hello，周三了屠升，又是新的一周潮改，但是內(nèi)心29周歲而立之年的焦慮始終揮之不去，甚至害怕孤獨(dú)終身的感覺(jué)腹暖，??汇在，阿甘正傳有一句臺(tái)詞，“你以后想成為什么樣的人脏答？” “什么意思糕殉，難道我以后就不能成為我自己了嗎亩鬼？”，希望大家都能成為內(nèi)心的自己阿蝶。
好了雳锋，又到了我們單細(xì)胞空間聯(lián)合分析的時(shí)間了，今天分享的文獻(xiàn)在Single-nucleus RNA Sequencing and Spatial Transcriptomics Reveal the Immunological Microenvironment of Cervical Squamous Cell Carcinoma,希望單細(xì)胞空間能給我們帶來(lái)醫(yī)療上新的突破羡洁。
Abstract
如今玷过，晚期浸潤(rùn)性宮頸癌的有效治療仍然具有挑戰(zhàn)性。本文采用單核 RNA 測(cè)序 (snRNA-seq) 和 SpaTial Enhanced REsolution Omics-sequencing (Stereo-seq) 技術(shù)研究宮頸鱗狀細(xì)胞癌 (CSCC) 的免疫微環(huán)境焚廊，這是一種主要類型的宮頸癌冶匹。除 LGALS9 和 IDO1 外习劫，CSCC 腫瘤和炎癥區(qū)域中大多數(shù)免疫檢查點(diǎn)基因的表達(dá)水平均不顯著高于非癌癥樣本中的表達(dá)水平咆瘟。 CD56+ NK細(xì)胞和未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞在高代謝腫瘤區(qū)信號(hào)較強(qiáng)，而在低代謝腫瘤區(qū)發(fā)現(xiàn)更多嗜酸性粒細(xì)胞诽里、未成熟B細(xì)胞和Treg細(xì)胞袒餐。此外，在一些腫瘤周圍發(fā)現(xiàn)了一組癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞 (CAF)谤狡，它們高度表達(dá) ACTA2灸眼、POSTN、ITGB4 和 FAP墓懂。 CAFs可能通過(guò)抑制淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)和重塑腫瘤細(xì)胞外基質(zhì)來(lái)支持腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移焰宣。此外，CAF 與 CSCC 患者較差的生存概率相關(guān)捕仔，并且可能存在于一小部分 (~20%) 晚期癌癥患者中匕积。總的來(lái)說(shuō)榜跌，這些發(fā)現(xiàn)可能會(huì)增強(qiáng)對(duì) CSCC 免疫微環(huán)境的理解闪唆，并為晚期 CSCC 的治療提供一些啟示。
Introduction
宮頸癌是影響全球女性健康的第四大常見(jiàn)癌癥钓葫，尤其是在低收入和中等收入地區(qū)悄蕾。目前，超過(guò) 12 種人乳頭瘤病毒 (HPV) 具有致癌性础浮。其中帆调，HPV16 占 60%-70% 宮頸癌病例，尤其是宮頸鱗狀細(xì)胞癌（CSCC）豆同。 自2018年以來(lái)番刊，世界衛(wèi)生組織（WHO）呼吁全球消除宮頸癌，量化疫苗接種诱告、篩查和疾病治療/管理等方面的行動(dòng)撵枢，這需要各方共同努力數(shù)十年民晒。
雖然早期宮頸癌接受根治性子宮切除術(shù)可以達(dá)到良好的預(yù)后，但晚期宮頸癌的5年總生存率或無(wú)病生存率并不理想锄禽。目前潜必，化療（如紫杉醇、順鉑沃但、貝伐單抗等）放療仍是轉(zhuǎn)移性或復(fù)發(fā)性患者的主要姑息治療磁滚，緩解率低（48%），生存期短（17個(gè)月）宵晚。免疫療法通過(guò)逆轉(zhuǎn)耗盡或抑制的免疫活動(dòng)育苟，為治療無(wú)法治愈的宮頸癌帶來(lái)了新的希望。針對(duì)程序性細(xì)胞死亡 1 (PD1)派任、程序性細(xì)胞死亡配體 1 (PD-L1) 和細(xì)胞毒性 T 淋巴細(xì)胞抗原 4 (CTLA4) 的免疫檢查點(diǎn)阻斷 (ICB) 藥物目前正在針對(duì)復(fù)發(fā)性/轉(zhuǎn)移性宮頸癌進(jìn)行試驗(yàn)赶诊。不幸的是，對(duì) ICB 治療的總體反應(yīng)率很低逸贾，從 4% 到 26% 不等陨仅。闡明 CSCC 的免疫狀況，尤其是 TME 中的免疫抑制狀態(tài)铝侵，可能有助于我們更好地解決這一現(xiàn)象并調(diào)整我們對(duì)宮頸癌的治療策略.
