工作已經(jīng)進(jìn)入了正軌，10X單細(xì)胞空間似乎永遠(yuǎn)在路上浊猾，但是慢慢研究的風(fēng)向開始起了變化贼邓，單細(xì)胞空間都不再滿足于對(duì)組織的研究阶冈，而是要靠向臨床，運(yùn)用單細(xì)胞空間技術(shù)對(duì)臨床進(jìn)行指導(dǎo)塑径，今天分享的文獻(xiàn)在Tumor and immune reprogramming during immunotherapy in advanced renal cell carcinoma女坑，發(fā)表于Cancer Cell,IF32分，單細(xì)胞的研究開始結(jié)合臨床數(shù)據(jù)等等统舀，看起來(lái)匆骗，每個(gè)技術(shù)不能停留在實(shí)驗(yàn)室，而是要走向應(yīng)用誉简。

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總結(jié)一下小知識(shí)

• TOX 和 ENTPD1（編碼 CD39）是兩種在腫瘤特異性 T 細(xì)胞中上調(diào)的耗竭標(biāo)志物

• 單核細(xì)胞碉就，目前最新的研究結(jié)果認(rèn)為，單核細(xì)胞有兩種分化途徑闷串，分別是CMP→粒細(xì)胞-單核細(xì)胞前體（Granulocyte-monocyte progenitor瓮钥，GMP）→單核細(xì)胞，以及CMP→單核-樹突狀細(xì)胞前體（Monocyte-Dendritic cell progenitor，MDP）→單核細(xì)胞骏庸。單核細(xì)胞可以繼續(xù)分化為部分組織中的巨噬細(xì)胞毛甲，例如腸道和真皮等。但最新的研究顯示具被，大多數(shù)組織如大腦（microglial cell玻募，小膠質(zhì)細(xì)胞）、表皮（langerhans cell一姿，朗格漢斯細(xì)胞）七咧、肝臟（kuffer cell，枯氏細(xì)胞）和肺泡中的巨噬細(xì)胞并非依靠后期的單核細(xì)胞分化更新叮叹，而是由胚胎造血系統(tǒng)直接原位分化艾栋，在胚胎發(fā)育階段就已經(jīng)定植到組織中，并且在組織中自我更新和維持蛉顽。單核細(xì)胞能吞噬異物并進(jìn)行抗原遞呈蝗砾，可以被看作不成熟的巨噬細(xì)胞，因此有些研究者直接將單核細(xì)胞稱為巨噬細(xì)胞携冤，或者將單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞統(tǒng)一稱為Monocytes/Macrophage類群悼粮。根據(jù)細(xì)胞表面的一組蛋白質(zhì)，單核細(xì)胞可以分為三類：經(jīng)典（Classical）曾棕、非經(jīng)典（Non-classical）和中間型（Intermediate）扣猫，它們?cè)诿庖呦到y(tǒng)中起著不同的作用。典型單核細(xì)胞占單核細(xì)胞的80%~90%翘地，具有更高水平的吞噬和抗菌活性申尤，并且表現(xiàn)出較高的過(guò)氧化物酶活性，在產(chǎn)生活性氧（ROS）方面更有效衙耕。它們還具有更高水平的趨化因子受體昧穿，能夠遷移到損傷和炎癥部位；非經(jīng)典單核細(xì)胞的功能偏向于調(diào)節(jié)和監(jiān)視橙喘，這些細(xì)胞吞噬作用粤咪、ROS和促炎因子的水平較低，主要在傷口或感染部位招募其他細(xì)胞渴杆，促進(jìn)傷口愈合并應(yīng)對(duì)病毒感染等寥枝，也有一些研究表明，非經(jīng)典單核細(xì)胞同樣直接參與免疫調(diào)節(jié)磁奖；中間型單核細(xì)胞囊拜，其功能處于中間狀態(tài)，具有炎癥特性比搭，但同時(shí)具有較低的過(guò)氧化物酶活性冠跷。

• 一般來(lái)說(shuō)，單核細(xì)胞的固有標(biāo)志物是CD14，人可以用CD16來(lái)區(qū)分不同亞型：經(jīng)典型單核細(xì)胞標(biāo)記為CD14+CD16-蜜托；中間型單核細(xì)胞標(biāo)記為CD14+CD16+抄囚；非經(jīng)典型單核細(xì)胞標(biāo)記為CD14+CD16++。小鼠可以用Ly6C來(lái)區(qū)分橄务，經(jīng)典單核標(biāo)記為CD14+Ly6C++幔托；中間型為CD14+Ly6C+；非經(jīng)典為CD14+Ly6C low蜂挪。同時(shí)重挑，還可以利用炎癥因子和趨化因子受體來(lái)進(jìn)行區(qū)分，包括CCR5棠涮、CX3CR1谬哀、CD62L等。此外严肪，由于巨噬細(xì)胞同樣表達(dá)這些marker史煎，如果要區(qū)分單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，則需要添加巨噬細(xì)胞的標(biāo)志物驳糯，例如人的CD80劲室、小鼠的F4/80等。

• 巨噬細(xì)胞作為固有免疫中的重要細(xì)胞組分结窘，能對(duì)入侵病原體做出反應(yīng)，吞噬和消化病原體充蓝，也可以參與清除受損隧枫、衰老的細(xì)胞，通過(guò)抗原提呈參與激發(fā)適應(yīng)性免疫谓苟。但是巨噬細(xì)胞除了在對(duì)抗疾病中發(fā)揮作用外官脓，也與慢性疾病（包括動(dòng)脈粥樣硬化涝焙、哮喘卑笨、炎癥性腸病、關(guān)節(jié)炎等）仑撞、自身免疫性疾渤嘈恕（包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化癥）隧哮、糖尿病桶良、腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。巨噬細(xì)胞根據(jù)其所處部位沮翔，可以將巨噬細(xì)胞分為小膠質(zhì)細(xì)胞陨帆、肝臟Kupffer細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞、腎臟系膜細(xì)胞疲牵、破骨細(xì)胞承二、脾臟紅髓巨噬細(xì)胞、脂肪組織相關(guān)巨噬細(xì)胞等纲爸。它們除了執(zhí)行吞噬和免疫防疫功能外亥鸠，也參與組織重塑和維持組織穩(wěn)態(tài)。此外缩焦，它們可能在不同的組織中執(zhí)行特定的功能读虏，例如小膠質(zhì)細(xì)胞在腦組織中發(fā)揮免疫監(jiān)視、清除死亡神經(jīng)元袁滥、突觸重塑的功能盖桥，破骨細(xì)胞從骨基質(zhì)中吸收有機(jī)物和礦物質(zhì)，脾臟中的紅髓巨噬細(xì)胞能清除衰老的紅細(xì)胞题翻、調(diào)節(jié)鐵代謝等揩徊。各部位的特征marker詳見表1。

