鑒于小腸淋巴管在營養(yǎng)吸收中的關(guān)鍵功能掏导，研究considered that lymphatic endothelial cell proximity to the crypt base might be merely a necessary component of their path from the lacteals to the collecting vessels which flow into mesenteric lymph nodes and ultimately deliver nutrients into the systemic circulation through the thoracic duct. 如果小腸中的淋巴：SC 接近只是乳酸聚集的結(jié)果激挪，那么不會期望在大腸中觀察到這種情況，因?yàn)榇竽c的淋巴血管系統(tǒng)沒有乳酸周荐，并且在營養(yǎng)吸收中起著名義上的作用辐脖。

結(jié)腸淋巴管饲宛，即大腸淋巴管，已知在腸道免疫監(jiān)視和調(diào)節(jié)中具有重要作用嗜价，但毛細(xì)血管網(wǎng)絡(luò)的結(jié)構(gòu)尚未完全表征艇抠。 有趣的是幕庐，基于隱窩的 LGR5+ SCs 與整個(gè)腸道的毛細(xì)淋巴管有關(guān)。 雖然結(jié)腸 ISC 生態(tài)位缺乏Paneth細(xì)胞家淤，但大腸中的大多數(shù) LGR5+ 隱窩至少部分位于毛細(xì)淋巴管上方异剥，這讓人想起我們在小腸中觀察到的情況。

超微結(jié)構(gòu)分析顯示絮重，大腸中的 ISC 和毛細(xì)淋巴管之間存在類似的密切關(guān)系冤寿。 值得注意的是，淋巴-ISC 關(guān)聯(lián)在人類中也是保守的绿鸣，在大腸活檢標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)了與隱窩上皮細(xì)胞相關(guān)的淋巴毛細(xì)血管疚沐。當(dāng)之前對毛囊淋巴毛細(xì)血管網(wǎng)絡(luò)的發(fā)現(xiàn)結(jié)合起來時(shí)，這些數(shù)據(jù)表明潮模，無論干細(xì)胞是靜止的（毛囊）還是快速循環(huán)的（大腸和小腸）亮蛔，毛細(xì)淋巴管都可以與上皮干細(xì)胞niche形成錯(cuò)綜復(fù)雜的關(guān)聯(lián)。 這些新發(fā)現(xiàn)提出了一個(gè)問題擎厢，即這種近距離接觸是否有共同目的以及淋巴管在組織維持中的作用究流。 因此，研究試圖定義和描述毛細(xì)淋巴管對 ISC 行為的表型影響动遭。

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Lymphatic endothelial cells instruct intestinal organoid development and maturation（淋巴內(nèi)皮細(xì)胞有助于腸道類器官的發(fā)育和成熟）

為了測試淋巴內(nèi)皮細(xì)胞是否直接向腸上皮發(fā)出信號芬探，利用培養(yǎng)小腸上皮干細(xì)胞的能力來生成 3D“小腸”類器官，并建立了一個(gè)與原代小鼠 LEC 共培養(yǎng)類器官的系統(tǒng)厘惦。該系統(tǒng)概括了在體內(nèi)觀察到的淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞和小腸干細(xì)胞之間的聯(lián)系偷仿，能夠區(qū)分由于直接的細(xì)胞間通訊而產(chǎn)生的效應(yīng)和由在該共培養(yǎng)系統(tǒng)中不存在的淋巴引流特性引起的效應(yīng)。在共培養(yǎng)條件下（50% 常規(guī)類器官培養(yǎng)基：50% LEC 培養(yǎng)基）宵蕉，LEC 保持關(guān)鍵淋巴轉(zhuǎn)錄因子和蛋白質(zhì)標(biāo)志物（PROX1酝静、CD31 和 LYVE1）的表達(dá)，以及在該培養(yǎng)基中在 Matrigel 上培養(yǎng)時(shí)形成內(nèi)皮管的能力羡玛。同樣别智，在共培養(yǎng)基中單獨(dú)生長的類器官也保持了關(guān)鍵特征，包括形成隱窩結(jié)構(gòu)域的能力稼稿。

與單獨(dú)培養(yǎng)的隱窩相比薄榛，與淋巴內(nèi)皮管一起培養(yǎng)的 ISC 或分離的隱窩產(chǎn)生的類器官具有顯著的形態(tài)變化。 在存在 LEC 的情況下形成的類器官尺寸更小让歼，形狀更圓形敞恋，并且包含更少的隱窩結(jié)構(gòu)域，表明成熟受損是越。 然而耳舅，重要的是，這些類器官展示了產(chǎn)生溶菌酶的Paneth細(xì)胞，這是小腸隱窩的關(guān)鍵成分浦徊，對 ISC 維持至關(guān)重要馏予。 這一點(diǎn)，以及在存在 LEC 的情況下類器官形成的維持能力盔性，表明毛細(xì)淋巴管本身并沒有損害類器官的形成霞丧。 相反，LEC 的存在似乎阻止了它們的成熟冕香。 當(dāng) ISCs 與血管內(nèi)皮細(xì)胞 (BECs) 共培養(yǎng)時(shí)蛹尝，沒有觀察到這種效應(yīng)，強(qiáng)調(diào)了淋巴管內(nèi)皮在抑制隱窩分化方面的特異性悉尾。

