一、Native-PAGE原理

非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(Native-PAGE)是在不加入SDS 疏基乙醇等變性劑的條件下， 對(duì)保持活性的蛋白質(zhì)進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，常用于同工酶的鑒定和提純。未加SDS的天然聚丙烯酰胺凝膠電泳可以使生物大分子在電泳過程中保持其天然的形狀和電荷秀睛，它們的分離是依據(jù)其電泳遷移率的不同和凝膠的分子篩作用，因而可以得到較高的分辨率莲祸，尤其是在電泳分離后仍能保持蛋白質(zhì)和酶等生物大分子的生物活性蹂安，對(duì)于生物大分子的鑒定有重要意義，其方法是在凝膠上進(jìn)行兩份相同樣品的電泳锐帜，電泳后將凝膠切成兩半田盈，一半用于活性染色，對(duì)某個(gè)特定的生物大分子進(jìn)行鑒定缴阎，另一半用于所有樣品的染色允瞧，以分析樣品中各種生物大分子的種類和含量。

二、Native-PAGE實(shí)驗(yàn)方法

非變性聚丙烯酰胺凝膠和變性sds-page電泳在操作上基本上是相同的述暂，只是非變性聚丙烯酰胺凝膠的配制和電泳緩沖液中不能含有變性劑如SDS等痹升。一般蛋白進(jìn)行非變性凝膠電泳要先分清是堿性還是酸性蛋白。分離堿性蛋白時(shí)候贸典，要利用低pH凝膠系統(tǒng)视卢，分離酸性蛋白時(shí)候，要利用高pH凝膠系統(tǒng)廊驼。酸性蛋白通常在非變性凝膠電泳中采用的pH是8.8的緩沖系統(tǒng)，蛋白會(huì)帶負(fù)電荷惋砂，蛋白會(huì)相陽極移動(dòng)妒挎；而堿性蛋白通常電泳是在微酸性環(huán)境下進(jìn)行，蛋白帶正電荷西饵，這時(shí)候需要將陰極和陽極倒置才可以電泳分離酸性蛋白酝掩。

三、工作液配制

1.30%膠貯液(Acr:Bis=29：1）;

2.4×分離膠Buffer(1.5 M Tris-HCl眷柔，pH 8.8)：18.2 g Trisbase 溶于80ml 水期虾，用濃HCl調(diào)pH 8.8，加水定容到100ml驯嘱，4℃?貯存镶苞；

3.4×堆積膠Buffer(0.5 M Tris-HCl，pH 6.8)：6 g Trisbase 溶于80ml 水鞠评，用濃HCl調(diào)pH 6.8茂蚓，加水定容到100ml，4℃?貯存剃幌；

4.10×電泳Bufferfer（pH8.8 Tris-Gly）:30.3 g Trisbase聋涨， 144 g 甘氨酸，加水定容到1L负乡，4℃?貯存牍白；

5.2×溴酚藍(lán)上樣Buffer:1.25ml pH6.8, 0.5M Tris-Cl，3.0ml甘油抖棘，0.2ml 0.5% 溴酚藍(lán)茂腥，5.5ml dH2O； -20℃貯存钉答；

6.10％APS础芍；?

7.0.25％考馬斯亮藍(lán)染色液:Coomassie blue R-250 2.5g，甲醇450ml数尿，HAc 100ml, dH2O 450ml仑性；

8.考馬斯亮藍(lán)脫色液: 100ml甲醇，100冰醋酸右蹦，800ml dH2O诊杆。

四歼捐、電泳膠的配制及電泳條件（上槽電極為負(fù)，下槽電極為正）

1. 堿性非變性膠 17%分離膠(10 ml) 4%堆積膠(5 ml)

2. 40%膠貯液(40%T,3.3%C） 4.25ml 0.5ml3. 4×分離膠Buffer(1.5 M Tris-HCl晨汹，pH 8.8) 2.5ml?4. 4×堆積膠Buffer(0.5 M Tris-HCl豹储，pH 6.8) 1.25ml5. 水 3.2ml6. 10％APS ?35 μl7. TEMED 15 μl8. 10×電泳Buffer（pH8.8 Tris-Gly）:100ml稀釋到1L