  
  
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• 相較于按組織進(jìn)行分類嵌赠，研究者們更喜歡把巨噬細(xì)胞按特征和功能進(jìn)行區(qū)分塑荒。根據(jù)活化狀態(tài)、功能及分泌細(xì)胞因子的不同姜挺，巨噬細(xì)胞主要可分為經(jīng)典活化的M1型巨噬細(xì)胞（促炎）和選擇性活化的M2 型巨噬細(xì)胞（抗炎）齿税。

• M1型巨噬細(xì)胞可以由IFN-γ、LPS或GM-CSF誘導(dǎo)炊豪，高表達(dá)MHC II類分子和共刺激分子CD80凌箕、CD86，上調(diào)表達(dá)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）词渤，產(chǎn)生大量的促炎細(xì)胞因子牵舱，如IL-1、IL-6缺虐、IL-12芜壁、IL-23、TNF-α高氮，同時(shí)會(huì)產(chǎn)生趨化因子CCL2慧妄、CCL3、CCL5剪芍、CXCL8腰涧、CXCL9、CXCL10紊浩、CXCL11窖铡、CXCL16疗锐，一氧化氮（NO）和活性氧物質(zhì)（ROS）。通過(guò)釋放這些炎性介質(zhì)费彼，M1細(xì)胞可以促進(jìn)炎癥反應(yīng)滑臊，殺傷胞內(nèi)感染的病原體，抗腫瘤箍铲。

• M2型巨噬細(xì)胞由IL-4雇卷、IL-13、真菌和寄生蟲感染颠猴、免疫復(fù)合物关划、IL-10、TGF-β翘瓮、糖皮質(zhì)激素等誘導(dǎo)贮折，高表達(dá)CD163、CD206资盅、CD200R调榄、CD209、CD301呵扛、Arginase-1每庆，產(chǎn)生抗炎細(xì)胞因子如IL-10、TGF-β今穿，參與免疫調(diào)節(jié)缤灵、組織重構(gòu)和再生、傷口愈合蓝晒、血管生成腮出、促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。M2型巨噬細(xì)胞可進(jìn)一步細(xì)分為M2a拔创、M2b、M2c富蓄、M2d四種亞型剩燥。M2a由IL-4、IL-13或真菌和寄生蟲感染誘導(dǎo)立倍，M2b由免疫復(fù)合物和LPS誘導(dǎo)灭红，M2c由IL-10、TGF-β口注、糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)变擒，M2d可由IL-6和腺苷誘導(dǎo)。

• 除了M1和M2以外寝志，腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAM）也是非常常見的研究類型娇斑。但是嚴(yán)格來(lái)說(shuō)策添，TAM并非巨噬細(xì)胞中的一個(gè)子類，而是與特定病理情況相關(guān)的巨噬細(xì)胞的集合毫缆。依據(jù)不同的病理狀態(tài)唯竹，其活化狀態(tài)和功能兼具M(jìn)1和M2的特征。

• 除了上述幾種子類之外苦丁，巨噬細(xì)胞還有 CD169+和 TCR+兩種類型浸颓。CD169+巨噬細(xì)胞具有結(jié)合紅細(xì)胞的能力。淋巴結(jié)包膜下竇和髓質(zhì)區(qū)旺拉、脾邊緣區(qū)中的巨噬細(xì)胞高表達(dá)CD169产上。到目前為止，CD169+巨噬細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)途徑和活化信息還不足蛾狗，與M1晋涣、M2的對(duì)比也不甚清楚。TCR＋巨噬細(xì)胞會(huì)表達(dá)TCRγδ可變鏈淘太，在細(xì)菌暴露后姻僧，會(huì)表達(dá)不同的TCRVδ庫(kù)，表明這類細(xì)胞能針對(duì)不同細(xì)菌發(fā)生不同的適應(yīng)性改變蒲牧，且不僅僅是巨噬細(xì)胞撇贺，嗜酸性和嗜中性粒細(xì)胞同樣被發(fā)現(xiàn)部分表達(dá)TCRαβ或TCRγδ可變鏈。

• 為研究巨噬細(xì)胞冰抢，通常需要采用一些表型標(biāo)記物來(lái)區(qū)分巨噬細(xì)胞和其他免疫細(xì)胞松嘶。小鼠巨噬細(xì)胞表達(dá)CD11b，F(xiàn)4/80挎扰，CSF-1R/CD115翠订；人巨噬細(xì)胞表達(dá)CD68，CD11b遵倦，CD14尽超，CD16，CD163梧躺，CD312似谁，CSF-1R/CD115。一般來(lái)說(shuō)掠哥，F(xiàn)4/80+ CD11c+ iNOS+定義為M1巩踏，F(xiàn)4/80+ CD206+定義為M2。但是巨噬細(xì)胞依然有待尋找更好的標(biāo)志物续搀，目前部分常見的標(biāo)志物詳見表2.
  

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• 巨噬細(xì)胞M1 associated genes（LI2B塞琼、TNF、CXCL9禁舷、CXCL10彪杉、CXCL11毅往、FCGR1A、IRF1在讶、HLA-DPB1煞抬、CD86、MARCO构哺、IL2RA）革答，M2 associated genes（CXCR4、IL27RA曙强、CSF1R残拐、CCL2、CCL7碟嘴、CCL17溪食、CCL18、CCL23娜扇、CTSD错沃、FN1、GAS7雀瓢、HMOX1枢析、PPARG、LIPA刃麸、CD209醒叁、CLEC7A、F13A1泊业、MAF把沼、MS4A4A）.

