玻墅，總的來說，具有免疫調(diào)節(jié)功能的免疫前提出現(xiàn)在YS中并持續(xù)存在于成人BM中壮虫。
7. 免疫紅細(xì)胞與免疫細(xì)胞的作用
CellPhoneDB 揭示潛在的受體-配體澳厢，對CD71+紅系細(xì)胞和其他免疫細(xì)胞類型之間的相互作用。
提取YS免疫細(xì)胞中的巨噬細(xì)胞（之前的數(shù)據(jù)）囚似，另外將GYPA-的FL和UCB細(xì)胞的免疫細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序剩拢，定義巨噬細(xì)胞、NK/T細(xì)胞饶唤、B細(xì)胞徐伐。最后BM的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)來源于已發(fā)表的文獻(xiàn)。
結(jié)果：在所有發(fā)育階段募狂，免疫紅細(xì)胞和免疫細(xì)胞之間比經(jīng)典紅細(xì)胞與免疫細(xì)胞之間具有更強(qiáng)烈的富集和信號強(qiáng)度办素。在FL、UCB和成人的BM中免疫紅細(xì)胞可以和多種免疫細(xì)胞祸穷，但是YS階段中的紅細(xì)胞只能和巨噬細(xì)胞進(jìn)行互作性穿。
紅細(xì)胞與巨噬細(xì)胞之間的作用是巨噬細(xì)胞清楚衰老或受損的紅細(xì)胞形成紅細(xì)胞島（erythroblastic island，EBI）雷滚，其中中央巨噬細(xì)胞被FL和BM中處于不同分化階段的成紅細(xì)胞包圍
EBI內(nèi)經(jīng)典的紅細(xì)胞和巨噬細(xì)胞之間的相互作用主要是通過整合素（ITGAL/ITGB2 (α1β2) 復(fù)合物）需曾、ITGA4/ITGB1 (α4β1)-VCAM1 、ICAM4 或 ICAM2以及EPHB4-EFNB 家族成員。類似的呆万，免疫紅細(xì)胞中也存在這樣的作用刻蚯。另外，TFRC_TNFSF13B桑嘶、PGRMC2_CCL4L2 和 CD55_ADGRE5 可能是紅細(xì)胞與巨噬細(xì)胞相互作用的潛在的候選者炊汹。
除巨噬細(xì)胞外，免疫紅細(xì)胞與其它免疫細(xì)胞相互作用時.......（這里通過一系列實(shí)驗(yàn)手段證明免疫類紅細(xì)胞與各種免疫細(xì)胞之間表現(xiàn)出廣泛逃顶、活躍的相互作用讨便，鞏固了它們的免疫調(diào)節(jié)功能。）
結(jié)論
- 小鼠有核紅細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)能力在出生后6-9天達(dá)到峰值以政，隨后逐漸下降至第21-28天霸褒。然而人類有核紅細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)能力出現(xiàn)在YS階段并能夠一直維持到成人BM階段。另外盈蛮，該研究進(jìn)一步指出废菱，有核紅細(xì)胞有免疫調(diào)節(jié)亞群而不是整個紅細(xì)胞前體群，另外抖誉，將CD63認(rèn)為是該亞群的可靠標(biāo)記殊轴，分選出CD63+有核細(xì)胞，進(jìn)行功能驗(yàn)證袒炉，通過細(xì)胞間通訊分析細(xì)胞間相互作用旁理。
- 免疫紅細(xì)胞兩個轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)程序的激活：
①以GATA1、MYC和MYB調(diào)節(jié)子為調(diào)節(jié)中心我磁，以確保正常紅細(xì)胞的分化孽文。
②依賴GATA2，F(xiàn)OS和JUN調(diào)節(jié)子來指導(dǎo)免疫調(diào)節(jié)活性
