學(xué)習(xí)一篇文獻(xiàn)：Onco-fetal Reprogramming of Endothelial Cells Drives Immunosuppressive Macrophages in Hepatocellular Carcinoma，2020年發(fā)表于Cell问慎，DOI號(hào)：https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.08.040。
概述: 人類肝臟從發(fā)育到疾病的單細(xì)胞圖譜表明，在胚胎肝臟和肝細(xì)胞癌中上枕，存在一個(gè)共享的腫瘤-胚胎生態(tài)系統(tǒng)驅(qū)動(dòng)免疫抑制米母。
In Brief: A single-cell atlas of human liver from development to disease suggests a shared onco-fetal ecosystem driving immunosuppression in fetal liver and hepatocellular carcinoma.
一個(gè)優(yōu)勢(shì)的腫瘤生態(tài)系統(tǒng)可以使惡性細(xì)胞在營(yíng)養(yǎng)剝奪和免疫選擇壓力下生存术健。腫瘤的不同區(qū)域可以代表由不同的腫瘤細(xì)胞劣像、基質(zhì)細(xì)胞尖啡、免疫細(xì)胞組成的腫瘤生態(tài)系統(tǒng)的異質(zhì)性橄仆。這種區(qū)域性腫瘤內(nèi)異質(zhì)性（ITH）可以促進(jìn)細(xì)胞間相互作用變化，影響臨床治療反應(yīng)衅斩。
腫瘤細(xì)胞具有表型可塑性（phenotypic plasticity）盆顾，促進(jìn)細(xì)胞多樣性和腫瘤進(jìn)化。有文獻(xiàn)證明畏梆，胚胎發(fā)育和腫瘤發(fā)生之間存在相似性您宪，印證了腫瘤細(xì)胞可以重編程和/或轉(zhuǎn)分化為癌癥干細(xì)胞樣細(xì)胞（CSC）的觀點(diǎn)。此外奠涌，已知一些惡性細(xì)胞表達(dá)胚胎發(fā)育特異性抗原宪巨，一個(gè)典型的例子是肝細(xì)胞癌（HCC）中表達(dá)甲胎蛋白（AFP）。以上溜畅，這些研究將惡性細(xì)胞的表型特征與早期發(fā)育聯(lián)系起來(lái)捏卓。
進(jìn)而引出本文的主題：生成一個(gè)全面的從發(fā)育到疾病的人類肝臟圖譜，在HCC中識(shí)別出一種全新的免疫抑制性“腫瘤-胚胎生態(tài)系統(tǒng)”慈格，在胚胎肝和HCC中共享基質(zhì)和免疫細(xì)胞類型以及信號(hào)成分怠晴。
肝癌的多區(qū)域單細(xì)胞圖譜
為理解肝癌中腫瘤生態(tài)系統(tǒng)的復(fù)雜性以及惡性細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞和免疫細(xì)胞之間的動(dòng)態(tài)相互作用浴捆，對(duì)14個(gè)肝癌病人（ 其中9個(gè)為乙肝陽(yáng)性）和1個(gè)健康供體的多個(gè)區(qū)域的大約74,000個(gè)細(xì)胞進(jìn)行scRNA-seq蒜田。
這些細(xì)胞通過(guò)Louvain算法圖聚類，分成29個(gè)亞群选泻，并進(jìn)行手工注釋冲粤。有趣的是，某些細(xì)胞類型中存在的腫瘤和癌旁組織的特異性分群滔金，表明HCC中TME的潛在重塑色解，同時(shí)在腫瘤核心、腫瘤外周及癌旁組織中也發(fā)現(xiàn)了不同特征的內(nèi)皮細(xì)胞餐茵、淋巴細(xì)胞以及巨噬細(xì)胞科阎。
觀察到在病毒陽(yáng)性和陰性腫瘤中缺乏任何特異性的免疫細(xì)胞群，表明在兩種類型的HCC中腫瘤表型趨同忿族。
腫瘤細(xì)胞中存在的病人特異性分群锣笨，突出病人特異性的驅(qū)動(dòng)和乘客突變對(duì)肝上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的顯著影響。
肝癌中單個(gè)細(xì)胞亞群的進(jìn)一步聚類道批，識(shí)別腫瘤相關(guān)的內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞
由于觀察到正常和腫瘤生態(tài)系統(tǒng)之間的顯著差異错英，開始進(jìn)一步深入識(shí)別疾病特異性細(xì)胞類型。
發(fā)現(xiàn)兩種細(xì)胞類型在腫瘤和癌旁組織之間有顯著的差異隆豹，內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞椭岩。