單細(xì)胞測(cè)序和空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)是揭示腫瘤細(xì)胞異質(zhì)性和微環(huán)境的最先進(jìn)工具灼伤，但這些技術(shù)在 CSCC 研究中的應(yīng)用仍然有限。 在這項(xiàng)研究中咪鲜，收集了 20 名個(gè)體的宮頸樣本狐赡，并結(jié)合單核 RNA 測(cè)序 (snRNA-seq) 和 SpaTial 增強(qiáng) REsolution 組學(xué)測(cè)序 (Stereo-seq) 技術(shù)來(lái)研究 CSCC 的免疫學(xué)特征。 破譯 CSCC 的免疫微環(huán)境將為晚期 CSCC 的治療提供新的見(jiàn)解疟丙，這可能會(huì)加速宮頸癌的消除颖侄。
Results
snRNA-seq data revealed the cellular composition of CSCC
為了充分表征宮頸組織的細(xì)胞組成，收集了 5 名患者的 CSCC 樣本進(jìn)行 snRNA-seq隆敢。共有 67,003 個(gè)細(xì)胞和 30,996 個(gè)基因通過(guò)質(zhì)量控制发皿，根據(jù)典型細(xì)胞標(biāo)記物從中鑒定出 14 種細(xì)胞類型，包括癌細(xì)胞（6,960）拂蝎、柱狀上皮細(xì)胞（CEC穴墅，22,396）、內(nèi)皮細(xì)胞（6,340）温自、平滑肌細(xì)胞(4,502)玄货、成纖維細(xì)胞 (9,836)、B 細(xì)胞 (689)悼泌、單核細(xì)胞 (5,281)松捉、T 細(xì)胞 (4,930)、調(diào)節(jié)性 T (Treg) 細(xì)胞 (1,081)馆里、漿細(xì)胞 (3,236)隘世、髓樣樹(shù)突狀細(xì)胞 (DC) (955) )可柿、漿細(xì)胞樣 DC (272)、肥大細(xì)胞 (384) 和自然殺傷 (NK) 細(xì)胞 (141)丙者。子宮頸在其表面包含兩種類型的細(xì)胞复斥，在外宮頸上具有分層的鱗狀上皮細(xì)胞，在宮頸內(nèi)膜和隱窩上具有簡(jiǎn)單的柱狀上皮細(xì)胞械媒。鱗狀上皮細(xì)胞發(fā)育異常導(dǎo)致CSCC目锭。因此，癌細(xì)胞主要表達(dá)鱗狀細(xì)胞的已知CSCC相關(guān)基因SERPINB3（Serpin家族B成員3）纷捞、腫瘤基因TP63痢虹、CDKN2A和角蛋白基因KRT15。由于組織主要來(lái)自晚期癌癥患者（FIGO IB2-IIIC1 期主儡；在化療前的宮頸活檢過(guò)程中收集了沒(méi)有分期信息的組織）奖唯，因此很少分離出正常的上皮鱗狀細(xì)胞。將 snRNA-seq 讀數(shù)與高風(fēng)險(xiǎn) HPV 參考基因組作圖顯示缀辩，癌細(xì)胞中存在病毒基因臭埋。還發(fā)現(xiàn)了一大群柱狀上皮細(xì)胞，它們高度表達(dá) MUC5B 和 WFDC2臀玄。這種細(xì)胞類型主要位于子宮頸上皮，但也可以出現(xiàn)在成人子宮頸和一些腺體的鱗柱交界處畅蹂。平滑肌細(xì)胞健无、成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞是構(gòu)成宮頸基質(zhì)的主要細(xì)胞類型。平滑肌細(xì)胞高表達(dá)MYH11液斜、MYLK累贤、ACTG2、COL3A1和COL1A1少漆，成纖維細(xì)胞除COL3A1和COL1A1外高表達(dá)LAMA2臼膏，而內(nèi)皮細(xì)胞可通過(guò)EMCN、FLT1和EGFLT的高表達(dá)來(lái)區(qū)分示损。除了子宮頸的結(jié)構(gòu)細(xì)胞外渗磅，還鑒定了多種免疫細(xì)胞類型，其中單核細(xì)胞（ITGAX检访、MX4A7）始鱼、T 細(xì)胞（CD3E、CD247）和漿細(xì)胞（MZB1脆贵、IGKC）最為豐富医清。簡(jiǎn)而言之，snRNA-seq 數(shù)據(jù)揭示了 CSCC 組織的結(jié)構(gòu)和免疫細(xì)胞組成卖氨，有助于使用特定細(xì)胞基因表達(dá)譜進(jìn)行下游空間轉(zhuǎn)錄組分析会烙。
Spatial transcriptomic characterization of CSCC
空間信息對(duì)于理解組織中的細(xì)胞-細(xì)胞相互作用至關(guān)重要负懦，不幸的是，snRNA-seq 數(shù)據(jù)中缺少這些信息柏腻。因此密似，我們利用 Stereo-seq 來(lái)獲取原位基因表達(dá)譜。包含捕獲探針的 Stereo-seq 芯片包含 25bp 坐標(biāo)標(biāo)識(shí)條形碼葫盼、10bp 分子標(biāo)識(shí)條形碼和 22bp 用于 mRNA 雜交的 polyT 尾残腌。獲得來(lái)自 2 名非癌癥患者和 14 名 CSCC 患者的宮頸樣本并將其嵌入 OCT。從每個(gè) OCT 塊中解剖 10 μm 厚的連續(xù)冷凍切片贫导，用于立體序列抛猫、蘇木精和伊紅 (H&E) 染色和免疫組織化學(xué) (IHC) 染色。最終孩灯，總共成功獲得了 18 張 Stereo-seq 載玻片闺金。其中包括來(lái)自 2 名非癌癥患者的 3 張載玻片和來(lái)自 14 名 CSCC 患者的 15 張載玻片。因?yàn)闃颖径紒?lái)自不同的解剖部位峰档，所以它們都被包括在內(nèi)以彌補(bǔ)樣本量小败匹。 Stereo-seq 芯片中的捕獲點(diǎn)直徑為 220 nm，兩個(gè)相鄰點(diǎn)之間的中心距為 500 nm讥巡。捕獲點(diǎn)被分組到bin中掀亩，以包含足夠的基因以進(jìn)行準(zhǔn)確的聚類。初步分析顯示欢顷，腫瘤區(qū)域的 RNA 豐度遠(yuǎn)高于基質(zhì)區(qū)域槽棍。為了平衡腫瘤和基質(zhì)之間的表達(dá)差異，在 bin 100（100 x 100 點(diǎn)）處對(duì) CSCC Stereo-seq 載玻片進(jìn)行了注釋抬驴，以充分展示組織組成炼七，其覆蓋面積約為 49.72 x 49.72 μm。 CSCC Stereo-seq 載玻片的每個(gè) bin 的平均基因數(shù)范圍為 1,767 到 4,152布持。由于來(lái)自非癌癥患者的三張 Stereo-seq 載玻片的基因表達(dá)強(qiáng)度低于 CSCC 載玻片豌拙，因此它們?cè)?bin 200 (99.72 x 99.72 μm) 處進(jìn)行了注釋。統(tǒng)一流形逼近和投影 (UMAP) 分析表明题暖，CSCC 和非癌癥的 bin cluster 傾向于相互分離按傅，而 CSCC 的 bin 集群則表現(xiàn)出一定的收斂性.
