弓形蟲（Toxoplasma gondii）是弓形蟲病（toxoplasmosis）廣泛傳播的寄生蟲病的病原體之一奢人，但其生物學(xué)特性仍然知之甚少。乳酸（Lactate）作為葡萄糖代謝的產(chǎn)物，不僅在包括弓形蟲在內(nèi)的多種生物體中作為能量來源馁菜，還是一種參與基因激活和蛋白質(zhì)功能的調(diào)控分子贡珊。賴氨酸乳酸化（Lysine lactylation, Kla）是一種與染色質(zhì)重塑相關(guān)的翻譯后修飾（Posttranslational modifications最爬，PTM），然而在弓形蟲中门岔，組蛋白和非組蛋白的Kla尚未被研究爱致。
2022年10月7日，沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院尹德琦博士等為第一作者寒随、沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)陳啟軍教授為通訊作者以“Protein Lactylation and Metabolic Regulation of the Zoonotic Parasite Toxoplasma gondii”為題在《Genomics,?Proteomics & Bioinformatics》雜志發(fā)表研究論文糠悯，文章通過染色質(zhì)免疫沉淀測(cè)序（ChIP-seq）等實(shí)驗(yàn)首次對(duì)弓形蟲乳酸進(jìn)行了全面分析，并對(duì)Kla的調(diào)控潛力進(jìn)行了深入剖析妻往，為闡明弓形蟲生物學(xué)特性和尋找新的殺蟲靶標(biāo)開辟了新的途徑互艾。
標(biāo)題：Protein Lactylation and Metabolic Regulation of the Zoonotic Parasite Toxoplasma gondii（人畜共患寄生蟲弓形蟲的蛋白質(zhì)乳酸化和代謝調(diào)控）
時(shí)間：2022-10-7
期刊：Genomics, Proteomics & Bioinformatics
影響因子：IF 9.5
技術(shù)平臺(tái)：ChIP-seq等
研究摘要：
為分析乳酸化在弓形蟲寄生蟲中的發(fā)生率和功能，研究人員繪制了速殖子增殖細(xì)胞的乳酸化組圖譜讯泣，并在弓形蟲RH株系中955種蛋白質(zhì)上鑒定出1964個(gè)乳酸化位點(diǎn)纫普。乳酸化蛋白質(zhì)分布在多個(gè)亞細(xì)胞區(qū)域，并與多種生物過程密切相關(guān)好渠，包括mRNA剪接昨稼、糖酵解、氨跞基-tRNA生物合成假栓、RNA轉(zhuǎn)運(yùn)以及許多信號(hào)通路。研究人員還使用特異性乳酸化抗體進(jìn)行了染色質(zhì)免疫沉淀測(cè)序（ChIP-seq）分析霍掺，分析結(jié)果表明組蛋白H4K12la和H3K14la在基于微管運(yùn)動(dòng)和細(xì)胞侵襲相關(guān)的弓形蟲啟動(dòng)子和外顯子區(qū)域富集但指。進(jìn)一步驗(yàn)證了組蛋白去乙酰化酶TgHDACs 2抗楔、3和4的去乳酸化活性棋凳。同時(shí)，研究還表明使用抗組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶（TgMYST-A）抗體處理顯著降低了弓形體中的蛋白質(zhì)乳酸化连躏。本研究提供了首個(gè)全球乳酸化蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)集剩岳，并為進(jìn)一步解析弓形蟲的功能生物學(xué)提供了基礎(chǔ)。
研究結(jié)果
（1）弓形蟲RH蛋白質(zhì)組中Kla的鑒定
圖1：western blotting入热、免疫熒光分析（IFA）和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）分析揭示弓形蟲中廣泛存在乳酸化拍棕。
A. 用抗乳糜蛋白酶抗體（anti-lactyllysine antibody）對(duì)速殖子裂解物（20μg）的SDS-PAGE和western blotting分析。
B. 弓形蟲RH速殖子與抗乳糜蛋白酶抗體的IFA分析（綠色）勺良。陰性對(duì)照抗體是正常的兔IgG绰播。細(xì)胞核用DAPI（藍(lán)色）染色。
C. 使用抗乳糜蛋白酶抗體的弓形蟲ME49的速殖子IFA分析（綠色）尚困。陰性對(duì)照抗體是正常的兔IgG蠢箩。細(xì)胞核用DAPI（藍(lán)色）染色。
D. 賴氨酸乳酸化的LC-MS/MS數(shù)據(jù)。
