前言：
使用挑單克隆技術(shù)得到多個(gè)單克隆細(xì)胞系后庇绽，就要開(kāi)始驗(yàn)證敲除衷畦，除了蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)，最終還是要看測(cè)序結(jié)果茎截。關(guān)于測(cè)序的方案也是各有不同，由于之前選用的是CRISPR-Cas9 NHEJ介導(dǎo)的編輯方法赶盔，因此測(cè)以sgRNA為中心點(diǎn)企锌，長(zhǎng)度約為500 bp的目的序列即可查看基因編輯后的基因型。而對(duì)于依賴模板的HDR介導(dǎo)的CRISPR-Cas9編輯方法于未，則檢測(cè)方法要更加復(fù)雜一些撕攒。在這里，需要提一句的是烘浦，基因編輯不僅僅是切就完事了抖坪，Cas9造成DNA雙鏈斷裂（DNA double breaks, DSBs） 之后，有多種DNA修復(fù)方式闷叉，而細(xì)胞修復(fù)能力的強(qiáng)弱柳击，也決定著基因編輯的效率。這或許是為什么不同的細(xì)胞的編輯效率有差的另一個(gè)原因片习。
實(shí)驗(yàn)正文
1. 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
常規(guī)試劑：基因組DNA提取試劑盒，Taq DNA Polymerase （以下簡(jiǎn)稱Taq蹬叭，如果有條件可以配備Platinum? Taq DNA Polymerase High Fidelity ）藕咏，Q5? High-Fidelity DNA Polymerase（以下簡(jiǎn)稱Q5） ，膠回收試劑盒秽五，TA Cloning? Kit, with pCR?2.1 Vector（以下簡(jiǎn)稱T4載體） 孽查，感受態(tài)細(xì)胞.
2. 實(shí)驗(yàn)步驟
將單克隆細(xì)胞種到6孔板中，約80%融合度后提取基因組DNA坦喘。以基因組DNA為模板盲再，用Taq PCR實(shí)驗(yàn)P出目的基因條帶。
因?yàn)門aq DNA聚合酶P出來(lái)的條帶帶有A尾瓣铣，可連接T4載體答朋，因此，任何可以使得P出來(lái)的產(chǎn)物帶A尾的DNA聚合酶都可以使用棠笑。倘若課題組有平端的測(cè)序用載體梦碗，則可以使用Q5高保真DNA聚合酶。這里PCR產(chǎn)物需要考慮能否和后續(xù)測(cè)序載體匹配蓖救『楣妫總結(jié)如下：
- Taq DNA聚合酶--PCR產(chǎn)物帶A尾，可連接TOPO T4載體循捺；
- NEB Q5高保真DNA聚合酶--PCR產(chǎn)物為平端斩例，需要連接平端的測(cè)序載體；
- 當(dāng)沒(méi)有平端測(cè)序載體時(shí)从橘，又想用Q5高保真DNA聚合酶PCR念赶，需要將PCR產(chǎn)物加A尾之后础钠，再連接TOPO T4載體；
- 有條件可以購(gòu)買Taq 高保真DNA聚合酶晶乔；
- 普通Taq DNA聚合酶也是可以的珍坊，但PCR產(chǎn)量不如Q5。
（1）基因組DNA提取后PCR
由于課題組條件限制正罢，我們只有T4測(cè)序載體阵漏，這個(gè)載體要求PCR產(chǎn)物是有A尾的。但是我們課題組并沒(méi)有高保真的Taq DNA聚合酶翻具，因此我使用Q5高保真DNA聚合酶完成PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)履怯，選擇50 μl體系，不加GC Enhancer裆泳。
| COMPONENT | 25 μl REACTION | 50 μl REACTION | FINAL CONCENTRATION |
|---|---|---|---|
| 5X Q5 Reaction Buffer | 5 μl | 10 μl | 1X |
| 10 mM dNTPs | 0.5 μl | 1 μl | 200 μM |
| 10 μM Forward Primer | 1.25 μl | 2.5 μl | 0.5 μM |
| 10 μM Reverse Primer | 1.25 μl | 2.5 μl | 0.5 μM |
| Template DNA | variable | variable | < 1,000 ng |