In Brief

剖析免疫檢查點(diǎn)阻斷暴露的轉(zhuǎn)移性腎細(xì)胞癌中的癌細(xì)胞和免疫微環(huán)境轉(zhuǎn)錄程序，揭示臨床耐藥背景下免疫亞群重編程和與不同癌細(xì)胞群的相互作用吁伺。

Highlights（創(chuàng)新點(diǎn)）

• Distinct CD8+ T cell phenotypes are enriched after immune checkpoint blockade (ICB)
• Immune checkpoint ligands are upregulated in macrophages and tumor cells after ICB（都是要結(jié)合臨床）
• Two cancer cell subpopulations are conserved across heterogeneous RCC tumors（腫瘤的保守型）
• Cancer cell programs drive distinct immune interactions and predict patient outcomes（癌細(xì)胞在驅(qū)動(dòng)不同的免疫相互作用）

SUMMARY

免疫檢查點(diǎn)阻斷 (ICB) 導(dǎo)致部分晚期腎細(xì)胞癌 (RCC) 患者的疾病得到持久控制饮睬，但驅(qū)動(dòng)耐藥的機(jī)制卻知之甚少。在 ICB 治療之前或之后描述了來(lái)自轉(zhuǎn)移性 RCC 患者的癌癥和免疫細(xì)胞的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組篮奄。在響應(yīng)細(xì)胞中捆愁，細(xì)胞毒性 T 細(xì)胞亞群表達(dá)更高水平的共抑制受體和效應(yīng)分子。來(lái)自處理過(guò)的活組織檢查的巨噬細(xì)胞響應(yīng)富含干擾素的微環(huán)境而轉(zhuǎn)變?yōu)榇傺谞顟B(tài)宦搬，但也會(huì)上調(diào)免疫抑制標(biāo)志物牙瓢。在癌細(xì)胞中劫拗，確定了 ICB 后在血管生成信號(hào)傳導(dǎo)和免疫抑制程序上調(diào)方面不同的兩個(gè)亞群间校。癌細(xì)胞亞群和免疫逃避的表達(dá)特征與 PBRM1 突變和原發(fā)性和 ICB 治療的晚期 RCC 中的存活相關(guān)。研究結(jié)果表明页慷，ICB 重塑了 RCC 微環(huán)境并改變了癌癥和免疫細(xì)胞群之間的相互作用憔足，這對(duì)于理解對(duì) ICB 的反應(yīng)和抗性至關(guān)重要胁附。

INTRODUCTION

腫瘤微環(huán)境在腎細(xì)胞癌 (RCC) 的發(fā)生、病理生理學(xué)和治療中起關(guān)鍵作用（各種癌癥中都一樣的）滓彰。 最常見的 RCC 組織學(xué)亞型控妻，clear cell RCC (ccRCC)，在 VHL 所在的染色體 3p 缺失的背景下揭绑，經(jīng)常在 VHL 中具有特征性的第二次打擊功能喪失突變弓候。 這些事件導(dǎo)致缺氧誘導(dǎo)因子 (HIF) 的降解減少，導(dǎo)致突變細(xì)胞轉(zhuǎn)向使用糖酵解和分泌 VEGF他匪，從而促進(jìn)血管生成菇存。 此外，ccRCC 腫瘤被免疫細(xì)胞高度浸潤(rùn)邦蜜，特別是被 T 細(xì)胞浸潤(rùn)依鸥。 利用微環(huán)境的這些特征，治療在過(guò)去十年中取得了顯著進(jìn)展悼沈，現(xiàn)在廣泛使用 VEGF 酪氨酸激酶抑制劑 (TKI)贱迟、免疫檢查點(diǎn)阻斷 (ICB) 以及這些方法的組合。

ICB can provide durable benefit in responders,但大多數(shù)患者都會(huì)出現(xiàn)耐藥性絮供，并且對(duì)癌癥和免疫細(xì)胞過(guò)程的因果關(guān)系知之甚少衣吠。 ICB 反應(yīng)的基因組特征集中在bulk測(cè)序的預(yù)處理樣本上，其中較低的基線骨髓炎癥和 PBRM1 功能喪失與某些患者群體的反應(yīng)有關(guān)杯缺。 對(duì)腫瘤內(nèi)和腫瘤間異質(zhì)性的觀察使機(jī)制理解復(fù)雜化蒸播，ccRCC 的多種分子亞型由一組染色質(zhì)重塑劑中的突變定義，這些突變表現(xiàn)出不同的進(jìn)化和轉(zhuǎn)移模式.

bulk測(cè)序不太適合研究細(xì)胞類型特異性對(duì)治療的反應(yīng)模式萍肆。 缺乏具有代表性的臨床前免疫活性 RCC 模型對(duì)研究細(xì)胞類型之間的相互作用和信號(hào)傳導(dǎo)提出了進(jìn)一步的挑戰(zhàn)袍榆。 為了應(yīng)對(duì)這些挑戰(zhàn)，最近的研究利用患者樣本的單細(xì)胞分析來(lái)查明起源癌細(xì)胞并描述未經(jīng)治療的 RCC 中的免疫細(xì)胞塘揣。 因此包雀，假設(shè)，在 ICB 治療之前或之后對(duì)活檢組織進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組解剖將揭示免疫和癌細(xì)胞計(jì)劃亲铡，這些計(jì)劃決定了治療反應(yīng)并指定了對(duì)抗耐藥性的目標(biāo)才写。

RESULTS

Characterizing the tumor microenvironment of advanced RCC during therapy

這里收集了 8 名患者的新鮮活檢或手術(shù)切除樣本，其中 7 名患有轉(zhuǎn)移性腎細(xì)胞癌奖蔓，1 名患有局部疾病赞草。使用 10 X 平臺(tái)對(duì)解離的細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞 RNA 測(cè)序 (scRNA-seq)，并在可用的情況下使用額外的組織進(jìn)行bulk全外顯子組測(cè)序吆鹤〕恚活檢時(shí)，5 名患者接觸過(guò) ICB（包括 4 名同時(shí)接觸 TKI 和 ICB）疑务，3 名患者未接受全身治療沾凄。在腎切除術(shù)的情況下梗醇，標(biāo)本來(lái)自腎臟，否則來(lái)自淋巴結(jié)和內(nèi)臟轉(zhuǎn)移撒蟀。七名患者患有 ccRCC叙谨，而一名腫瘤具有 2 型乳頭狀 RCC 組織學(xué)，具有 PBRM1 和 SETD2 突變保屯。正如預(yù)期的那樣手负，在可獲得基因組特征的 ccRCC 患者中普遍檢測(cè)到染色體 3p 丟失，在 VHL 和/或編碼染色質(zhì)重塑物的基因中存在額外的二次突變姑尺。概括地說(shuō)虫溜，隊(duì)列在基因組和臨床特征方面概括了晚期 ccRCC 的典型特征。