E. 維恩圖顯示了從三次重復(fù)中獲得的乳酸化蛋白質(zhì)重疊部分谬泌。
F. 維恩圖顯示了從三次重復(fù)中獲得的乳酸化位點(diǎn)重疊部分滔韵。Kla，賴氨酸乳酸化掌实；LC-MS/MS陪蜻，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法；IFA贱鼻，免疫熒光分析宴卖；T.gondii，弓形蟲邻悬；SDS-PAGE症昏，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳；IgG拘悦，免疫球蛋白G；DAPI橱脸，4’础米，6-二脒基-2-苯基吲哚。
（2）乳酸化蛋白廣泛分布于弓形蟲的多個(gè)亞細(xì)胞區(qū)室中
圖2：乳酸化蛋白分布在多個(gè)亞細(xì)胞區(qū)室中添诉，并參與多種生物功能屁桑。
A. 已鑒定的乳酸化蛋白的亞細(xì)胞分布。
B. 乳酸化蛋白的KEGG富集分析（Fisher精確檢驗(yàn)栏赴，P<0.05）蘑斧。
C. 使用KOG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行乳酸化蛋白的功能分類。橫軸表示KOG類別须眷，縱軸表示蛋白數(shù)量竖瘾。
使D. 用Motif-x生成由靶向賴氨酸殘基周圍的20個(gè)殘基組成的乳酸化位點(diǎn)的概率序列motif。每個(gè)字母的大小對(duì)應(yīng)于該氨基酸殘基出現(xiàn)在該位點(diǎn)的頻率花颗。
E. 熱圖顯示乳酸化賴氨酸周圍氨基酸出現(xiàn)的高（紅色）或低（綠色）頻率捕传。紅框表示在修飾位點(diǎn)附近出現(xiàn)頻率更高的氨基酸，綠框表示修飾位點(diǎn)附近的氨基酸頻率較低扩劝。KEGG庸论，京都基因和基因組百科全書；DC棒呛，差分聂示；KOG，真核生物同源基因組簇秒。
（3）組蛋白乳酸化在弓形蟲中得到深刻鑒定
圖3：多個(gè)PTM發(fā)生在相同的組蛋白位點(diǎn)鱼喉。
這些數(shù)字表示組蛋白上修飾位點(diǎn)的具體位置。不同顏色的橢圓表示不同類型的PTM。不同顏色的框表示不同的域蒲凶。水平淺藍(lán)色線描述了介導(dǎo)PPI或生物過程的區(qū)域（氨基酸）的特征（來自通用蛋白質(zhì)資源數(shù)據(jù)庫的特定信息)气筋。PTM，蛋白翻譯修飾旋圆；PPI宠默，蛋白-蛋白互作。
圖4：弓形蟲H4K12和H3K14被鑒定為組蛋白乳酸化位點(diǎn)灵巧。
A. 組蛋白H4K12la和H3K14la的western blotting分析搀矫。
B. 組蛋白H4K12la和H3K14la在寄生蟲細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外階段的間接IFA分析。兔IgG作為陰性對(duì)照刻肄。
C-D. 弓形蟲的組蛋白H4K12la和H3K14la的MS/MS譜瓤球。a和b離子是指肽的N-末端部分，y離子是指多肽的C-末端部分敏弃。
E. 組蛋白乳酸化位點(diǎn)（H4K12la和H3K14la）在染色體上的結(jié)合區(qū)分布circos圖卦羡。最外圈顯示染色體，內(nèi)圈顯示每個(gè)樣本的分布趨勢(shì)麦到。數(shù)據(jù)代表三個(gè)生物學(xué)重復(fù)绿饵。
F. H4K12la和H3K14la
peaks在全基因組中的重疊分布。圈條長(zhǎng)度表示富集程度瓶颠，圓圈內(nèi)的位置對(duì)應(yīng)于peaks位置拟赊。ChIP-seq，染色質(zhì)免疫沉淀測(cè)序粹淋。
（4）磷酸果糖激酶II（PFKII）是乳酸化的重要調(diào)控因子
圖5：抗TgPFKII抗體降低了蛋白質(zhì)乳酸化吸祟。
A. 通過western
blotting驗(yàn)證純化的重組蛋白TgPFKII。
B. 弓形蟲RH和ME49中TgPFKII表達(dá)水平（131kDa）的western blotting分析桃移。β-肌動(dòng)蛋白用于歸一化屋匕。數(shù)據(jù)以三個(gè)生物重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示（*，P<0.05借杰；**炒瘟，P<0.01；Student
t檢驗(yàn)）第步。
C. 用抗PFKII抗體免疫沉淀源自弓形蟲RH和ME49的可溶性蛋白疮装，并用抗PFKII抗體檢測(cè)沉淀的PFKII蛋白（箭頭指示）。
D. 通過IFA分析不同濃度的陰性IgG（小鼠IgG）對(duì)蛋白質(zhì)乳酸化（綠色）沒有影響粘都。
E. 抗TgPFKII抗體以濃度依賴性方式抑制蛋白質(zhì)乳酸化（綠色）廓推。