| Q5 High-Fidelity DNA Polymerase | 0.25 μl | 0.5 μl | 0.02 U/μl |
| 5X Q5 High GC Enhancer (optional) 當(dāng)模板為GC-rich序列時(shí)使用 | (5 μl) | (10 μl) | (1X) |
| Nuclease-Free Water | to 25 μl | to 50 μl |
（2）純化PCR產(chǎn)物
將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物叹洲，跑上瓊脂糖凝膠電泳，而后使用膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物工禾。這步驟按照試劑盒說(shuō)明書(shū)即可运提，注意凝膠電泳的條帶要亮亮亮亮亮亮的，回收回來(lái)的量才夠用闻葵。這部分按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)操作即可民泵。
將PCR產(chǎn)物，配合目的基因單邊引物槽畔，送樣測(cè)序栈妆。
（2.1）加A尾，從而使得PCR產(chǎn)物可以與T載體相連接
Set up the reaction system
| Component | 3 μL system |
|---|---|
| Q5 PCR products | 1 μL |
| 10 x PCR buffer (NH4)2SO4 | 0.3 μL |
| 10 mM dNTPs | 0.5 μL |
| Taq DNA Polymerase | 0.2 μL |
| Nuclease-free H2O | **1.0 μL ** |
72 ℃ incubation 20-40 mins (we use 40 min at this time)
（3）PCR產(chǎn)物連接T載體后轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞
以Theromo公司T4載體為例
Set up reactions
| Component | 3 μL system （來(lái)自上個(gè)步驟） |
|---|---|
| Q5 PCR products with A tail | 0.5 μL |
| Salt solution | 0.5 μL |
| Nuclease-free H2O | 1.5 μL |
| PCR4-TOPO vector | 0.5 μL |
incubation at RT for 5 minutes
（4）劃平板挑克隆擴(kuò)增
（5）送樣測(cè)序
先送PCR產(chǎn)物測(cè)序厢钧，根據(jù)PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果再考慮是否送T載體測(cè)序鳞尔。如PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果顯示為有基因變化、套峰等早直，則可送單克隆菌落測(cè)序寥假。
（6）使用Snapgene軟件查看測(cè)序結(jié)果
打開(kāi)目的基因序列文件，按下圖操作霞扬。
載入需要比對(duì)的序列文件昧旨，查看序列是否為野生型，是否為雙峰祥得。
對(duì)于以NHEJ介導(dǎo)的基因編輯方法兔沃，其主要靠堿基缺失或插入不為3的堿基數(shù)，造成后續(xù)閱讀框移碼突變级及，從而可能造成蛋白系列或空間構(gòu)象改變乒疏，蛋白失去原有的功能，因此達(dá)到敲除的目的饮焦。
（1）序列如為野生型則說(shuō)明基因編輯失斉挛狻窍侧；
（2）測(cè)序序列如為雙峰（套峰）則說(shuō)明是雜合子，可手動(dòng)拆開(kāi)查看基因序列转绷，同時(shí)還需將單克隆菌液送測(cè)序以得到完成的測(cè)序結(jié)果伟件；
（3）如為純合子則說(shuō)明等位敲除了同樣的堿基。堿基變化數(shù)目為3的倍數(shù)時(shí)议经，因無(wú)法造成移碼突變斧账，敲除可能會(huì)失敗。需要堿基變化數(shù)目不為3的倍數(shù)煞肾，才可算成功咧织，如上圖所示，有一條鏈缺失了一個(gè)C堿基籍救，因此造成后面閱讀框的移碼突變习绢，蛋白失效則達(dá)到敲除的目的。