經(jīng)過(guò)QC后股缸，數(shù)據(jù)集包括 34,326 個(gè)總細(xì)胞衡楞，涵蓋各種癌癥和非惡性細(xì)胞類型。 為了減輕可能的批次效應(yīng)并允許對(duì)具有患者特異性表達(dá)模式的癌細(xì)胞進(jìn)行聯(lián)合分析敦姻，使用 Seurat 基于 CCA 的比對(duì)來(lái)聚合樣本中的細(xì)胞瘾境，并以無(wú)監(jiān)督的方式將它們聯(lián)合聚類×耄基于標(biāo)記基因標(biāo)記聚類表達(dá)迷守，識(shí)別在患者、活檢部位和接受的全身治療之間共享的癌癥和非癌細(xì)胞clusters旺入。

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CD8+ T cell remodeling by ICB

隊(duì)列中所有exposed于 ICB 的患者都接受了針對(duì) PD-1 axis的治療兑凿，因此假設(shè)治療可能會(huì)導(dǎo)致淋巴compartment的細(xì)胞（亞）類型特異性重塑。 為了解決這個(gè)問(wèn)題茵瘾，首先在廣泛的淋巴細(xì)胞類型中進(jìn)行無(wú)監(jiān)督聚類礼华，以識(shí)別患者、活檢部位和治療歷史中保守的細(xì)胞狀態(tài)拗秘。 鑒定了 12 個(gè)淋巴細(xì)胞亞群圣絮，包括 B 細(xì)胞、漿細(xì)胞雕旨、自然殺傷 T 細(xì)胞扮匠、FGFBP2+ 和 FGFBP2- 自然殺傷細(xì)胞、調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞以及記憶和效應(yīng) T 輔助細(xì)胞凡涩。

CD8+ T 細(xì)胞形成了四個(gè)不同的細(xì)胞群棒搜，包括一個(gè)在細(xì)胞周期中progressing的細(xì)胞群、一個(gè)以干擾素刺激基因 MX1 表達(dá)為標(biāo)志的小細(xì)胞群活箕，以及兩個(gè)通過(guò)表達(dá)包括 TNFRSF9（encoding the activation marker 4-1BB） 在內(nèi)的一組基因而分化的細(xì)胞群力麸。 共抑制受體 PDCD1（編碼 PD-1）、HAVCR2（編碼 TIM-3）和 LAG3 在所有 CD8+ T 細(xì)胞亞群中表達(dá)，但在更大比例的 4-1BB-Hi 細(xì)胞中檢測(cè)到末盔。 TOX 和 ENTPD1（編碼 CD39）是兩種在腫瘤特異性 T 細(xì)胞中上調(diào)的耗竭標(biāo)志物，在 4-1BB-Hi 和循環(huán)細(xì)胞中也升高座慰。 在與 ENTPD1 相反的模式中陨舱，觀察到 IL7R 和 STAT4 在細(xì)胞亞群中的表達(dá)，這兩個(gè)基因與 T 細(xì)胞壽命和記憶相關(guān)版仔，在與黑色素瘤中 ICB 反應(yīng)相關(guān)的細(xì)胞群中上調(diào)游盲。

對(duì)黑色素瘤模型的研究表明，腫瘤浸潤(rùn)性 CD8+ T 細(xì)胞包括一個(gè)祖細(xì)胞耗盡的population蛮粮，該population長(zhǎng)期存在益缎，對(duì)抗 PD-1 治療有反應(yīng)，并最終分化為最終耗盡的細(xì)胞然想。 這種 CD8+ T 細(xì)胞群在治療前活檢中的頻率預(yù)測(cè)了用 ICB 治療的黑色素瘤的積極臨床結(jié)果莺奔。 為了確定在 RCC 中恢復(fù)的任何 CD8+ T 細(xì)胞亞群是否類似于這種祖細(xì)胞耗盡的表型，對(duì)單個(gè)細(xì)胞的祖細(xì)胞和最終耗盡的基因特征進(jìn)行了評(píng)分变泄。 發(fā)現(xiàn)祖細(xì)胞耗盡的特征在 4-1BB-Lo clusters內(nèi)的一個(gè)細(xì)胞子集中富集令哟。 相反，在其他 CD8+ T 細(xì)胞群中妨蛹，terminally exhausted的特征升高屏富。

確定了 RCC 中的候選 CD8+ T 細(xì)胞亞群與之前描述的祖細(xì)胞衰竭群體有一些相似之處，接下來(lái)檢查了基于 ICB exposure的表達(dá)差異蛙卤。在 CD8+ T 細(xì)胞亞群中狠半，發(fā)現(xiàn) PDCD1、TIGIT 和 HAVCR2 在 ICB exposure的活檢中僅在 4-1BB-Lo cluster內(nèi)顯著上調(diào)颤难，這是由響應(yīng)驅(qū)動(dòng)的效應(yīng)神年。在效應(yīng)分子中，觀察到 4-1BB-Lo 和 4-1BB-Hi population中 GZMB行嗤、PRF1 和 IFNG 的 ICB exposure活檢組織中表達(dá)升高瘤袖，但只有 4-1BB-Lo 細(xì)胞上調(diào) GZMA 和 FASLG。同樣昂验，只有 4-1BB-Lo 細(xì)胞上調(diào)了許多共刺激分子和趨化因子捂敌。相反，來(lái)自 ICB exposure活組織檢查的 4-1BB-Lo 細(xì)胞下調(diào)了與祖細(xì)胞衰竭表型相關(guān)的幾個(gè)基因既琴，暗示可能向更終末期衰竭狀態(tài)分化占婉。在黑色素瘤模型中，多功能祖細(xì)胞耗盡的 CD8+ T 細(xì)胞在響應(yīng)抗 PD1 期間分化為更終末耗盡的表型甫恩，而后者population主要負(fù)責(zé)腫瘤殺傷逆济，盡管壽命很短。在隊(duì)列中接觸 ICB 的患者的 4-1BB-Lo 細(xì)胞中，觀察到與來(lái)自無(wú)反應(yīng)者的細(xì)胞相比奖慌，來(lái)自反應(yīng)者的細(xì)胞中最終耗盡的基因特征顯著富集抛虫。