為了進(jìn)一步了解這些效應(yīng)的性質(zhì)突那，對來自 LEC 共培養(yǎng)的類器官進(jìn)行了單細(xì)胞 RNA 測序 (scRNA-seq)，并將它們與從在相同培養(yǎng)基中生長的標(biāo)準(zhǔn)類器官培養(yǎng)物中獲得的 scRNA-seq profile進(jìn)行了比較构眯。這里匯集了兩種培養(yǎng)條件下的細(xì)胞并進(jìn)行了聚類愕难。細(xì)胞類型獨(dú)立于培養(yǎng)條件聚集并分成 11 個(gè)clusters。明確指定了兩個(gè)表達(dá) Goblet/Paneth 細(xì)胞（例如 Lyz1惫霸、Muc2）和腸內(nèi)分泌（例如 Chga猫缭、Chgb）標(biāo)記物的clusters。此外壹店，表達(dá)干細(xì)胞/祖細(xì)胞和轉(zhuǎn)運(yùn)擴(kuò)增 (TA) 細(xì)胞（例如 Olfm4猜丹、Ascl2、Tubb5硅卢、Top2a）的標(biāo)記的四個(gè)clusters被標(biāo)記為干細(xì)胞/TA射窒。最后，五個(gè)clusters表達(dá)腸細(xì)胞標(biāo)志物将塑，如Alpi和Fabp1轮洋，并與沿著絨毛帶位置軸的腸細(xì)胞分化程序相關(guān)；將它們相應(yīng)地標(biāo)記為bottom-like 1抬旺、bottom-like 2、mid-like 1祥楣、mid-like 2开财、top-like。

在存在 LEC 的情況下生長的類器官顯示出顯著較少的終末分化腸細(xì)胞误褪，盡管干細(xì)胞和祖細(xì)胞的比例相似责鳍。 這些發(fā)現(xiàn)也與基于最近鄰圖的差異豐度分析 (Milo) 一致，這提供了更精細(xì)的分辨率兽间。 該分析產(chǎn)生了進(jìn)一步的見解历葛，揭示了在 LEC 存在下生長的類器官顯示出干/祖細(xì)胞clusters內(nèi)細(xì)胞分布的改變和腸上皮祖細(xì)胞的傾斜，而犧牲了完全（終末）分化的腸上皮細(xì)胞。

LEC 共培養(yǎng)的類器官在與活躍循環(huán) (Mki67+) 細(xì)胞相對應(yīng)的細(xì)胞部分中的代表性也不足恤溶。 與活躍循環(huán)的腸道干/祖細(xì)胞數(shù)量減少一致乓诽，在 LEC 存在下生長的類器官中，10 分鐘脈沖期間 5-乙炔基-20-脫氧尿苷 (EdU) 的摻入減少咒程。 與腸細(xì)胞終末分化阻滯一致的是成熟腸細(xì)胞標(biāo)志物醛縮酶 B (ALDOB) 的免疫熒光減弱鸠天。 此外，在轉(zhuǎn)錄組水平上帐姻，與定義top區(qū)域的基因相比稠集，來自共培養(yǎng)條件的腸細(xì)胞上調(diào)了定義底部區(qū)域的基因。

為了更好地理解兩種條件之間成熟度的差異饥瓷，對分化軌跡進(jìn)行了計(jì)算建模并量化了可能的分化路徑剥纷。 從對照類器官中獲得的腸細(xì)胞在最終分化的頂部區(qū)域內(nèi)更頻繁，而從 LEC 共培養(yǎng)的類器官中獲得的腸細(xì)胞更均勻地分布在中間狀態(tài)呢铆。 總之晦鞋，這些數(shù)據(jù)支持一個(gè)模型，即隱窩底部的淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞維持干細(xì)胞和祖細(xì)胞刺洒，但限制它們分化為成熟的腸上皮細(xì)胞鳖宾。

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The lymphatic secretome maintains ISCs but restricts their terminal differentiation(淋巴分泌組維持 ISC，但限制其終末分化)

如果正如迄今為止的研究預(yù)測的那樣逆航，隱窩淋巴管通過支持維持腸干細(xì)胞和祖細(xì)胞而不是快速循環(huán)和終末分化的細(xì)胞來發(fā)揮作用鼎文，那么淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞應(yīng)該提高從初級類器官分離的單個(gè)細(xì)胞形成二級類器官的效率。 此外因俐，如果隱窩淋巴管也能防止 ISC 終末分化為成熟的腸細(xì)胞拇惋，那么與在相同培養(yǎng)基中但沒有 LEC 的情況下形成的二級有機(jī)體相比，該測定中出現(xiàn)的有機(jī)體的大小應(yīng)該減少抹剩。