考慮到癌組織的復(fù)雜結(jié)構(gòu)，根據(jù)專業(yè)病理學(xué)評(píng)估（基于 H&E 和 IHC 染色結(jié)果）和標(biāo)記基因表達(dá)模式手動(dòng)進(jìn)行 Stereo-seq 載玻片的初始注釋芙委。在CSCC 樣本中通常鑒定出六種類型的組織clusters逞敷，包括腫瘤、間質(zhì)（無(wú)明顯炎癥）灌侣、炎癥（具有彌漫性炎癥或局灶性炎癥的間質(zhì)）推捐、腺體、血管和壞死侧啼。腫瘤牛柒、間質(zhì)和炎癥cluster廣泛分布在 CSCC 樣本的 Stereo-seq 載玻片中堪簿，某些樣本包含壞死、腺體和血管皮壁。根據(jù)基因表達(dá)譜椭更，組織clusters可以進(jìn)一步劃分為帶有數(shù)字后綴的subclusters。應(yīng)該記住蛾魄，空間clusters實(shí)際上是定義區(qū)域內(nèi)的細(xì)胞的混合虑瀑，但由其主要特征決定。例如滴须，腫瘤clusters并非純粹由癌細(xì)胞組成舌狗，但也可能包含其他細(xì)胞類型，但數(shù)量很少扔水，如免疫細(xì)胞痛侍、成纖維細(xì)胞等。組織特異性基因也顯示出空間模式魔市。癌性鱗狀細(xì)胞相關(guān)基因如 KRT5主届、CDKN2A 和 SERPINB3 主要富集在 Stereo-seq 腫瘤區(qū)域，IGKC 和 IGLC2 富集在炎癥區(qū)域待德，VIM 在基質(zhì)區(qū)域君丁，ADRA2A 在血管中，MUC5B 在腺體中磅网。捐獻(xiàn) 15 份樣本的 14 名 CSCC 患者均為 HPV 陽(yáng)性谈截，其中 85.7%（12/14）感染 HPV16，7.1%（1/14）感染 HPV33涧偷，7.1%（1/14）感染 HPV58。 HPV讀數(shù)覆蓋了病毒基因組的8% - 100%（約600bp - 7905bp）毙死，主要在腫瘤區(qū)域進(jìn)行鑒定燎潮。空間可視化展示了同一樣本不同腫瘤部位病毒基因的不同捕獲信號(hào)扼倘，經(jīng)常觀察到 E5确封、E6、E7 和 L1再菊。相反爪喘，在非 CSCC 樣本中僅鑒定出邊緣 HPV reads。一般來(lái)說(shuō)纠拔，在 Stereo-seq 腫瘤區(qū)域觀察到比其他區(qū)域更高的轉(zhuǎn)錄和翻譯活性秉剑、細(xì)胞增殖、氧化磷酸化和免疫反應(yīng)稠诲。 Stereo-seq 載玻片的初始手動(dòng)注釋用于輔助 TME 的下游分析侦鹏。
Variable immune inhibition in CSCC
關(guān)于 ICB 治療對(duì)宮頸癌的低反應(yīng)率诡曙，決定仔細(xì)研究 CSCC 的免疫狀況以尋找線索。在 snRNA-seq 和 Stereo-seq 數(shù)據(jù)中評(píng)估了具有不同免疫功能的三個(gè)基因組的表達(dá)譜略水，即共刺激价卤、細(xì)胞毒性/效應(yīng)和共抑制/耗竭。在單細(xì)胞水平渊涝，共刺激基因在先天免疫和適應(yīng)性免疫細(xì)胞中均有表達(dá)慎璧，特別是在 Treg、T 和 NK 細(xì)胞中跨释。發(fā)現(xiàn) Treg 細(xì)胞高度表達(dá) CD27胸私、CD28、CD40LG煤傍、ICOS盖文、TNFRSF18、TNFRSF4 和 TNFRSF9蚯姆。雖然這些基因是 Treg 細(xì)胞成熟和正常抑制功能所必需的五续，但 Treg 細(xì)胞中 CD27 的過(guò)表達(dá)可能會(huì)抑制抗腫瘤免疫反應(yīng)。在空間上龄恋，共刺激基因傾向于富集在腫瘤和炎癥區(qū)域疙驾。特別是，TNFRSF18（也稱為糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的TNF受體郭毕，GITR）在炎癥和腫瘤區(qū)域普遍表達(dá)它碎。然而，它的表達(dá)也在非癌癥樣本的上皮細(xì)胞中上調(diào)显押。在snRNA-seq 數(shù)據(jù)中扳肛，該基因主要在 Treg、NK乘碑、T 細(xì)胞和肥大細(xì)胞中檢測(cè)到挖息。盡管 TNFRSF18 與腫瘤中 Treg 細(xì)胞的免疫抑制有關(guān)，但其高空間表達(dá)水平可能是由多種類型的免疫細(xì)胞共同促成的兽肤。免疫細(xì)胞毒/效應(yīng)基因主要由 T 和 NK 細(xì)胞表達(dá)套腹，其中一些在 Stereo-seq 載玻片中的炎癥和腫瘤區(qū)域通常上調(diào)，包括 GNLY资铡、GZMA电禀、GZMB 和 NKG7。這些基因主要由 NK 細(xì)胞表達(dá)笤休，表明它們?cè)卺槍?duì) CSCC 的細(xì)胞毒性反應(yīng)中的重要作用尖飞。對(duì)于共抑制/耗竭基因，未能在我們的 Stereo-seq 數(shù)據(jù)中檢測(cè)到 CTLA4 和 PD-1 的任何顯著表達(dá)，盡管 CTLA4 可以由 Treg 細(xì)胞高度表達(dá)葫松，而 PD-1 可以由 Treg瓦糕、T 和 NK 細(xì)胞高度表達(dá). PD-L1 主要由漿細(xì)胞樣 DCs 表達(dá)，僅在一小部分 Stereo-seq 樣本的腫瘤或炎癥區(qū)域過(guò)表達(dá)腋么。