為了驗(yàn)證在未配對(duì)活檢中觀察到的這些現(xiàn)象，檢查了接受抗 PD-1 抗體 nivolumab 單藥治療的更大隊(duì)列患者 (Checkmate 009)简僧，這些患者可以使用Longitudinal治療前和治療中bulk轉(zhuǎn)錄組建椰。在這些配對(duì)活檢中，觀察到治療樣本中表達(dá)特征的水平顯著增加岛马，該表達(dá)特征源自比較來(lái)自我們單細(xì)胞隊(duì)列的 ICB exposure與 ICB 幼稚 4-1BB-Lo 細(xì)胞棉姐。一致地，治療樣本表現(xiàn)出更高水平的共抑制（例如啦逆，PDCD1伞矩、LAG3）和效應(yīng)分子（例如，IFNG夏志、PRF1）乃坤。這些發(fā)現(xiàn)與 RCC 中可能存在的 4-1BB-Lo CD8+ T 細(xì)胞亞群一致，但并未明確證實(shí)沟蔑，這些細(xì)胞亞群對(duì)抗 PD1 治療的反應(yīng)機(jī)制類似于在基于黑色素瘤和慢性病毒感染棍弄。Longitudinal單細(xì)胞研究對(duì)于明確檢測(cè)個(gè)體患者中亞群特異性治療相關(guān)分化是必要的囤躁。

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Shift toward inflammation in tumor-associated macrophages

除了適應(yīng)性免疫外，先天免疫系統(tǒng)在腫瘤存活和治療抵抗中起著關(guān)鍵作用。 特別是丸逸，據(jù)報(bào)道痢掠，腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞 (TAM) 在腫瘤微環(huán)境中發(fā)揮著多種相反的作用仓技，其不同的表型促進(jìn)炎癥施禾、腫瘤生長(zhǎng)、血管生成和轉(zhuǎn)移以及癌細(xì)胞殺傷宣蠕。 在 ccRCC 中例隆，TAM 是多種多樣的，mass cytometry with worse識(shí)別出 17 種表型和高骨髓炎癥抢蚀，這與抗 PD-1 治療的較差結(jié)果相關(guān)镀层。 因此，試圖描述隊(duì)列中的骨髓細(xì)胞及其對(duì)治療的反應(yīng)皿曲。

這里提取了基于標(biāo)記表達(dá)從完整數(shù)據(jù)集中識(shí)別出的骨髓細(xì)胞唱逢，并對(duì)它們進(jìn)行亞聚類，識(shí)別出兩個(gè)樹突細(xì)胞clusters（CLEC9A+ 和 CD1c+ 經(jīng)典樹突細(xì)胞）屋休、兩個(gè)單核細(xì)胞clusters（經(jīng)典 CD16- 和 CD16+ 單核細(xì)胞）和五個(gè)clusters TAMs 表達(dá)了多種免疫調(diào)節(jié)基因坞古。這些細(xì)胞群的比例在患者之間和整個(gè) ICB exposure狀態(tài)下是穩(wěn)定的。將巨噬細(xì)胞簡(jiǎn)單的 M1/M2 二分法分別分為促進(jìn)炎癥和傷口愈合/組織修復(fù)的表型劫樟，越來(lái)越多地被理解為不能完美地捕捉 TAM 表型的多樣性痪枫，事實(shí)上织堂，這里沒有觀察到 M1 和 M2 表達(dá)的干凈二分發(fā)標(biāo)記基因。一小部分 CXCL10-Hi TAM 特異性地表達(dá)了一組與經(jīng)典 M1 激活表型相關(guān)的基因奶陈。然而易阳，其他三個(gè)非循環(huán) TAM ulations exp在不同程度上表達(dá)了不同的 M2 相關(guān)基因。在高表達(dá) GPNMB 的 TAM populations中強(qiáng)有力地檢測(cè)到了多個(gè) M2 相關(guān)基因吃粒，此前有報(bào)道稱其在急性腎損傷小鼠模型中促進(jìn) M2 極化潦俺。一個(gè)單獨(dú)的 TAM 群具有 FOLR2 表達(dá)升高，典型地描述為標(biāo)記 M2 巨噬細(xì)胞声搁，expressed a distinct subset of M2-associated genes。最后一組 M1 和 M2 相關(guān)基因混合表達(dá)的 TAM 以 VSIR 的高表達(dá)為標(biāo)志捕发，VSIR 編碼 VISTA疏旨，一種 PD-1 同源物，作為抑制 T 細(xì)胞活化的陰性檢查點(diǎn)扎酷。