五、電泳條件

100V恒壓約20min淘这，指示劑進(jìn)入濃縮膠剥扣；改換160V恒壓，當(dāng)指示劑移動(dòng)到膠板底部時(shí)铝穷，停止電泳钠怯，整個(gè)過程約80min。????染色和脫色：取出膠板于0.25％考馬斯亮藍(lán)染色液中染色約30min曙聂，傾出染色液晦炊，加入考馬斯亮藍(lán)脫色液，緩慢搖動(dòng)宁脊，注意更換脫色液断国，直至膠板干凈清晰背景。也可以用銀染或者活性染色榆苞。六稳衬、分離堿性蛋白　　要用低pH凝膠系統(tǒng)，并使用以下緩沖液體系：????1. 分離膠：0.06M KOH语稠，0.376M Ac宋彼，pH4.3（7.7% T，2.67% C）仙畦；????2. 堆積膠：0.06M KOH输涕，0.063M Ac，pH6.8（3.125% T慨畸，25% C）莱坎；????3. 電泳緩沖液：0.14M 2-丙氨酸，0.35M Ac寸士，pH4.5????將正負(fù)電極倒置檐什，用甲基綠（0.002%）為示蹤劑，實(shí)驗(yàn)操作同分離酸性蛋白弱卡。七乃正、切膠回收（單條帶純化）????native-PAGE結(jié)束以后，可以將蛋白條帶進(jìn)行切膠回收的方法進(jìn)行純化婶博，方法如下：先跑Native PAGE瓮具，然后用預(yù)冷的0.25M KCl染色（預(yù)先放在4度冰箱中），目的條帶會(huì)出現(xiàn)白色條帶，根據(jù)你已經(jīng)跑過的考馬斯亮藍(lán)染色的位置可以判斷哪條帶是你的目的條帶名党，如果蛋白濃度高的話叹阔，染1分鐘就可以看到目的條帶，蛋白濃度低的話传睹，要染時(shí)間長一些耳幢，大概5-10分鐘，如果太低欧啤，估計(jì)是看不到目的條帶了睛藻。無法用此方法看到目的條帶。那用該方法就不行了邢隧。

注意：蛋白濃度底修档，目的條帶顏色很淺，要在背景深色的時(shí)候才能看到（可以放在透明的玻璃板上操作）府框，因?yàn)檫@種染色方法靈敏度比考馬斯亮藍(lán)染色低很多。

當(dāng)看到目的條帶時(shí)讥邻，可用一干凈的刀片切下目的蛋白所在的凝膠條帶迫靖，將凝膠條放在蒸餾水里浸泡，直至無色透明兴使，目的是使得KCl離開膠條（當(dāng)然目的蛋白會(huì)損失一些系宜，但絕大多數(shù)還在膠里，因?yàn)檫@個(gè)自由擴(kuò)散的過程不會(huì)太久）发魄，一般也就是五到十分鐘就可以目測觀察到膠條變成無色透明狀盹牧。

將無色透明的膠條從蒸餾水中取出，裝入一準(zhǔn)備好的1.5ml離心管中励幼，用鑷子夾碎（或在放入離心管之前用刀片切碎）汰寓，我常用的是滅過菌的鑷子夾碎。然后再在管里加入你所需要溶解蛋白的溶液苹粟，比如蒸餾水（生理鹽水或PBS等）有滑。將離心管放入4度冰箱過夜，第二天吸出管中的液體（吸之前震蕩一下）嵌削，至少50%蛋白可以從凝膠中析出（這要看你的凝膠和水溶液的體積比）毛好。再加入蒸餾水抽提兩次，就可以將膠條中絕大部分蛋白抽提出苛秕。

多次抽提的蛋白經(jīng)Brandford考馬斯亮藍(lán)染色法測蛋白濃度測定肌访，證明濃度依次遞減，后一次的濃度均不超過上次的50%艇劫。對(duì)于后面抽提的濃度比較低的吼驶，可以進(jìn)行濃縮。

切膠回收得到的蛋白濃度可達(dá)到1mg/ml。經(jīng)電泳檢測旨剥，只有單一條帶咧欣。無任何雜帶。

也可用普通的水平電泳槽回收蛋白：將條帶裝到透析袋里(透析袋截流量最好不要大過分子量的1/3)轨帜，利用電泳將蛋白從凝膠里分離出來魄咕，一般80V 2h即可。

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