為了檢驗(yàn)這些假設(shè)撑帖，首先評估了 LEC 支持類器官生長的能力。 事實(shí)上澳眷，LEC 的存在使單個(gè) ISC 的類器官形成效率增加了一倍以上胡嘿。 與隱窩衍生的類器官類似，在 LEC 存在下生長的單細(xì)胞衍生類器官更小钳踊，突起更少衷敌。 正如預(yù)測的那樣，LEC 共培養(yǎng)的類器官也表現(xiàn)出降低的 ALDOB 免疫熒光拓瞪，這與腸細(xì)胞生成受阻一致缴罗。

并非所有類器官都與 LEC 接觸，但大多數(shù)類器官仍顯示出尺寸減小和差異化祭埂。 同樣面氓，許多但不是所有的隱窩在體內(nèi)顯示出與毛細(xì)淋巴管密切相關(guān)，即使它們這樣做了，LGR5+ 干細(xì)胞和 LEC 之間的直接細(xì)胞間接觸似乎也非常罕見舌界。 因此掘譬，推斷 LEC 分泌的（淋巴管分泌）因子可能是在共培養(yǎng)類器官中觀察到的表型的原因。 為了驗(yàn)證這一假設(shè)禀横，收集了 LEC 條件培養(yǎng)基屁药，并檢查了它在沒有 LEC 本身的情況下影響類器官起始和成熟的潛力。 LEC 條件培養(yǎng)基概括了 LEC 共培養(yǎng)的類器官的表型柏锄，顯示出較小的類器官和較少分化的后代酿箭。

接下來，從在 LEC 條件培養(yǎng)基中生長的類器官中分離出單個(gè)細(xì)胞趾娃，然后將它們置于沒有 LEC 的正常類器官培養(yǎng)條件下缭嫡，出現(xiàn)了兩個(gè)重要的發(fā)現(xiàn)。 首先抬闷，LEC 條件培養(yǎng)基在這些二次試驗(yàn)中提高了 LEC 條件 ISC 祖細(xì)胞的類器官群落形成效率妇蛀，從而強(qiáng)調(diào)了淋巴管分泌因子對 ISC 維持的有效和直接影響。 其次笤成，一旦淋巴管分泌因子不再存在评架，由這些預(yù)處理的 ISC 形成的類器官就會正常分化，這表明 LEC 損害 ISC 分化的作用是可逆的炕泳，并且取決于持續(xù)暴露于這些淋巴管分泌因子纵诞。 在組織的背景下，這種影響應(yīng)該主要表現(xiàn)在隱窩生態(tài)位內(nèi)培遵，干細(xì)胞和淋巴管所在的地方以及它們的分化受到抑制的地方浙芙。

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The in vivo spatial map of cell types in the small and large intestines

接下來轉(zhuǎn)向解決隱窩淋巴管分泌因子的性質(zhì)，并揭示它們?nèi)绾斡绊戵w內(nèi)腸道干細(xì)胞籽腕。 由于乳淋巴管可能產(chǎn)生與位于隱窩底部的淋巴管完全不同的一組因子嗡呼，因此有意義的結(jié)果需要空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法。 因此皇耗，試圖通過計(jì)算整合 scRNA-seq 和空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)南窗，沿隱窩絨毛軸（小腸）和隱窩軸（大腸）的空間維度繪制腸細(xì)胞類型及其基因表達(dá)譜。 這種方法能夠（1）識別由 LEC 高度和/或獨(dú)特表達(dá)的基因郎楼，以及（2）將 LEC 基因表達(dá)模式與腸上皮內(nèi)淋巴管和 ISC（或其他潛在接收細(xì)胞）之間的空間接近度相關(guān)聯(lián)矾瘾。