雖然 CD276咕娄、ENTPD1、IDO1珊擂、LGALS9 和 VSIR 通常在 Stereo-seq 樣本中檢測(cè)到圣勒，但與非癌癥樣本相比，CSCC 樣本中似乎只有 IDO1 和 LGALS9 具有更高和更廣泛的表達(dá)摧扇。這兩個(gè)基因都由 DCs 表達(dá)并且可以下調(diào)細(xì)胞毒性 T 細(xì)胞的活性圣贸。 IDO1 和 LGALS9 是否可以比 CTLA4 和 PD-L1 成為 ICB 治療 CSCC 的更好靶點(diǎn)仍有待探索。此外扛稽，當(dāng)放大檢查同一張 Stereo-seq 載玻片中的免疫基因時(shí)吁峻，它們的表達(dá)在不同腫瘤區(qū)域之間可能會(huì)有很大差異。在樣品 TJH08 中在张，腫瘤區(qū)域通常表達(dá)高 IDO1用含、低 PD-L1 和非常低的 CTLA4。相比之下帮匾，樣品 TJH37201 中只有一個(gè)腫瘤區(qū)域表達(dá)了這些基因啄骇。總的來(lái)說(shuō)瘟斜，盡管 snRNA-seq 和 Stereo-seq 數(shù)據(jù)都顯示了 CSCC 患者免疫衰竭的證據(jù)缸夹，但患者之間和患者內(nèi)部的免疫微環(huán)境差異很大。
Metabolic statuses of tumors were associated with different immune responses
代謝可以調(diào)節(jié)腫瘤的免疫微環(huán)境螺句，這可能是癌癥治療的干預(yù)目標(biāo)虽惭。分別對(duì)六種途徑進(jìn)行了基因集變異分析（GSVA），包括缺氧蛇尚、乳酸趟妥、糖酵解、脂質(zhì)代謝佣蓉、磷酸戊糖和氧化磷酸化途徑。然后將上述六種途徑的GSVA評(píng)分的平均值計(jì)算為每個(gè)腫瘤區(qū)域的代謝評(píng)分亲雪。根據(jù) GSVA 代謝評(píng)分勇凭，排名前 20 位的 Stereo-seq 腫瘤clusters被歸類為高代謝腫瘤，排名后 20 位的腫瘤clusters為低代謝腫瘤义辕。一般來(lái)說(shuō)虾标，高代謝腫瘤在氧化磷酸化、糖酵解和乳酸途徑中表現(xiàn)出更高的活性灌砖，表明增殖的癌細(xì)胞中存在活躍的有氧糖酵解璧函，即 Warburg 效應(yīng)傀蚌。此外，高代謝腫瘤還伴有嚴(yán)重的缺氧和活躍的脂質(zhì)代謝蘸吓，表明快速生長(zhǎng)的腫瘤存在強(qiáng)烈的氧化和營(yíng)養(yǎng)應(yīng)激善炫。為了進(jìn)一步探索代謝和免疫反應(yīng)之間的關(guān)系，計(jì)算了高代謝和低代謝腫瘤區(qū)域內(nèi)每個(gè) bin 的不同免疫細(xì)胞的 GSVA 特征評(píng)分库继。根據(jù)每個(gè)腫瘤區(qū)域的平均特征評(píng)分箩艺，觀察到幾種細(xì)胞類型的顯著差異。 CD56+ NK 細(xì)胞和未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞在高代謝腫瘤區(qū)域顯示出比低代謝腫瘤區(qū)域更強(qiáng)的信號(hào)宪萄，表明高代謝腫瘤可能更容易與先天免疫反應(yīng)相關(guān)艺谆。同時(shí)，低代謝腫瘤區(qū)嗜酸性粒細(xì)胞拜英、未成熟B細(xì)胞和Treg細(xì)胞較多静汤，提示適應(yīng)性免疫反應(yīng)無(wú)效。兩個(gè) Stereo-seq 樣本 TJH34 和 TJH35 包含高代謝和低代謝腫瘤區(qū)域居凶。分別使用 TOP2A 和 MS4A1 作為癌細(xì)胞和 B 淋巴細(xì)胞的標(biāo)志物虫给，可視化代謝和 B 細(xì)胞分布之間的空間關(guān)聯(lián)。在低代謝腫瘤區(qū)域內(nèi)外檢測(cè)到傳播 MS4A1 表達(dá)排监，與 H&E 圖像中的淋巴細(xì)胞分布模式和 GSVA 特征評(píng)分一致狰右。
Identification of a cluster of cancer-associated fibroblasts (CAFs) in CSCC
在探索樣本 TJH34 中高代謝和低代謝腫瘤區(qū)域之間的免疫差異時(shí)，注意到高代謝腫瘤區(qū)域之外的獨(dú)特空間clusters舆床。這個(gè)clusters與大多數(shù)基質(zhì)clusters不同棋蚌，看起來(lái)像一條包圍腫瘤的絲帶。由于這個(gè)clusters是基質(zhì)的一部分挨队，仔細(xì)檢查了snRNA-seq 數(shù)據(jù)中的成纖維細(xì)胞谷暮。幸運(yùn)的是，從所有五個(gè)樣本中鑒定出一小組成纖維細(xì)胞盛垦，它們高度表達(dá)報(bào)告的 CAF 標(biāo)記基因湿弦，包括 ACTA2、POSTN腾夯、ITGB4 和 FAP颊埃。 CAF 的干性評(píng)分低于癌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，并且處于不同的細(xì)胞周期階段蝶俱“嗬基于標(biāo)志性基因集的功能富集表明，CAFs 與成纖維細(xì)胞和癌細(xì)胞具有共同的活性榨呆。 