F. 分別對(duì)用抗PFKII抗體和陰性對(duì)照抗體處理的組進(jìn)行免疫熒光強(qiáng)度統(tǒng)計(jì)分析。采用Student t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性分析翩隧。所有數(shù)據(jù)均顯示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（N>10）樊展。***，與對(duì)照組相比P＜0.001。
G. western blotting檢測(cè)不同濃度的抗PFKII抗體對(duì)弓形蟲RH乳酸化水平的影響专缠。β-肌動(dòng)蛋白用于歸一化雷酪。IP，免疫沉淀涝婉；PFKII哥力，磷酸果糖激酶。
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（5）組蛋白去乙醵胀洌化酶（HDAC）和乙酰轉(zhuǎn)移酶抗體對(duì)其酶活性產(chǎn)生顯著影響
圖6：與蛋白質(zhì)乳酸化相關(guān)的TgHDAC2吩跋、TgHDAC3、TgHDLC4和TgMYST-A的功能初步分析渔工。
A. TgHDAC2锌钮、TgHDAC3、TgHDLC4和TgMYST-A的序列特征引矩。
B. 特異性抗體對(duì)TgHDAC2（71 kDa）梁丘、TgHDAC3（53 kDa）、TgHDAC4（101
kDa）和TgMYST-A（56 kDa）的表達(dá)進(jìn)行western blotting分析旺韭。
C. TgHDAC2氛谜、TgHDAC3、TgHDAC4和TgMYST-A的間接IFA分析（共定位）茂翔。
D. 特異性抗體對(duì)PTM影響的流程圖混蔼。
E. 抗TgHDAC2履腋、抗TgHDLAC3珊燎、抗Tg HDAC4和抗TgMYST-A抗體對(duì)弓形蟲的乳酸化、2-羥基異丁踝窈化悔政、巴豆酰化和乙跹泳桑化的調(diào)控谋国。用箭頭指示修飾水平變化的蛋白。β-肌動(dòng)蛋白用于歸一化迁沫。
HDAC2芦瘾、HADC3和HDAC4是組蛋白去乙酰化酶集畅；MYST-A是一種組蛋白賴氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶近弟。?
研究小結(jié)
研究總結(jié)了TF相關(guān)蛋白、RNA聚合酶相關(guān)蛋白挺智、DBP和RBP中的乳酸化蛋白祷愉，發(fā)現(xiàn)它們與一系列過程有關(guān)，包括基因轉(zhuǎn)錄、RNA剪接二鳄、蛋白質(zhì)翻譯和加工（圖7）赴涵。在弓形蟲中總共鑒定出23個(gè)TF、7個(gè)RNA聚合酶订讼、6個(gè)DBP和27個(gè)RBP髓窜，分別具有49、8躯嫉、8和62個(gè)Kla位點(diǎn)纱烘。
總之，本研究建立了第一個(gè)人畜共患寄生蟲弓形蟲蛋白質(zhì)乳酸化的綜合圖譜祈餐，并揭示了乳酸化在寄生蟲的各種生物過程中深刻調(diào)控與能量代謝和基因激活相關(guān)的蛋白質(zhì)擂啥。這些數(shù)據(jù)為開發(fā)抗寄生蟲藥物提供了新的途徑。
圖7：乳酸化參與基因調(diào)控示意圖帆阳。
示意圖顯示乳酸化蛋白哺壶，如轉(zhuǎn)錄因子蛋白、RNA聚合酶相關(guān)蛋白蜒谤、DBP和RBP山宾，參與轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控過程。藍(lán)框內(nèi)的字體表明鳍徽，乳酸化RBPs可能在不同細(xì)胞的各種轉(zhuǎn)錄后過程中發(fā)揮廣泛作用资锰。在細(xì)胞核中將前體mRNA剪接成成熟mRNA的過程中，乳酸化的RBPs和剪接因子是主要的參與者阶祭。此外绷杜，乳酸化的RBPs可以幫助mRNA在核糖體中翻譯成蛋白質(zhì)，一些RBPs可能被泛素-蛋白酶體系統(tǒng)降解濒募。DBP鞭盟，DNA結(jié)合蛋白；UPS瑰剃，泛素-蛋白酶體系統(tǒng)齿诉；RBP、RNA結(jié)合蛋白晌姚。
參考文獻(xiàn)：
YinD, Jiang N, Cheng C, Sang X, Feng Y, Chen R, Chen Q. Protein Lactylation andMetabolic Regulation of the Zoonotic Parasite Toxoplasma gondii. GenomicsProteomics Bioinformatics. 2022 Oct 7. pii: S1672-0229(22)00126-7. doi:10.1016/j.gpb.2022.09.010. PubMed PMID: 36216028.