這里收集了來自小腸和大腸的腸細(xì)胞的綜合 scRNA-seq 譜，涵蓋了腸道內(nèi)免疫箭启、基質(zhì)和上皮譜系的主要細(xì)胞類型，同時(shí)含有了稀有的 LEC 和 LGR5+ ISC populations蛉迹。 小腸和大腸的免疫細(xì)胞各自包含主要的淋巴（T細(xì)胞傅寡、B細(xì)胞、漿細(xì)胞和生發(fā)中心B細(xì)胞）和骨髓（巨噬細(xì)胞、樹突細(xì)胞荐操、單核細(xì)胞和粒細(xì)胞）細(xì)胞群芜抒。 類似地，基質(zhì)細(xì)胞根據(jù)膠質(zhì)細(xì)胞（例如 S100b托启、Gfap）宅倒、血液內(nèi)皮細(xì)胞（例如 Cd31、Cdh5）和淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞（例如 Lyve1屯耸、Prox1）拐迁、肌成纖維細(xì)胞（例如 Acta2、Myh11）和成纖維細(xì)胞（例如 Col6a2疗绣、Dpt）標(biāo)記基因聚集 . 聚類進(jìn)一步揭示了間充質(zhì)細(xì)胞群的異質(zhì)性线召，如由滋養(yǎng)細(xì)胞（例如 Cd81）、遠(yuǎn)程細(xì)胞（例如 Foxl1）和隱窩基質(zhì)細(xì)胞（例如 Cd34多矮、Pdpn）的標(biāo)記所定義的缓淹。最后，小腸和大腸的上皮細(xì)胞反映了所有主要的分化譜系塔逃，如腸上皮細(xì)胞（例如 Alpi讯壶、Fabp1）、杯狀細(xì)胞（例如 Muc2）湾盗、腸內(nèi)分泌細(xì)胞（例如 Chga伏蚊、Chgb）、簇狀細(xì)胞（例如Dclk1）和Paneth細(xì)胞（例如 Lyz1淹仑、Defa17）丙挽，后者在大腸中不存在。杯狀細(xì)胞表現(xiàn)出高度的異質(zhì)性匀借，占大腸上皮細(xì)胞的很大比例颜阐。未成熟的上皮細(xì)胞分離成分泌前體（例如 Atoh1、Dll1）吓肋、轉(zhuǎn)運(yùn)放大細(xì)胞（例如 Stmn1凳怨、Tubb5）和 Lgr5+ 祖細(xì)胞。在兩個(gè) scRNA-seq 數(shù)據(jù)集中都發(fā)現(xiàn)了由 Lgr5 和 Olfm4 標(biāo)記的真正 ISC是鬼。

雖然這些早期群體僅占小腸總隱窩上皮細(xì)胞的 4-6%肤舞，但富集策略能夠?qū)?LGR5+ 干/祖細(xì)胞的數(shù)量增加到總?cè)后w的約 30%，提供這些稀有種群的深層分子特征均蜜。 總之李剖，這些數(shù)據(jù)構(gòu)成了前所未有的小鼠結(jié)腸上皮綜合圖譜，以及小鼠小腸和大腸細(xì)胞群特別是 ISC 的寶貴轉(zhuǎn)錄組資源囤耳。

深入挖掘篙顺，接下來對匹配的組織樣本進(jìn)行空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)（10X Visium 平臺）偶芍，這些樣本針對上皮細(xì)胞 (EpCAM)、ISC (OLFM4) 和 LEC (LYVE1) 進(jìn)行了免疫標(biāo)記德玫。 用于空間轉(zhuǎn)錄組學(xué) (10X Visium) 的商用平臺是一種有價(jià)值的工具匪蟀，但分辨率有限，每個(gè)條形碼點(diǎn)（直徑約 50 微米宰僧，中心距為 100 微米的點(diǎn)）通常包含多種細(xì)胞和細(xì)胞類型材彪。 這種限制排除了相鄰細(xì)胞之間相互作用的表征。 這對我們的興趣尤其成問題琴儿，即剖析 ISC 與其niche components之間的相互作用段化，因?yàn)檫@些細(xì)胞類型通常組合在一個(gè)spot內(nèi)。 了解生態(tài)位中細(xì)胞類型之間相互作用的性質(zhì)需要對（1）每個(gè)spot內(nèi)的細(xì)胞類型和（2）每個(gè)細(xì)胞在給定空間位置表達(dá)的基因進(jìn)行去卷積的方法凤类。

為此穗泵，我們使用了 BayesPrism，這是一種貝葉斯統(tǒng)計(jì)模型谜疤，通過使用來自匹配組織的 scRNA-seq 參考作為先驗(yàn)信息佃延，聯(lián)合反卷積每個(gè)空間點(diǎn)內(nèi)的細(xì)胞類型組成和細(xì)胞類型特異性基因表達(dá)譜。 該方法在bulk RNA-seq 反卷積中明顯優(yōu)于其他基于回歸的工具夷磕，并且其對平臺批次效應(yīng)履肃、技術(shù)偽影和噪聲的穩(wěn)健性使其特別適合空間反卷積，將每個(gè) Visium 點(diǎn)視為批量 RNA 樣本坐桩。 此外尺棋，在 scRNA-seq 策略中對 LEC 和 LGR5+ ISC 的富集允許準(zhǔn)確推斷腸素中這些稀有細(xì)胞類型。

通過將它們與沿隱窩絨毛或隱窩軸的預(yù)期細(xì)胞類型分布以及測序組織的免疫熒光圖譜進(jìn)行比較來驗(yàn)證我們的去卷積分配绵跷。 將 BayesPrism 與為空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)開發(fā)的其他反卷積工具進(jìn)行基準(zhǔn)比較膘螟，發(fā)現(xiàn) BayesPrism 與預(yù)期的標(biāo)記基因表達(dá)模式具有最高的一致性（單細(xì)胞空間聯(lián)合分析）。

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Cell type and expression cartography reveals in vivo lymphatic:ISC interactome