CAF 參與了成纖維細(xì)胞的類似途徑罗标，包括紫外線反應(yīng)下降、血管生成、肌生成和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化闯割。對(duì)于包括 p53 通路彻消、KRAS 信號(hào)通路、雌激素反應(yīng)宙拉、有絲分裂紡錘體宾尚、G2/M 檢查點(diǎn)和 E2F 靶點(diǎn)在內(nèi)的通路，CAF 顯示出與癌細(xì)胞相似的活性鼓黔。在基因水平上央勒，CAFs不僅高表達(dá)成纖維細(xì)胞的標(biāo)志基因，如膠原蛋白家族（COL1A1澳化、COL3A1崔步、COL4A1、COL5A2缎谷、COL6A3等）井濒，而且還高表達(dá)惡性鱗狀細(xì)胞的標(biāo)志基因，如KRT4列林、KRT13的角蛋白家族瑞你。盡管癌癥中的 CAF 可能具有不同的起源，但上皮特征表明 CSCC 樣本中 CAF 的起源可能與 EMT 相關(guān)希痴。
為了定位 CAF 在 CSCC 組織中的空間分布者甲，采用多模態(tài)交叉分析 (MIA) 方法(參考文章MIA用于單細(xì)胞和空間的聯(lián)合分析）整合 snRNA-seq 和 Stereo-seq 數(shù)據(jù)。簡(jiǎn)而言之砌创，該方法計(jì)算了由 snRNA-seq 數(shù)據(jù)識(shí)別的細(xì)胞類型特異性基因和由 Stereo-seq 數(shù)據(jù)表征的區(qū)域特異性基因的表達(dá)水平的重疊程度虏缸。得到的 p 值越小，在后面的描述中被稱為 MIA 分?jǐn)?shù)嫩实，定義的細(xì)胞類型和空間區(qū)域之間的相關(guān)性越強(qiáng)刽辙。最初的 MIA 結(jié)果表明，Stereo-seq 聚類結(jié)果符合相應(yīng)區(qū)域的預(yù)期細(xì)胞組成甲献。不幸的是宰缤，僅 MIA 評(píng)分并不能完全反映細(xì)胞的空間特異性，尤其是在 RNA 豐度較低的區(qū)域晃洒。因此慨灭，通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)與 CAF 相關(guān)的 POSTN 的高表達(dá)水平和 CAF 的高 MIA 分?jǐn)?shù)同時(shí)用于定義 CAF 的 Stereo-seq clusters。結(jié)果顯示球及，在 15 張 Stereo-seq 載玻片中的 4 張中缘挑，CAF 在某些腫瘤區(qū)域周圍富集，包括樣品 TJH34 的高代謝腫瘤區(qū)域桶略。通過(guò)使用相同樣本的連續(xù)組織切片對(duì) POSTN 進(jìn)行 IHC 染色，進(jìn)一步證實(shí)了 CSCC 中 CAF 的存在。值得注意的是际歼，并非所有的腫瘤區(qū)域都被 CAF 包圍惶翻，這讓我們對(duì)與這些細(xì)胞的存在相關(guān)的生物學(xué)差異感到好奇。
CAFs might facilitate the growth and metastasis of CSCC from diverse aspects
為了全面揭示 CAFs 在 CSCC 中的生物學(xué)功能鹅心，我們將 Stereo-seq 載玻片中的腫瘤區(qū)域分為兩種類型：被 CAFs 包圍的腫瘤區(qū)域（CAFs+ 腫瘤）和未被 CAFs 包圍的腫瘤區(qū)域（CAFs-腫瘤）吕粗。 發(fā)現(xiàn)三張 Stereo-seq 載玻片同時(shí)包含 CAFs+ 和 CAFs- 腫瘤區(qū)域，并用于下游分析旭愧。 然后颅筋，我們使用 3 個(gè)樣本的 CAFs+ 和 CAFs- 腫瘤區(qū)域之間上調(diào)和下調(diào)的 DEG (|Log2FC| > 1.28, P <0.05) 進(jìn)行 GO 富集分析。 結(jié)果表明输枯，CAFs+ 腫瘤在能量使用议泵、代謝、有絲分裂和細(xì)胞生長(zhǎng)方面比 CAFs- 腫瘤更活躍桃熄。 同時(shí)先口，CAFs+腫瘤中的細(xì)胞粘附、細(xì)胞凋亡和免疫反應(yīng)均被下調(diào)瞳收。 上述觀察結(jié)果與 CSCC 的免疫和代謝異質(zhì)性相吻合碉京，特別是在 TJH34 樣本中。 這些表明CAF的存在可能從不同方面支持腫瘤進(jìn)展螟深。
為了全面揭示 CAFs 在 CSCC 中的生物學(xué)功能谐宙，將 Stereo-seq 載玻片中的腫瘤區(qū)域分為兩種類型：被 CAFs 包圍的腫瘤區(qū)域（CAFs+ 腫瘤）和未被 CAFs 包圍的腫瘤區(qū)域（CAFs-腫瘤）。發(fā)現(xiàn)三張 Stereo-seq 載玻片同時(shí)包含 CAFs+ 和 CAFs- 腫瘤區(qū)域界弧，并用于下游分析凡蜻。然后，我們使用 3 個(gè)樣本的 CAFs+ 和 CAFs- 腫瘤區(qū)域之間上調(diào)和下調(diào)的 DEG (|Log2FC| > 1.28, P < 0.05) 進(jìn)行 GO 富集分析夹纫。結(jié)果表明咽瓷，CAFs+ 腫瘤在能量使用、代謝舰讹、有絲分裂和細(xì)胞生長(zhǎng)方面比 CAFs- 腫瘤更活躍茅姜。同時(shí)，CAFs+腫瘤中的細(xì)胞粘附月匣、細(xì)胞凋亡和免疫反應(yīng)均被下調(diào)钻洒。上述觀察結(jié)果與 CSCC 的免疫和代謝異質(zhì)性相吻合，特別是在 TJH34 樣本中锄开。這些表明 CAFs 的存在可能從不同方面支持腫瘤進(jìn)展素标。