為了更好地了解這些不同的 TAM populations在 ICB 過(guò)程中所起的作用檐涝，分析檢查了它們的免疫檢查點(diǎn)基因和免疫相關(guān)轉(zhuǎn)錄程序的表達(dá)。 PD-L2 和（在較小程度上）PD-L1（兩者都是 PD-1 信號(hào)傳導(dǎo)介導(dǎo) T 細(xì)胞免疫檢查點(diǎn)的配體）在 TAM populations中很少檢測(cè)到法挨。 LGALS9谁榜、VSIG4 和 VSIR（其蛋白質(zhì)產(chǎn)物通過(guò)其他途徑促進(jìn) T 細(xì)胞免疫檢查點(diǎn)）以及可抑制巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的 SIGLEC10 被更廣泛地檢測(cè)到。比較 ICB-exposed 患者有無(wú)反應(yīng)凡纳，注意到表達(dá)模式發(fā)生了廣泛而顯著的變化窃植，表明在所有 TAM 和單核細(xì)胞populations中響應(yīng)干擾素信號(hào)轉(zhuǎn)為 M1 樣表型，CXCL10-Hi TAM 除外荐糜，它已經(jīng)顯示出 M1 極化的證據(jù)巷怜。同時(shí)，觀察到與巨噬細(xì)胞活性相關(guān)的表達(dá)特征的系統(tǒng)性增加暴氏，包括抗原呈遞和蛋白酶體功能延塑。總的來(lái)說(shuō)答渔，這些模式表明 ICB 應(yīng)答者的 TAM 廣泛轉(zhuǎn)變?yōu)榇傺妆硇凸卮@可能是由 CD8+ T 細(xì)胞產(chǎn)生的干擾素-g 誘導(dǎo)的。同時(shí)沼撕，還觀察到 ICB-exposed 與幼稚 TAM 中 CD8+ T 細(xì)胞免疫檢查點(diǎn)和巨噬細(xì)胞抗炎信號(hào)基因的系統(tǒng)性和顯著上調(diào)宋雏。這種影響大部分是由來(lái)自 ICB 反應(yīng)患者的 TAM 驅(qū)動(dòng)的，與來(lái)自無(wú)反應(yīng)者的細(xì)胞（所有 ICB 后評(píng)估）相比务豺，其 VSIR好芭、VSIG4、PD-L2 和 SIGLEC10 的表達(dá)水平進(jìn)一步增加冲呢。因此舍败，即使應(yīng)答者中的 TAM 表現(xiàn)出更多的促炎表型，它們也表現(xiàn)出可能抑制炎癥免疫微環(huán)境的表達(dá)變化，從而可能促進(jìn)最終對(duì) ICB 的抵抗邻薯。

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Two distinct cancer cell subpopulations

為了更好地了解癌細(xì)胞中活躍的可能驅(qū)動(dòng)與免疫系統(tǒng)相互作用的細(xì)胞程序裙戏，接下來(lái)試圖確定癌細(xì)胞之間的共享表達(dá)模式。 通過(guò)基因表達(dá)和拷貝數(shù)改變將細(xì)胞分類為惡性細(xì)胞厕诡。 將來(lái)自不同活檢的癌細(xì)胞組對(duì)齊累榜，以關(guān)注整個(gè)隊(duì)列中細(xì)胞程序的共享變異。 在活檢中灵嫌，細(xì)胞形成了兩個(gè)主要clusters壹罚，分別稱為腫瘤程序 1 (TP1) 和腫瘤程序 2 (TP2)，少數(shù)細(xì)胞以細(xì)胞周期進(jìn)展為特征寿羞。 TP1 和 TP2 細(xì)胞均從所有樣本中回收猖凛，除了一個(gè)癌細(xì)胞很少 (P912) 的樣本，與活檢部位或ICB exposure無(wú)關(guān)绪穆。

對(duì)來(lái)自兩個(gè)主要cluster的細(xì)胞的各種基因特征的活性進(jìn)行了評(píng)分辨泳，以識(shí)別它們轉(zhuǎn)錄差異背后的細(xì)胞程序。在不同的轉(zhuǎn)移部位玖院，TP1 細(xì)胞在腎臟形態(tài)發(fā)生菠红、粘附連接組裝和血管生成的基因組中得分較高。 TP2 細(xì)胞的特征在于代謝程序的巨大差異难菌，糖酵解和氧化磷酸化增加试溯，同時(shí)脂肪酸代謝增加。 TP2 細(xì)胞中氧化磷酸化和糖酵解基因的同時(shí)上調(diào)是出乎意料的郊酒，表明該腫瘤亞群的代謝升高耍共，這可能表明代謝可塑性允許隨機(jī)性的使用不同的能量途徑。這種混合代謝狀態(tài)下細(xì)胞的存在與預(yù)測(cè)高 HIF-1 活性下這種細(xì)胞狀態(tài)的理論模型一致猎塞，這在 RCC 中得到了很好的證實(shí)试读，在細(xì)胞系中的觀察將這種可塑性與轉(zhuǎn)移聯(lián)系起來(lái)。

接下來(lái)在 ICB 治療的背景下檢查了這些癌細(xì)胞程序?qū)γ庖呒?xì)胞的潛在影響荠耽。比較 ICB 反應(yīng)者和無(wú)反應(yīng)者钩骇，癌細(xì)胞群都上調(diào)了與干擾素-g 反應(yīng)和主要組織相容性復(fù)合物 (MHC) I 類抗原加工相關(guān)的基因，表明反應(yīng)者對(duì)促炎癥微環(huán)境有反應(yīng)铝量。然而倘屹，ICB 處理的癌細(xì)胞也上調(diào)了幾個(gè) T 細(xì)胞檢查點(diǎn)分子，在兩個(gè)群體中具有不同的模式慢叨。 TP1 細(xì)胞在治療后強(qiáng)烈上調(diào) nectin-2纽匙，而 TP2 細(xì)胞在幾個(gè)檢查點(diǎn)分子的表達(dá)中具有更溫和的增加。比較 ICB 反應(yīng)者和無(wú)反應(yīng)者拍谐，TP2 細(xì)胞表現(xiàn)出更顯著的差異烛缔，廣泛上調(diào)大量 T 細(xì)胞檢查點(diǎn)分子和參與減少巨噬細(xì)胞炎癥和逃避吞噬作用的分子馏段。在隊(duì)列的一個(gè)更同質(zhì)的子集中概括了分析的發(fā)現(xiàn)〖桑總之院喜，結(jié)果表明微環(huán)境中許多細(xì)胞群之間存在復(fù)雜的相互作用，兩種癌細(xì)胞群在 ICB 治療期間向 CD8+ T 細(xì)胞和 TAM 呈現(xiàn)不同的免疫抑制信號(hào)晕翠。

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TP1 cancer expression program associated with improved survival