雖然 Visium 允許繪制基因表達(dá)的空間模式碾局，但它在基因測量中的有限分辨率和稀疏性排除了我們詢問niche：ISC 相互作用所需的高分辨率空間基因表達(dá)圖荆残。 為了構(gòu)建能夠揭示細(xì)胞-細(xì)胞相互作用的隱窩-絨毛軸基因表達(dá)的高分辨率制圖，開發(fā)了 SpaceFold 軸投影净当。 為此内斯，使用每個(gè)點(diǎn)的細(xì)胞類型分?jǐn)?shù)的非線性降維來沿一維 (1D) 偽空間軸投影每個(gè) Visium 點(diǎn)。

SpaceFold 利用了數(shù)百個(gè)高度刻板的腸上皮結(jié)構(gòu)像啼，每個(gè)結(jié)構(gòu)都由小腸中重復(fù)的隱窩-絨毛單元或大腸中的隱窩單元組成俘闯。 盡管小腸和大腸之間存在固有差異，但各自組織內(nèi)的每個(gè)隱窩在大小和細(xì)胞類型沿隱窩-絨毛或隱窩軸的排序方面相似忽冻。 假設(shè)真朗，隨著空間spot沿該定型軸隨機(jī)采樣，每個(gè)空間點(diǎn)的細(xì)胞類型組成僧诚，如 BayesPrism 所推斷的遮婶，將告知細(xì)胞沿一維人工隱窩絨毛 uni 的相對物理坐標(biāo)秀菱。

事實(shí)上，SpaceFold 推斷的一維偽空間分別很好地概括了沿著小腸隱窩絨毛和大腸隱窩軸的預(yù)期細(xì)胞類型分布蹭睡。吸收性腸細(xì)胞cluster沿絨毛軸映射，由絨毛區(qū)標(biāo)記基因預(yù)測赶么，底部和頂部區(qū)腸細(xì)胞落入各自的位置肩豁。有趣的是，投影軸將含有隱窩毛細(xì)淋巴管的spot與乳淋巴管區(qū)分開來辫呻，后者從基底毛細(xì)淋巴管床延伸到小腸中腸絨毛的尖端清钥。值得注意的是，大腸數(shù)據(jù)集中不存在這種突起放闺，這與該組織中不存在乳腺一致祟昭。重要的是，該圖還概括了 ISC 生態(tài)位細(xì)胞沿該軸的已知分布怖侦，含有滋養(yǎng)細(xì)胞的基質(zhì) 3 樣種群落在其預(yù)測的小腸和大腸隱窩底部下方的位置篡悟。

接下來繪制了每種細(xì)胞類型的基因表達(dá)譜∝仪蓿基于每個(gè)空間spot中去卷積的細(xì)胞類型特異性基因表達(dá)譜搬葬，繪制了已建立的上皮細(xì)胞（例如 Lgr5 作為 ISC 的標(biāo)志物，Defa5 作為潘氏細(xì)胞的標(biāo)志物）和基質(zhì)（例如 Grem1 作為隱窩的標(biāo)志物）的轉(zhuǎn)錄水平艳悔〖被耍基于基質(zhì)細(xì)胞/滋養(yǎng)細(xì)胞）沿投影的隱窩絨毛軸的每個(gè)點(diǎn)的標(biāo)記基因。在標(biāo)記基因表達(dá)與其相關(guān)細(xì)胞類型的預(yù)期空間分布之間發(fā)現(xiàn)了高度一致性猜年。腸絨毛上皮細(xì)胞區(qū)標(biāo)記物也可預(yù)測地沿投影絨毛軸分布抡锈。總之乔外，通過準(zhǔn)確地對細(xì)胞類型組成進(jìn)行反卷積床三，推斷每個(gè)空間點(diǎn)內(nèi)的細(xì)胞類型特異性基因表達(dá)譜，并通過 SpaceFold 生成定型軸投影袁稽，能夠獲得細(xì)胞類型和細(xì)胞類型的高分辨率制圖-小腸和大腸中的特定基因表達(dá)譜勿璃，分別沿著隱窩絨毛和隱窩軸。盡管研究的重點(diǎn)是 LEC：隱窩生態(tài)位中的 ISC 相互作用推汽，但數(shù)據(jù)和制圖為繪制腸道中其他細(xì)胞類型之間的相互作用提供了豐富的資源补疑。

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Lymphatic capillaries are a local source of stem cell niche factors

隨著小鼠腸道的去卷積空間轉(zhuǎn)錄組和淋巴衍生的分泌因子在體外調(diào)節(jié)類器官行為的知識，準(zhǔn)備解開能夠在體內(nèi)向 ISC 發(fā)出信號的空間相關(guān)隱窩淋巴管生成配體歹撒。 從單細(xì)胞 RNA-seq 數(shù)據(jù)集中獲得在淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞中顯著水平表達(dá)的基因（在超過 20% 的 LEC 中表達(dá)）莲组，但在相關(guān)的血液內(nèi)皮細(xì)胞中沒有（在不到 20% 的 BEC 中表達(dá)）。 根據(jù)這些暖夭，根據(jù)編碼預(yù)測分泌和細(xì)胞外定位的 N 端信號肽的序列的存在锹杈，生成了 12 個(gè)編碼蛋白質(zhì)的基因列表撵孤，這些蛋白質(zhì)很有可能被分泌到細(xì)胞外。