接下來(lái)，計(jì)算了 993 個(gè)關(guān)于免疫基因集的個(gè)體 bin 的基因模塊表達(dá)分?jǐn)?shù)萍悴，以評(píng)估免疫細(xì)胞豐度头遭。結(jié)果顯示 CAFs+ 腫瘤中 B 細(xì)胞寓免、CD4 T 細(xì)胞、CD8 T 細(xì)胞计维、中性粒細(xì)胞袜香、DC、NK 細(xì)胞和 Th1 細(xì)胞的數(shù)量顯著減少鲫惶，表明 CAF 可能作為防止原免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的物理屏障蜈首。腫瘤區(qū)域。雖然在 CAFs+ 腫瘤區(qū)域發(fā)現(xiàn)了更多的腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞 (TAM)欠母，但 M1（腫瘤抑制）和 M2（腫瘤促進(jìn)）表型的分布卻相反欢策。由于樣本量小，巨噬細(xì)胞信號(hào)較弱赏淌，不確定不同表型的 CAF 和 TAM 之間的關(guān)系踩寇。
作為基質(zhì)的一部分，CAF 必須與癌細(xì)胞猜敢、基質(zhì)細(xì)胞和免疫細(xì)胞密切相互作用姑荷。事實(shí)上，對(duì) snRNA-seq 數(shù)據(jù)的分析顯示了 CAF 與其他細(xì)胞之間關(guān)于細(xì)胞外基質(zhì) (ECM) 形成和細(xì)胞間接觸的潛在相互作用缩擂。 CAFs高表達(dá)的膠原蛋白家族基因鼠冕，特別是COL1A1、COL1A2胯盯、COL4A1懈费、COL4A2、COL4A5博脑、COL6A1憎乙、COL6A2和COL6A3）可能與免疫細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞表達(dá)的CD44相互作用，可能參與細(xì)胞粘附和遷移叉趣。膠原蛋白還可能與癌細(xì)胞泞边、免疫細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)的整合素家族的不同成員相互作用。同樣疗杉，由 CAF 表達(dá)的 FN1（纖連蛋白 1阵谚，一種可溶性糖蛋白）和層粘連蛋白（LAMA2、LAMA3烟具、LAMA4梢什、LAMA5、LAMB1朝聋、LAMB2嗡午、LAMB3、LAMC1冀痕、LAMC3）也可能通過(guò)整合素與其他細(xì)胞類型相互作用荔睹。整合素是由α和β亞基組成的膜受體蛋白狸演，參與細(xì)胞粘附和識(shí)別。 CAFs 似乎使用不同的異二聚體形式的整合素來(lái)接觸其他細(xì)胞類型应媚。它們可能通過(guò)由α2β1严沥、α3β1和αvβ8亞基組成的整合素與癌細(xì)胞相互作用，而通過(guò)由α9β1中姜、α6β1和α1β1亞基組成的整合素與內(nèi)皮細(xì)胞、CEC跟伏、平滑肌細(xì)胞相互作用丢胚，并通過(guò)由亞基α9β1、α6β1和α1β1組成的整合素與T細(xì)胞和NK細(xì)胞相互作用受扳。由α1β1亞基組成的整合素携龟。重要的是，CAFs 可能利用 F11R（也稱為 JAM1勘高，連接粘附 313 分子 1）通過(guò) F11R 和 JAM3 與癌細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞形成緊密連接峡蟋，這可能會(huì)阻止免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)。 CAF 還可能表達(dá)其他基質(zhì)蛋白华望，包括 THBS1（血小板反應(yīng)蛋白 1）蕊蝗、THBS2 和 TNC（肌腱蛋白 C），通過(guò) CD44赖舟、整合素（α3β1）和 SDC1 與免疫細(xì)胞蓬戚、平滑肌細(xì)胞、癌細(xì)胞和漿細(xì)胞進(jìn)行交流宾抓。此外子漩，CAF 過(guò)表達(dá)幾種組織重塑因子，包括 POSTN（骨膜素石洗，一種分泌的 ECM 蛋白）幢泼、FAP（成纖維細(xì)胞活化蛋白，一種絲氨酸蛋白酶）讲衫、MMP1（基質(zhì)金屬蛋白酶 1）缕棵、TNC（肌腱蛋白-C，一種基質(zhì)蛋白）和LOXL1（賴氨酰氧化酶 1焦人，催化膠原蛋白和彈性蛋白的交聯(lián)）挥吵。這一證據(jù)表明 CAF 在塑造腫瘤細(xì)胞外環(huán)境中的關(guān)鍵作用。
