Nat Biotech | CITE-seq技術(shù)實現(xiàn)細胞級抗原表位與轉(zhuǎn)錄組共定位

原創(chuàng)?驕陽似我?圖靈基因?2023-03-21 11:17?發(fā)表于江蘇

收錄于合集#前沿分子生物學(xué)技術(shù)

撰文：驕陽似我

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本文的研究團隊利用CITE-seq技術(shù)忧便，在細胞分辨率的空間維度下，檢測了小鼠不同器官組織中的189個細胞表面蛋白質(zhì)與對應(yīng)的轉(zhuǎn)錄組信息秕重，同時也對人體組織中的273個表面蛋白質(zhì)與對應(yīng)的轉(zhuǎn)錄組進行測序分析辣垒，實現(xiàn)了高倍蛋白與整個轉(zhuǎn)錄組的共定位须教；同時作者的研究團隊也對注射新冠病毒疫苗的局部活檢組織皮膚進行測序分析计贰，揭示了在注射疫苗后，局部外周T細胞被激活憔鬼。

*CITE-seq：CITE-seq全稱為“Cellular indexing of transcriptomes and epitopes by sequencing”赫粥，該技術(shù)可以在單細胞水平將基因表達信息與細胞表面蛋白信息通過測序的方法聯(lián)合起來观话，達到同時檢測細胞表面的蛋白質(zhì)信息與胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄組信息的目的。該技術(shù)相較于單獨的單細胞轉(zhuǎn)錄組測序而言越平，額外地加入了細胞表面蛋白的表達信息频蛔，再聯(lián)合同一細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄組信息灵迫，可以更加深入地區(qū)分細胞異質(zhì)性、更精確地挖掘特異性的細胞類型晦溪，探索治療耐藥性等生物學(xué)現(xiàn)象背后的機制龟再。

空間轉(zhuǎn)錄組測序已經(jīng)在細胞分化和組織發(fā)育的領(lǐng)域得到飛速的發(fā)展，但是目前對于較大量的高復(fù)合蛋白質(zhì)尼变，還未納入研究范圍利凑。如果實現(xiàn)了高倍體（>100）蛋白的定位，到底可以同時定位多大的表面蛋白嫌术，以及可以獲得什么差異哀澈，目前還是一片未知，帶著這樣的疑問度气，作者的研究團隊就此對高倍蛋白與轉(zhuǎn)錄組的共定位開展了研究割按。

近期，耶魯大學(xué)的Rong Fan教授團隊在Nature biotechnology雜志上發(fā)表了一篇名為“High-plex protein and whole transcriptome co-mapping at cellular resolution with spatial CITE-seq?”的文章磷籍，他們利用CITE-seq技術(shù)适荣，對小鼠不同器官組織中的189個蛋白及人體組織中的273個表面蛋白開展了表面蛋白和轉(zhuǎn)錄組的并行測序分析，實現(xiàn)了高倍蛋白與整個轉(zhuǎn)錄組的共定位院领，并對注射新冠病毒疫苗的局部活檢組織進行測序分析弛矛，揭示了注射疫苗的局部皮膚內(nèi)外周T細胞被激活。

空間CITE-seq的工作設(shè)計流程

作者首先向我們展示了CITE-seq的工作流程比然。該方法使用200-300adt的混合物對組織載玻片進行染色丈氓，每個ADT包含一個poly (A)尾巴，一個唯一的分子標(biāo)識符（UMI）和一個相應(yīng)抗體唯一的特定DNA序列强法，將其隨機組合万俗，并形成固定切片。接下來饮怯，使用微流控芯片向組織表面引入一組DNA行條形碼A1-A50闰歪，該序列與adt或mrna的聚(A)尾部結(jié)合，然后進行組織內(nèi)逆轉(zhuǎn)錄蓖墅；最后库倘，對條形碼cdna進行回收、純化和擴增聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）置媳，制備兩個下一代測序（NGS）文庫于樟，分別用于adt和mrna的配對測序，用于計算重建空間蛋白或基因表達圖（圖1a）拇囊。