接下來檢查了這 12 個(gè) LEC 衍生因子在隱窩生態(tài)位的不同細(xì)胞類型中的中值表達(dá)竭望。排除了與 ISC 功能直接相關(guān)的可能性低的那些（例如那些編碼在抗菌肽或參與凝血級聯(lián)或銅代謝的蛋白質(zhì)中起作用的蛋白質(zhì)）邪码，以關(guān)注 5 個(gè)候選淋巴管分泌因子的列表。同時(shí)咬清，使用高分辨率闭专、細(xì)胞類型特異性、偽空間轉(zhuǎn)錄組制圖以細(xì)胞類型特異性方式繪制這些基因中的每一個(gè)沿隱窩-絨毛軸的空間表達(dá)旧烧。從這些分析中影钉，了解到其中一些基因，例如掘剪。 Ntn1 和 Il33 在淋巴管中顯示富集但不是唯一的表達(dá)平委。相比之下，Reln夺谁、Ccl21a廉赔、Rspo3 和 Wnt2 在 LEC 中的表達(dá)高于其他生態(tài)位細(xì)胞，并且在隱窩底部的生態(tài)位淋巴管中富集予权。在這四個(gè)因子中昂勉，主要由基于隱窩的淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)，三個(gè)具有由小腸和大腸中的 ISC 表達(dá)的受體扫腺，使其成為在隱窩生態(tài)位內(nèi)介導(dǎo) LEC:ISC 信號傳導(dǎo)的 strong candidates岗照。

由 Rspo3 編碼的 R-SPONDIN-3 與 LGR5 結(jié)合并增強(qiáng)腸干細(xì)胞中的 WNT 信號傳導(dǎo)。 雖然它最初被確定為間充質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的一個(gè)因子笆环，但最近報(bào)道 Rspo3 表達(dá)也由淋巴管表達(dá)攒至。 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)清楚地證實(shí)了基于隱窩的淋巴管是這種重要的 ISC 配體的主要來源。 雖然 WNT2 尚未在隱窩淋巴管的背景下進(jìn)行研究躁劣，但它已添加到由 Paneth 和小生境間充質(zhì)細(xì)胞表達(dá)的規(guī)范 WNT 列表中迫吐。 鑒于 WNT-Frizzled 信號在 ISC 維護(hù)中的重要性，這些因素在基于隱窩的 LEC 中的重要性提高了淋巴管作為 ISC niche的關(guān)鍵新組成部分的重要性账忘。

雖然 R-SPONDINs 和 WNTs 在 ISC 功能中的作用已經(jīng)確立志膀，但 REELIN 以前并未被描述為 ISC 生態(tài)位因子，而是作為參與神經(jīng)元遷移和心臟重塑的大型細(xì)胞外基質(zhì)蛋白鳖擒。 鑒于 REELIN 的主要受體 Vldlr/Lrp8 和 Itgb1 均由 ISC 表達(dá)溉浙，而 Reln 由基于隱窩的淋巴管選擇性表達(dá)，因此它成為引發(fā) LEC 對 ISC 維持和分化影響的good candidate蒋荚。

通過免疫熒光判斷戳稽，REELIN 在培養(yǎng)的 LEC 中表達(dá)，組織清除和整體成像證實(shí)了它在 LEC 中的豐富表達(dá)期升，這些 LEC 集中在小腸和大腸的隱窩基底毛細(xì)血管網(wǎng)絡(luò)中惊奇。 最引人注目的是互躬，在標(biāo)準(zhǔn)類器官培養(yǎng)物中添加重組 REELIN 概括了與 LEC 共培養(yǎng)和/或在 LEC 條件培養(yǎng)基中培養(yǎng)的類器官的表型，REELIN 處理的類器官表現(xiàn)出尺寸減小颂郎、圓形度增加和隱窩結(jié)構(gòu)域數(shù)量減少吼渡。 這些數(shù)據(jù)強(qiáng)調(diào)了淋巴管生成分泌組在控制 ISC 行為和維持腸隱窩生態(tài)位干性方面的功能重要性和生理相關(guān)性。 此外乓序，我們的研究闡明了整合轉(zhuǎn)錄組和高分辨率空間分析在剖析干細(xì)胞生態(tài)位的復(fù)雜性和識別新的生態(tài)位成分方面的力量诞吱。