除了它們?cè)?ECM 構(gòu)建中的作用外花椭，CAF 還可能通過(guò)過(guò)度表達(dá)包括 SEMA3C忽匈、POSTN、CXCL6 在內(nèi)的分泌因子來(lái)增強(qiáng)癌細(xì)胞的干性和增殖矿辽。據(jù)報(bào)道丹允，SEMA3C 可促進(jìn)癌癥干細(xì)胞維持郭厌、血管生成和侵襲。 POSTN 可以通過(guò)整合素 αvβ3 激活 Akt/PKB 通路來(lái)提高癌細(xì)胞的存活率雕蔽。它還可以通過(guò) PTK7-Wnt/β-Catenin 信號(hào)通路促進(jìn)癌癥生長(zhǎng)折柠。CXCL6（CXC 基序趨化因子配體 6），盡管主要與免疫相關(guān)響應(yīng)批狐，據(jù)報(bào)道促進(jìn)食管鱗狀細(xì)胞癌的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移扇售。CAFs 中的另一個(gè)高表達(dá)基因 SNAI2 (Slug)，一種蝸牛相關(guān)的鋅指轉(zhuǎn)錄因子嚣艇，可能抑制細(xì)胞凋亡并促進(jìn)癌癥進(jìn)展承冰。幾種常見(jiàn)的生長(zhǎng)因子CAFs也表達(dá)TGFB1（轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1）、EGF（表皮生長(zhǎng)因子）和VEGFA（血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A）食零。此外困乒，CAFs 中 LSD1（組蛋白賴氨酸去甲基化酶 1）的上調(diào)可能會(huì)抑制 IFN 激活以逃避免疫攻擊。CAFs 產(chǎn)生的 Wnt5a 信號(hào)蛋白也可能抑制免疫反應(yīng)以促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移贰谣∧嚷В總之，CAFs 可能能夠增強(qiáng) TME吱抚，促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展百宇。
The presence of CAFs was associated with poorer clinical statuses of CSCC
為了驗(yàn)證 CAF 的促腫瘤發(fā)生作用，首先使用來(lái)自癌癥基因組圖譜 (TCGA) 的數(shù)據(jù)集進(jìn)行生存分析频伤，該數(shù)據(jù)集包含 252 名 CSCC 患者恳谎。使用標(biāo)記基因集計(jì)算每個(gè) CSCC 患者的 CAF 的 GSVA 評(píng)分 ( ACTA2、POSTN憋肖、ITGB4 和 FAP）因痛。毫不奇怪，較高的 CAF 信號(hào)預(yù)示著不利的無(wú)進(jìn)展生存期（HR = 1.66, 95%CI = 1.03-2.67, P = 0.038）和總生存期（HR = 1.69, 95%CI= 1.00-2.84, P = 0.05）對(duì)于 CSCC 患者岸更。接下來(lái)鸵膏，使用獨(dú)立的樣本集測(cè)量了 CAF 的生物標(biāo)志物 POSTN 在基質(zhì)和腫瘤區(qū)域的表達(dá)水平，該樣本集由 65 個(gè)存檔的福爾馬林固定石蠟包埋 (FFPE) CSCC 樣本組成怎炊√菲螅基于染色強(qiáng)度和分布模式，為每個(gè)樣本分配了 POSTN 染色分?jǐn)?shù)评肆≌椋基質(zhì)中 POSTN 表達(dá)的總體陽(yáng)性（弱、中和強(qiáng)）率遠(yuǎn)高于腫瘤區(qū)域瓜挽。然而盹廷，只有 21.1% (14/65) 的 FFPE 樣本在腫瘤周圍的基質(zhì)中具有中度或強(qiáng)的 POSTN 染色【贸龋卡方檢驗(yàn)顯示俄占，基質(zhì)中 POSTN 的高表達(dá)水平與更晚期的病理分期管怠、更差的分化、更大的腫瘤大小缸榄、更高的外周血鱗狀細(xì)胞抗原（SCC）濃度和年齡顯著相關(guān)渤弛，這進(jìn)一步證實(shí)了CAF 的促腫瘤發(fā)生能力。
總的來(lái)說(shuō)甚带，我們的結(jié)果表明 CAF 是 CSCC TME 的重要組成部分她肯，形成了保護(hù)癌細(xì)胞免受免疫監(jiān)視和清除的屏障。 它們還可能有助于刺激細(xì)胞增殖和血管生成鹰贵，抑制細(xì)胞凋亡辕宏，并重建 ECM 以增強(qiáng)腫瘤轉(zhuǎn)移。
Discussion
盡管疫苗和根治性子宮切除術(shù)是預(yù)防和治療宮頸癌的有效措施砾莱，但復(fù)發(fā)/轉(zhuǎn)移性宮頸癌的治療仍然是實(shí)現(xiàn)消除宮頸癌目標(biāo)的一大障礙。 在此凄鼻，描述了結(jié)合 snRNA-seq 和 Stereo-seq 技術(shù)的 CSCC 的高分辨率免疫學(xué)lanscope腊瑟，這可能有助于 HPV 誘導(dǎo)的宮頸癌的管理和治療。