TP1 和 TP2 癌細(xì)胞在腎臟分化喷舀、代謝和免疫抑制信號(hào)傳導(dǎo)方面的差異促使我們?cè)谝粋€(gè)大型前瞻性隊(duì)列中研究它們是否在疾病進(jìn)展和治療抵抗中發(fā)揮不同的作用。分析生成了描述 TP1 和 TP2 的基因特征淋肾，并將這些特征限制在癌細(xì)胞特異性基因上硫麻。利用scRNA-seq 數(shù)據(jù)生成癌細(xì)胞特異性特征后，在一項(xiàng)比較 mTOR 抑制劑依維莫司和 nivolumab 的隨機(jī)臨床試驗(yàn) (Checkmate 025) 中對(duì)來(lái)自晚期 ccRCC 的預(yù)處理樣本的bulk RNA-seq 進(jìn)行評(píng)分樊卓。在多變量分析中觀察到治療前 TP1 評(píng)分與僅在接受 nivolumab 的患者中顯著改善的總體生存率之間存在關(guān)聯(lián)拿愧，盡管放射學(xué)反應(yīng)類別之間的評(píng)分水平?jīng)]有顯著差異。在一項(xiàng)包括來(lái)自雙臂建模治療組简识、TP1 評(píng)分和治療-TP1 交互項(xiàng)的患者的聯(lián)合分析中赶掖，觀察到 TP1 評(píng)分與納武單抗治療之間存在顯著的交互作用（p = 0.04感猛，Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)）七扰。這些結(jié)果表明，TP1 評(píng)分與生存率之間的關(guān)系是由癌癥-免疫相互作用驅(qū)動(dòng)的陪白。 TP2評(píng)分與生存率之間沒有顯著相關(guān)性颈走。然而，在接受 nivolumab 治療的患者中咱士，存活率下降與一組免疫檢查點(diǎn)和逃避基因的高表達(dá)有關(guān)立由，幾乎所有這些基因在 ICB 反應(yīng)者與非反應(yīng)者的 TP2 細(xì)胞中均顯著上調(diào)，盡管這些基因不是癌細(xì)胞特異性（pCox = 0.017）序厉。

為了更好地了解這兩個(gè)癌細(xì)胞程序的病因锐膜，評(píng)估了它們是否與潛在的基因組特征相關(guān)。 在 Checkmate 025 隊(duì)列中弛房，注意到 PBRM1 和 KDM5C 突變腫瘤的 TP1 評(píng)分增加道盏，而具有 9p21.3 缺失的腫瘤的 TP2 評(píng)分增加，這些缺失與 ICB 抗性相關(guān)文捶。 TP1 評(píng)分與 PBRM1 突變和 TP2 評(píng)分與 9p21.3 缺失的關(guān)聯(lián)在 TCGA KIRC 隊(duì)列中得到證實(shí)荷逞。 在 ICB 治療的 Checkmate 025 患者中，當(dāng)將 PBRM1 突變狀態(tài)作為協(xié)變量時(shí)粹排，TP1 評(píng)分仍然與增加的生存率顯著相關(guān)种远。 結(jié)合觀察與 KDM5C 和拷貝數(shù)改變的關(guān)聯(lián)，這表明 TP1 捕獲了與單基因突變以外的基因組改變相關(guān)的轉(zhuǎn)錄模式顽耳。

Checkmate 025 ICB 手臂的生存益處促使進(jìn)一步研究癌細(xì)胞亞群和免疫細(xì)胞之間的相互作用坠敷。使用源自我們數(shù)據(jù)集的細(xì)胞類型表達(dá)特征檢查了在 Checkmate 025（納武單抗組）中推斷的 CIBERSORTx 免疫細(xì)胞群豐度妙同。在 TP1 評(píng)分較高的腫瘤中，觀察到 4-1BB-Lo CD8+ T 細(xì)胞的推斷豐度增加常拓，早期指出 ICB 治療期間效應(yīng)分子表達(dá)的顯著上調(diào)以及與促進(jìn)黑色素瘤中 ICB 反應(yīng)的祖細(xì)胞耗盡細(xì)胞的相似性渐溶。盡管對(duì)大量隊(duì)列中相關(guān)免疫細(xì)胞群豐度的計(jì)算推斷具有挑戰(zhàn)性，但這些發(fā)現(xiàn)支持癌細(xì)胞中 TP1 表達(dá)程序與癌癥-免疫細(xì)胞相互作用介導(dǎo)的存活之間的關(guān)系弄抬【シ總的來(lái)說(shuō)，對(duì)具有不同免疫細(xì)胞相互作用的不同腫瘤亞群的觀察可能有助于解釋在大量 RNA-seq 中觀察到的不同 RCC clusters掂恕，包括異質(zhì)浸潤(rùn)的高血管生成腫瘤和非浸潤(rùn)的高代謝腫瘤拖陆。

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Cell-cell interactions within the tumor microenvironment

鑒于在 ICB-exposed的 4-1BB-Lo CD8+ T 細(xì)胞中觀察到 IFNG 上調(diào)、來(lái)自 ICB 應(yīng)答者的 TAM 中的免疫檢查點(diǎn)和逃避基因上調(diào)懊亡，以及不同的免疫調(diào)節(jié)癌細(xì)胞程序依啰，我們假設(shè)不同的細(xì)胞群參與復(fù)雜的串?dāng)_.為了識(shí)別可能的非細(xì)胞自主效應(yīng)，我們使用 CellPhoneDB 通過(guò)已知的受體-配體對(duì)識(shí)別不同細(xì)胞群之間的推定信號(hào)傳導(dǎo)店枣。兩種癌細(xì)胞群都被推斷為通過(guò)骨橋蛋白（由 SPP1 編碼）向表達(dá) CD44 的 CD8+ T 細(xì)胞發(fā)出信號(hào)速警，骨橋蛋白是一種抑制小鼠模型中 T 細(xì)胞活化的相互作用。同樣鸯两，兩種癌細(xì)胞群都表達(dá) MIF 和 CD47闷旧，向 TAM 上表達(dá)的 CD74 和 SIRPa 發(fā)出信號(hào)，分別促進(jìn) TAM 生長(zhǎng)因子分泌和抑制吞噬作用的相互作用钧唐。然而忙灼，只有 TP2 細(xì)胞被推斷為通過(guò) galectin-9（由 LGALS9 編碼）與 CD8+ T 細(xì)胞和 TAM 上表達(dá)的 TIM-3（由 HAVCR2 編碼）結(jié)合。通過(guò) TIM-3 發(fā)出的信號(hào)抑制 CD8+ 細(xì)胞毒性細(xì)胞活性钝侠，并在其他人類癌癥中誘導(dǎo) TAM 分泌生長(zhǎng)因子该园。此外，TP2 細(xì)胞表達(dá) nectin-2帅韧，它與 CD8+ T 細(xì)胞共抑制受體 TIGIT 結(jié)合里初。盡管這種計(jì)算機(jī)方法不能明確地建立相互作用，但它表明癌細(xì)胞對(duì) T 細(xì)胞和 TAM 進(jìn)行復(fù)雜調(diào)節(jié)的可能性忽舟。