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Discussion

Lymphatics and the Intestinal Stem Cell Niche

已知 WNT 和 BMP 的逆梯度以及其他信號是由腸隱窩生態(tài)位的不同細(xì)胞成分產(chǎn)生的，以影響 ISC 的自我更新和健康和疾病的分化竭缝。然而，這些線索的綜合性質(zhì)以及它們?nèi)绾蝿討B(tài)協(xié)調(diào)以協(xié)調(diào)跨組織的干細(xì)胞行為仍未完全了解沼瘫。之前發(fā)現(xiàn)淋巴毛囊為皮膚中的毛囊干細(xì)胞形成了一個(gè)動態(tài)的生態(tài)位抬纸，這些細(xì)胞經(jīng)歷周期性的靜止和再生活動以驅(qū)動毛發(fā)周期。與皮膚相比耿戚，腸道淋巴網(wǎng)絡(luò)的重點(diǎn)是乳管湿故，它是由血管網(wǎng)絡(luò)包裹的中央毛細(xì)淋巴管，從腸黏膜下層延伸到絨毛膜蛔，并具有運(yùn)輸膳食脂質(zhì)和營養(yǎng)物質(zhì)坛猪、免疫監(jiān)視和流體平衡調(diào)節(jié)。盡管與小腸乳管相連皂股，但整個(gè)腸道隱窩下方的毛細(xì)淋巴管網(wǎng)絡(luò)在很大程度上被忽略了墅茉。在這方面，3D 成像揭示并通過超微結(jié)構(gòu)分析證實(shí)的 ISC 隱窩和淋巴管之間的密切關(guān)系既顯著又intriguing呜呐。

建立的淋巴器官共培養(yǎng)系統(tǒng)揭示了淋巴內(nèi)皮細(xì)胞對維持 ISC 的自我更新能力和適應(yīng)性同時(shí)抑制其分化的有效作用就斤。 將此特征追溯到淋巴管分泌的因子，因?yàn)?LEC 條件培養(yǎng)基足以引發(fā)類器官的這些表型變化蘑辑。 重要的是洋机，當(dāng)預(yù)條件 ISC 在正常的類器官培養(yǎng)條件下生長時(shí)，與在正常培養(yǎng)基中培養(yǎng)的 ISC 相比洋魂，它們保留了優(yōu)越的組織再生活性绷旗。 然而，在條件培養(yǎng)基中去除 LEC 分泌因子后副砍，這些 ISC 能夠沿著其分化譜系正常發(fā)展衔肢。

Lymphatics as a Signaling Hub for Tissue Stem Cells

沒有采用蛋白質(zhì)組學(xué)方法來識別所涉及的淋巴因子，而是設(shè)計(jì)了一種轉(zhuǎn)錄組策略來獲得candidates址晕，然后可以對其進(jìn)行功能性詢問膀懈。 BayesPrism 將 10X Visium 空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)與scRNA-seq 數(shù)據(jù)整合在一起，不僅可以揭示細(xì)胞類型分?jǐn)?shù)谨垃，還可以揭示每個(gè)spot的細(xì)胞類型特異性基因表達(dá)譜启搂。利用基于 scRNA-seq 的參考圖譜通過新的 SpaceFold 方法對低分辨率空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行反卷積硼控，通過計(jì)算重建了隱窩-絨毛單元的空間組織。該分析揭示了小腸和大腸內(nèi)每個(gè)細(xì)胞的高分辨率空間圖及其空間決定的基因程序胳赌。通過富集淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞和稀有的 LGR5+ 祖細(xì)胞牢撼，這些圖譜變得更加有意義。這可以通過在腸隱窩-絨毛軸上剖析淋巴管內(nèi)皮網(wǎng)絡(luò)內(nèi)的轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性以及識別隱窩底部毛細(xì)淋巴管特異性產(chǎn)生的因子的能力來說明疑苫。

這一策略非常有效地指導(dǎo)我們找到直接指導(dǎo) ISC 發(fā)育和成熟的獨(dú)特淋巴管分泌信號熏版。 通過定位生態(tài)位信號和/或其 ISC 受體，一種機(jī)制浮出水面捍掺，即從其生態(tài)位信號中置換出來的 ISC 后代執(zhí)行分化程序撼短。 當(dāng)重新繁殖在 LEC 條件培養(yǎng)基中生長的類器官時(shí)，我們在體外的研究結(jié)果證實(shí)了這一點(diǎn)挺勿。 我們的制圖方法澄清了先前關(guān)于 Rspo3 主要來源的模糊性曲横，編碼 LGR5+ ISC 的關(guān)鍵 WNT 增強(qiáng)生態(tài)位信號，并將 REELIN 確定為隱窩生態(tài)位內(nèi)向 ISC 發(fā)出信號的額外淋巴候選因子不瓶。 事實(shí)上禾嫉，在類器官模型中，已知 RSPONDIN（RSPO-1 包含在我們的 ENR 類器官培養(yǎng)基中）對于 ISC 維持至關(guān)重要蚊丐，正如展示的熙参，REELIN 對類器官的發(fā)育和成熟也有直接而明顯的影響。