對(duì)11,672個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞（ECs）進(jìn)行細(xì)分，得到11個(gè)亞群， PLPP3+判哥，IGFBP3+献雅，PLVAP+三個(gè)亞群在腫瘤組織中富集，其中PLVAP（plasmalemma vesicle-associated protein）在肝臟發(fā)育和疾病中起到重要作用塌计。根據(jù)VEGFR2挺身，NRP1，ACKR1锌仅，HLADR的表達(dá)章钾，可觀察到三個(gè)HCC特異性的PLVAP+ ECs亞群。
對(duì)8102個(gè)單核吞噬細(xì)胞（MNPs）細(xì)分热芹，得到9個(gè)亞群贱傀，巨噬細(xì)胞主要在腫瘤中富集，單核細(xì)胞和樹突細(xì)胞主要富集于正常組織剿吻。根據(jù)巨噬細(xì)胞相關(guān)清道夫受體CD163的表達(dá)窍箍，可以將腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAMs）分為CD163high TAM1和CD163low TAM2/TAM3±雎茫基因表達(dá)差別分析識(shí)別出TAM亞群的biomarker椰棘，TAM1表達(dá)FOLR2，TAM2表達(dá)SPP1榄笙，TAM3表達(dá)MT1G邪狞。
由于TAMs既可以是單核細(xì)胞來(lái)源的，也可以是組織駐留的茅撞，利用RNA velocity進(jìn)一步分析帆卓，推斷譜系的軌跡，得出兩個(gè)FOLR2+ TAM1亞群有不同的起源米丘，一種起源于單核細(xì)胞剑令，另一種是胚胎起源的組織駐留巨噬細(xì)胞。前者相比后者高表達(dá)HES1拄查，提示Notch信號(hào)在TAM1亞群中可能發(fā)揮潛在作用吁津。得到觀點(diǎn)，在HCC中堕扶，單核細(xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞可能被重新編程以獲得胚胎樣表型碍脏。
濕實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了以上結(jié)論，即：HCC中存在 fetal-associated PLVAP+ EC 和 embryonic-like FOLR2+ TAM1稍算。
人胚胎肝中腫瘤特異性PLVAP+ ECs和FOLR2+巨噬細(xì)胞的研究
文獻(xiàn)有報(bào)道典尾，PLVAP+/ NRP1+ ECs在小鼠胎肝發(fā)育過(guò)程的TRMs的分布中發(fā)揮關(guān)鍵功能。由此假設(shè)糊探，腫瘤中PLVAP+ ECs的存在也可能促進(jìn)TME中胚胎樣巨噬細(xì)胞的出現(xiàn)钾埂，從而協(xié)調(diào)TME的癌胚重編程河闰。
將人胎肝和HCC整合在一起的約105,000個(gè)細(xì)胞進(jìn)行分群，整合的單細(xì)胞圖譜顯示了胚胎和腫瘤的內(nèi)皮細(xì)胞及骨髓細(xì)胞的顯著相似性勃教。對(duì)ECs進(jìn)行細(xì)分淤击，發(fā)現(xiàn)PLVAP+ ECs主要富集在胚胎和腫瘤組織中，而在正常穩(wěn)態(tài)中相對(duì)缺失故源。對(duì)MNPs細(xì)分也揭示了類似結(jié)果，胎肝巨噬細(xì)胞（FLM, cl. 6）與TAM1亞群存在顯著相似汞贸，同樣有著FOLR2high/CD163high的獨(dú)特表達(dá)绳军。
小鼠胚胎源、人胎肝和腫瘤巨噬細(xì)胞的跨物種比較分析
首先對(duì)“Ms4a3Cre-RosaTdT fate-mapping reporter mice”矢腻，進(jìn)行細(xì)胞分選（該種模式小鼠可以區(qū)分巨噬細(xì)胞是胚胎來(lái)源（Tomato–）還是由單核細(xì)胞分化而來(lái)（Tomato+））门驾。分選出約17,000個(gè) Tomato–，Tomato+和CD45– 細(xì)胞多柑，進(jìn)行scRNA-seq奶是，進(jìn)而分群。
用機(jī)器學(xué)習(xí)“Garnett”算法竣灌，基于HCC的MNPs markers訓(xùn)練聂沙，用人胚胎肝和小鼠肝獨(dú)立測(cè)試。研究這種針對(duì)HCC數(shù)據(jù)的機(jī)器學(xué)習(xí)分析能否在人胚胎和小鼠肝臟數(shù)據(jù)集中識(shí)別到類似的細(xì)胞類型初嘹。得到HCC及汉、人胎肝和小鼠肝臟中，單核細(xì)胞和DCs具有相似性屯烦，以及HCC-TAM1坷随、胎肝巨噬細(xì)胞（FLM）、小鼠胚胎來(lái)源的巨噬細(xì)胞間基因表達(dá)高度相似驻龟。 （HCC數(shù)據(jù)訓(xùn)練温眉，HCC+Fetal數(shù)據(jù)測(cè)試，存在一定程度的數(shù)據(jù)暴露翁狐？）
VEGF信號(hào)通路在PLVAP+ ECs中的作用
VEGF信號(hào)在血管生成中起著重要作用类溢。使用“NicheNet”通過(guò)關(guān)聯(lián)配體和受體之間的基因表達(dá)預(yù)測(cè)細(xì)胞相互作用，探究腫瘤和內(nèi)皮細(xì)胞之間的相互作用谴蔑。識(shí)別到肝細(xì)胞來(lái)源的VEGFA可激活腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞的PLVAP豌骏。而PLVAP+ ECs的一個(gè)主要亞群表達(dá)VEGF受體，強(qiáng)烈暗示腫瘤肝細(xì)胞和ECs之間的通信導(dǎo)致了PLVAP的表達(dá)隐锭。