還觀察到 CD8+ T 細(xì)胞和 TAM 之間相互作用的證據(jù)双妨。與來(lái)自 ICB 應(yīng)答者與無(wú)應(yīng)答者的 TAM 中干擾素應(yīng)答基因的上調(diào)一致，CellPhoneDB 推斷出由 CD8+ T 細(xì)胞產(chǎn)生的干擾素-g 對(duì) TAM 的調(diào)節(jié)萧诫。在 Checkmate 009 的 ICB 活組織檢查中斥难，標(biāo)準(zhǔn)化的 IFNG 水平與 CIBERSORTx 估計(jì)的 CXCL10-Hi TAM 分?jǐn)?shù)以及來(lái)自我們單細(xì)胞隊(duì)列中的 ICB 暴露與 ICB 幼稚 TAM 比較的表達(dá)特征密切相關(guān)。在相同的樣本中帘饶，觀察到在具有較高標(biāo)準(zhǔn)化 IFNG 表達(dá)的樣本中哑诊，免疫檢查點(diǎn)和逃避基因的表達(dá)同時(shí)增加，這與其他癌癥類型中報(bào)告的免疫抑制負(fù)反饋回路一致及刻。事實(shí)上镀裤，比較同一患者的 ICB 前和 ICB 上活檢竞阐，觀察到免疫檢查點(diǎn)和逃避特征以及成員基因（包括 VSIG4、PD-L2 和 SIGLEC10）的表達(dá)水平增加暑劝。其中一些基因由癌細(xì)胞和 TAM 表達(dá)骆莹，它們的起源無(wú)法在bulk轉(zhuǎn)錄組中破譯，但這些比較表明担猛，腫瘤微環(huán)境可能通過(guò)增加免疫抑制基因表達(dá)來(lái)適應(yīng) ICB 治療幕垦。

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DISCUSSION

為了研究免疫系統(tǒng)和癌癥對(duì)治療的反應(yīng)，在 ICB 之前或之后檢查了晚期 RCC 的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組傅联。 CD8+ T 細(xì)胞亞群在應(yīng)答者中被強(qiáng)烈激活并分化為最終耗盡的表型先改。這些細(xì)胞與在黑色素瘤中被描述為介導(dǎo) ICB 反應(yīng)的細(xì)胞具有相似性，并且可能對(duì)應(yīng)于被描述為 RCC 中干細(xì)胞樣 CD8+ T 細(xì)胞后代的群體蒸走。在 TAM 中仇奶，發(fā)現(xiàn)了一小部分促炎人群和多個(gè)其他人群，這些人群在 ICB 應(yīng)答者中響應(yīng)干擾素-g 信號(hào)傳導(dǎo)而一致地轉(zhuǎn)向促炎表型比驻。 ICB-exposed與 T 細(xì)胞檢查點(diǎn)分子表達(dá)和抗炎信號(hào)的增加有關(guān)该溯，這表明免疫系統(tǒng)適應(yīng)可能是治療抵抗的基礎(chǔ)。在癌細(xì)胞中别惦，發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)通過(guò)促血管生成狈茉、腎臟分化和代謝程序的表達(dá)而分化的群體。作為對(duì) ICB 的反應(yīng)步咪，代謝可塑性和分化程度較低的 TP2 癌細(xì)胞上調(diào)了許多免疫抑制基因论皆。雖然在隊(duì)列中通過(guò)活檢觀察到來(lái)自兩個(gè)群體的細(xì)胞益楼，但 TP1 癌癥計(jì)劃的增加與 ICB 的存活率增加有關(guān)猾漫，這表明癌癥-免疫串?dāng)_的差異在兩個(gè)群體之間起作用。

鑒于適度的活檢數(shù)量感凤，臨床異質(zhì)性對(duì)研究構(gòu)成挑戰(zhàn)悯周。幾乎所有接觸過(guò) ICB 的患者都接觸過(guò) TKI，因此觀察到的效果可能是由聯(lián)合用藥驅(qū)動(dòng)的陪竿。盡管如此禽翼，由于 TKI 和 ICB 聯(lián)合治療或序貫治療是標(biāo)準(zhǔn)治療，研究結(jié)果仍然與未來(lái)的工作相關(guān)族跛。 RCC 最常表現(xiàn)為 ccRCC闰挡，我們的數(shù)據(jù)集反映了這一點(diǎn)。盡管我們已經(jīng)明確關(guān)注在患者中發(fā)現(xiàn)的表達(dá)程序礁哄，但需要對(duì)其他組織學(xué)進(jìn)行詳細(xì)研究长酗。我們?cè)诮y(tǒng)一處理的bulk 測(cè)序臨床試驗(yàn)隊(duì)列中驗(yàn)證了我們的發(fā)現(xiàn)，其中包括縱向 ICB 前后活檢桐绒。盡管如此夺脾，bulk RNA-seq 受到未知細(xì)胞類型混合物的限制之拨，因此未來(lái)的工作應(yīng)集中在使用單細(xì)胞方法的大量配對(duì) ICB 初治和 ICB 抗性活檢上。多重成像分析可以闡明在 RCC 中普遍存在的串?dāng)_機(jī)制咧叭∈辞牵考慮到 TAM 和癌細(xì)胞中免疫抑制基因的上調(diào)，這尤其緊迫菲茬，這可能最終導(dǎo)致耐藥性吉挣。

Our findings highlight the importance of studying immunomodulatory pathways away from the PD-1 axis, including T cell inhibition by VISTA expressed by both TAMs and cancer cells。Targeting the CD47/SIRPa axis with anti-CD47 antibodies, perhaps in conjunction with anti-PD-1 therapy, may promote macrophage phagocytosis of TP2 cells, which upregulate a broad range of immunosuppressive genes in ICB responders. These investigations are urgent now that ICB is a standard of care, and our findings provide a path toward identifying therapeutic targets and combinations to combat treatment resistance.

Methods

Identification of cancer cells（基因 + inferCNV）

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Receptor-ligand interaction inference

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生活很好婉弹，有你更好