在重新審視 HFSC 生態(tài)位時(shí)麦备，周圍的毛細(xì)淋巴管在干細(xì)胞維持和毛發(fā)再生中起關(guān)鍵作用孽椰，有趣的是，Reln（在 LECs 中）和 Lrp8/Vdlr/Itgb1（在 HFSCs 中）也被表達(dá)凛篙，這表明它的保守作用組織干細(xì)胞niche中的 REELIN 信號傳導(dǎo)弄屡。 此外，盡管腸道和皮膚中的干細(xì)胞活動和組織再生存在差異鞋诗，但淋巴管的功能似乎相似膀捷，即通過控制干細(xì)胞生態(tài)位內(nèi)的維持和再生活動。 在這方面削彬，有趣的是全庸，盡管干細(xì)胞生態(tài)位具有一些保守的特征，正如我們在這里發(fā)現(xiàn)的那樣融痛，但其他一些特征似乎是為適應(yīng)每種組織的特定需求而量身定制的壶笼。

The Power and Universality of Our Computational Strategy in Unearthing Intercellular Interactions Within Tissues

雖然超出了當(dāng)前研究的范圍，但在這里繪制的高分辨率空間圖以及相關(guān)的小腸和大腸細(xì)胞的深層單細(xì)胞分析現(xiàn)在提供了豐富的數(shù)據(jù)集雁刷，以query對空間定義的細(xì)胞類型和基因表達(dá)程序的更多見解以及腸道內(nèi)的細(xì)胞相互作用覆劈。雖然大多數(shù)先前的研究只關(guān)注從空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)推斷細(xì)胞類型分?jǐn)?shù)，但我們的研究強(qiáng)調(diào)了推斷空間分辨的細(xì)胞類型特異性基因表達(dá)的重要性。此外责语，該方法也可以應(yīng)用于由空間有序單元組成的其他組織的空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)炮障。在這方面袭厂，BayesPrism 的兩個(gè)特點(diǎn)使其對其他空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集具有高度的泛化性：（1）它不依賴于在 scRNA-seq 數(shù)據(jù)中觀察到的細(xì)胞類型比例乡数，使其對富含稀有細(xì)胞類型的數(shù)據(jù)集特別有效(2) 它對技術(shù)甚至生物學(xué)變異具有魯棒性佛呻，因此不需要通過 scRNA-seq 和空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析的完美匹配的樣本若锁。

利用刻板的隱窩絨毛和隱窩單位，SpaceFold 能夠?qū)⑽覀兊霓D(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)壓縮到一維空間軸上劝篷，從而促進(jìn)我們對腸道中空間受限基因表達(dá)的分析枫笛。 SpaceFold 可以類似地應(yīng)用于其他定型組織結(jié)構(gòu)（例如毛囊）法精，并且可以擴(kuò)展以將每個(gè)點(diǎn)投影到二維上徒河，以構(gòu)建更復(fù)雜組織單元的 2D 制圖系馆。

Broader Implications for Lymphatic-ISC Interactions: Looking Ahead.

盡管在這里專注于淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞和 ISC 之間的直接通訊，但淋巴管也可能介導(dǎo)其他隱窩動力學(xué)顽照，包括特定生態(tài)位信號分子的運(yùn)輸它呀、液體引流和免疫細(xì)胞與 ISC 的串?dāng)_。Indeed, while immune cells can directly signal to stem cells to orchestrate pathogen responses, immune-mediated damage of ISCs is a common feature of graft-versus-host disease, in which lymphoid organs are damaged, suggesting an important role for immune cell drainage from the niche via lymphatics.

由于淋巴管可以發(fā)揮的作用的多樣性棒厘，它們與 ISC 的關(guān)聯(lián)也可能對疾病狀態(tài)產(chǎn)生重要影響。 在這方面下隧，腸炎性疾病與淋巴管擴(kuò)張奢人、黏膜下水腫、淋巴阻塞淆院、淋巴結(jié)病何乎、淋巴管擴(kuò)張和淋巴管生成有關(guān)。 此外土辩，肥胖會改變 LEC 的密度支救、增殖和滲透性。 淋巴管中的任何或所有這些擾動都可能直接影響 ISC拷淘。 為了指導(dǎo)未來的治療各墨，重要的是詢問淋巴轉(zhuǎn)錄組在疾病狀態(tài)下是如何改變的，它如何解釋炎癥和代謝線索启涯，以及它如何將它們傳遞給 ISC niche贬堵。

Method

scRNA-seq data analyses（我們來總結(jié)一下）

• remove ambient RNA molecules ---- CellBender
• removed low quality cells ---- i) genes detected in fewer than 3 cells, ii) cells with under 200 genes or 1000 UMIs, and iii) cells with a mitochondrial fraction above 15%.
• emove doublets ---- performance of both DoubletDetection and Scrublet 。

• 降維選擇的高變基因 ---- 5000

  
  
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• 軌跡推斷 ---- CellRank结洼，CytoTRACE黎做、Palantir。

BayesPrism algorithm（單細(xì)胞空間聯(lián)合算法）

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生活很好松忍，有你更好蒸殿，大家情人節(jié)快樂~~~