如今块蚌，ICB 療法闰非，尤其是那些使用 PD-L1/PD-1 和 CTLA4 抑制劑的療法，是治療轉(zhuǎn)移性宮頸癌的新方法之一峭范。幾項(xiàng)研究報(bào)道了 PD-L1 在宮頸癌中的廣泛表達(dá)财松，陽(yáng)性率從 34% 到 96% 不等。然而纱控，單獨(dú)的 PD-L1 表達(dá)與宮頸癌患者的疾病結(jié)果無(wú)關(guān)辆毡。事實(shí)上，對(duì) PD-1/PD-L1 和 CTLA-4 抑制劑的反應(yīng)率在不同的試驗(yàn)中波動(dòng)很大甜害，而且療效似乎與相關(guān)檢查點(diǎn)基因的表達(dá)狀態(tài)無(wú)關(guān)舶掖。在我們的研究中，除了 LGALS9 和 IDO1 外尔店，CSCC 腫瘤和炎癥區(qū)域中大多數(shù)免疫檢查點(diǎn)基因的表達(dá)水平不顯著高于非癌癥樣本中的表達(dá)水平眨攘。 LGALS9（即半乳糖凝集素 9）通過(guò)與 T 細(xì)胞表面的 Tim-3 結(jié)合或抑制 DC 的抗原呈遞能力來(lái)下調(diào)效應(yīng) T 細(xì)胞免疫。雖然顯示半乳糖凝集素 9 信號(hào)通路的破壞可誘導(dǎo)患有胰腺導(dǎo)管腺癌的小鼠的腫瘤消退嚣州，但在肺轉(zhuǎn)移小鼠模型中報(bào)告了相反的效果鲫售。 IDO1 主要在 DC 中表達(dá)，有助于將色氨酸降解為犬尿氨酸该肴，從而抑制 T 細(xì)胞功能情竹。發(fā)現(xiàn)抑制 IDO1 可以增強(qiáng) HeLa 和 SiHa 腫瘤球細(xì)胞的放射敏感性，表明 IDO1 抑制劑作為放射增敏劑的潛在應(yīng)用沙庐。靶向 LGALS9 和 IDO1 能否改善 CSCC 的治療需要進(jìn)一步探索鲤妥。我們的研究還揭示了代謝活性低的腫瘤區(qū)域的抑制性適應(yīng)性免疫佳吞，突出了代謝調(diào)節(jié)在 TME 中的關(guān)鍵作用。事實(shí)上棉安，最近的臨床試驗(yàn)已將檢查點(diǎn)抑制劑與針對(duì)葡萄糖底扳、氨基酸和核苷酸代謝的代謝藥物結(jié)合使用。更好地理解免疫反應(yīng)和新陳代謝之間的串?dāng)_將進(jìn)一步有利于癌癥治療贡耽。
CAF 已在多種類型的癌癥中得到表征衷模，并可分為不同的亞型。雖然細(xì)胞系研究暗示了 CAF 在宮頸癌細(xì)胞增殖中的支持作用蒲赂，但這是第一項(xiàng)系統(tǒng)描述 CSCC 臨床樣本中促腫瘤 CAF 的空間分布和生物學(xué)特性的研究阱冶。由于組織異質(zhì)性，CAFs 的標(biāo)記基因因癌癥而異滥嘴。在本研究中木蹬，ACTA2、POSTN若皱、ITGB4 和 FAP 是識(shí)別 CSCC 中 CAF 的充分標(biāo)記基因镊叁。其他基因如 KRT4、ITGA1走触、COL24A1 和 COL7A1 可能作為 CSCC 中 CAF 的互補(bǔ)標(biāo)記基因晦譬，它們顯示成纖維細(xì)胞和癌性鱗狀細(xì)胞的細(xì)胞特性。這些 CAF 對(duì) TME 的異質(zhì)性有顯著貢獻(xiàn)互广，TME 通過(guò)促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)敛腌、轉(zhuǎn)移和免疫逃避而顯示出促腫瘤發(fā)生表型。 CAFs+腫瘤增殖活躍惫皱，但缺乏淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)像樊。將這些免疫逃避腫瘤暴露于免疫系統(tǒng)對(duì)于根除癌細(xì)胞至關(guān)重要。然而逸吵，并非所有的 CSCC 樣本都呈 CAF 陽(yáng)性凶硅。 Stereo-seq 實(shí)驗(yàn)中只有 28.6% (4/14) 的 CSCC 患者顯示存在 CAF，而 IHC 實(shí)驗(yàn)中只有 21.1% (14/65) 的 FFPE 樣本對(duì) CAF 的生物標(biāo)志物 POSTN 呈陽(yáng)性扫皱。由于 CAF 往往與更高級(jí)的病理狀態(tài)相關(guān)足绅，因此它們可能在個(gè)體差異很大的浸潤(rùn)性癌癥患者中發(fā)揮作用。研究人員已嘗試使用抗體或抑制劑干擾 CAF 的激活韩脑、作用和正城饴瑁化過(guò)程，正在進(jìn)行幾項(xiàng)臨床試驗(yàn)段多。由于 CAF 高度表達(dá)的基因?qū)φ＝M織也是必不可少的首量，因此它們的功效和副作用需要密切監(jiān)測(cè)。
In conclusion, our data have demonstrated the high heterogeneity of viral gene expression, immune response, and metabolism in CSCC, indicating that combined drugs or therapies targeting multiple biological processes would be better practice to treat CSCC. Interventions on CAFs and tumor metabolism may complement the current treatments of CSCC. Further investigations into these biological aspects may facilitate the development of new drugs or therapies against CSCC and the other HPV-induced squamous cell carcinomas
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