RNA-FISH實(shí)驗(yàn)觀察到相比癌旁組織窃躲，在HCC中VEGFA、PLVAP钦睡、ALB和CD163表達(dá)更高蒂窒，以及scRNA-seq數(shù)據(jù)相同腫瘤區(qū)域中的VEGFA、VEGFR2和PLVAP存在高度相關(guān)性，提示VEGF信號(hào)對(duì)在胎肝和HCC中出現(xiàn)PLVAP+ ECs起到重要性洒琢，并可能促進(jìn)TME的癌胚重編程秧秉。
FOLR2+ TAMs表現(xiàn)出免疫抑制相互作用
假設(shè)FOLR2+ TAMs可能參與了免疫抑制性TME的調(diào)控。利用“CellPhoneDB”進(jìn)行細(xì)胞-細(xì)胞相互作用分析衰抑，檢測(cè)到與正常微環(huán)境相比象迎，腫瘤中巨噬細(xì)胞和其他免疫細(xì)胞（CD4、CD8呛踊、NK砾淌、DC）之間的相互作用是正常微環(huán)境的兩倍，且這些相互作用與免疫檢查點(diǎn)受體和配體相關(guān)（CD40LG:CD40谭网、CD28;CD86汪厨、SIRPA:CD47、CD86:CTLA4）愉择。
在scRNA-seq數(shù)據(jù)中劫乱，Tregs和巨噬細(xì)胞代表了大多數(shù)腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞，因此聚焦于巨噬細(xì)胞-Treg的相互作用锥涕，以評(píng)估TAMs在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮的作用衷戈。與 SPP1+ TAM2亞群相比，F(xiàn)OLR2+ TAM1與Tregs表現(xiàn)出更多的免疫抑制相互作用站楚。TAM1還表達(dá)更高水平的免疫調(diào)節(jié)趨化因子脱惰，如CXCL12和CXCL16以及CD86。提示TAM1可促進(jìn)HCC的免疫抑制微環(huán)境窿春。
RNA-FISH實(shí)驗(yàn)觀察到TAM1（CD163+）拉一、Tregs（TIGIT+）和PLVAP+ ECs共定位于相同的生態(tài)位，與ALB+ 腫瘤上皮細(xì)胞群相連旧乞，高PLVAP密度區(qū)域存在CD163+和TIGIT+細(xì)胞的富集蔚润。與SPP1+ TAM2相比，F(xiàn)OLR2+ TAM1與TIGIT+ 細(xì)胞的富集強(qiáng)調(diào)了FOLR2+ TAMs在免疫抑制相互作用中的主要作用尺栖。
小鼠胚胎源嫡纠、人胎肝和腫瘤巨噬細(xì)胞中的保守性基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)
假設(shè)系統(tǒng)闡明這些細(xì)胞類型中的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（GRNs）有機(jī)會(huì)識(shí)別出可促進(jìn)FOLR2+ TAMs的胚胎樣重編程的保守性轉(zhuǎn)錄因子。利用“SCENIC”破譯小鼠和人類骨髓細(xì)胞的GRN延赌，然后進(jìn)行基于調(diào)節(jié)子（regulon）活性的層次聚類除盏。根據(jù)直系同源GRNs的相似度，構(gòu)建小鼠和人類骨髓細(xì)胞的Pearson關(guān)聯(lián)熱圖挫以。將128個(gè)直系同源GRNs分成7個(gè)主要的模塊者蠕，識(shí)別到小鼠胚胎源、人胎肝和TAM1共享的一個(gè)模塊“Module2”掐松，HES1踱侣、SPIC粪小、NR1H3、MAF等轉(zhuǎn)錄因子表現(xiàn)出活性抡句。
HES1是Notch信號(hào)通路的經(jīng)典下游效應(yīng)物之一探膊，因?yàn)門ME中TAM1與PLVAP+ ECs共定位，因此假設(shè)PLVAP+ ECs可能促進(jìn)TAM1中Notch信號(hào)的激活待榔，從而促進(jìn)癌胚重編程逞壁。骨髓細(xì)胞表達(dá)受體NOTCH2，PLVAP+ 癌胚ECs表達(dá)配體DLL4究抓。RNA-FISH實(shí)驗(yàn)推斷出癌胚ECs可能是表達(dá)NOTCH2的TAM1巨噬細(xì)胞中Notch激活的潛在配體來(lái)源猾担。
結(jié)果表明了VEGF介導(dǎo)的PLVAP+ ECs的誘生和DLL4+ 介導(dǎo)的FOLR2+ TAM1s的重編程。FOLR2+ TAM1s在TME中發(fā)揮免疫抑制作用刺下。VEGF和NOTCH信號(hào)通路在維持腫瘤-胚胎生態(tài)系統(tǒng)方面起重要性。
最后的最后稽荧，重溫一下Graphical Abstract以及Summary：