對小鼠不同組織的189個蛋白及轉(zhuǎn)錄組進行測序分析

作者檢測了在多種小鼠組織類型中的189種蛋白質(zhì)的空間定位和全基因組表達，包括脾臟靶橱、結(jié)腸寥袭、腸和腎臟路捧。脾臟樣本中的空間蛋白譜導(dǎo)致了5個主要的簇，轉(zhuǎn)錄組聚類分析確定了7個聚類传黄，它們也與空間高倍蛋白聚類相一致杰扫。作者還分析了小鼠的結(jié)腸、腸和腎組織膘掰，由此確定章姓，產(chǎn)生的主要簇與解剖區(qū)域相關(guān)（圖1b）

對人體扁桃體273個蛋白及轉(zhuǎn)錄組進行測序分析

在2.5 mm×2.5 mm的區(qū)域，每像素的平均蛋白計數(shù)為239识埋，平均UMI計數(shù)為4309凡伊，僅對空間蛋白圖譜進行聚類，就鑒定出7個主要的聚類窒舟，相應(yīng)的空間分布表現(xiàn)出高度明顯的特征（圖1f）系忙。作者獲得的空間轉(zhuǎn)錄組產(chǎn)生了8個主要的簇（圖1g），它們的空間分布（圖1h）與空間蛋白簇有很好的相關(guān)性惠豺，但噪聲更大银还，精度更低。蛋白表達分析（圖1i）可以識別每個聚類中的主要細胞類型洁墙。組織圖像和空間蛋白簇圖的疊加（圖1j）顯示蛹疯，解剖特征與組織細胞類型之間有很強的相關(guān)性。

進一步可視化蛋白質(zhì)

B細胞的CD19標(biāo)記物在卵泡中富集热监。CD21或補體受體苍苞，存在于所有成熟的B細胞和濾泡樹突狀細胞（DCs）上，在整個卵泡中高表達狼纬。CD23先前在成熟的B細胞羹呵、活化的巨噬細胞、嗜酸性粒細胞疗琉、濾泡樹突狀細胞和血小板上發(fā)現(xiàn)冈欢，它局限于GC光區(qū)12的頂端區(qū)域。

進一步檢測了與B細胞分化和成熟相關(guān)的功能蛋白

如免疫球蛋白（圖1k）盈简。IgM的表達僅限于GC B細胞凑耻。一旦它們進一步成熟吩坝，這些B細胞就開始產(chǎn)生IgG并遷移出卵泡香拉。IgD主要由剛剛從血液中流出的幼稚B細胞產(chǎn)生（圖1l）。CD90（Thy-1）與多種細胞類型相關(guān)不撑，但在GCs中完全缺失臼勉。Notch3存在于鱗狀上皮細胞中邻吭。Mac2/Galectin3在隱窩區(qū)高度富集（圖1m）。

作者還還檢測了T細胞標(biāo)記物CD3

該標(biāo)記物識別了所有主要的T細胞區(qū)宴霸，以及輔助T細胞的CD4和幼稚或干細胞樣T細胞的CD45A（圖1n）囱晴，CD9在卵泡和隱窩的扁桃體B細胞中均有表達膏蚓。CD171是一種與神經(jīng)突生長、髓鞘形成和神經(jīng)元分化有關(guān)的神經(jīng)元細胞粘附分子畸写，被發(fā)現(xiàn)在暗區(qū)高度受限驮瞧。據(jù)我們所知，這在以前沒有報道過枯芬，值得進一步研究（圖1O）圖1.空間-cite-seq工作流的設(shè)計和應(yīng)用于不同的小鼠組織類型和人類扁桃體论笔，用于蛋白質(zhì)和整個轉(zhuǎn)錄組的共定位

對接種新冠疫苗的皮膚活檢組織進行CITE-seq檢測，并繪制免疫激活狀態(tài)圖

組織切片由低細胞密度的膠原豐富區(qū)和高細胞密度的血管顆粒區(qū)組成（圖2a）千所，基因計數(shù)的空間圖譜與細胞密度相關(guān)狂魔，高細胞密度區(qū)域每像素產(chǎn)生411個基因（圖2b）。然而真慢，即使在低細胞密度區(qū)域毅臊，無監(jiān)督聚類也能識別出空間上不同的聚類（圖2c），在整個組織切片上黑界，蛋白計數(shù)的空間圖變化較小管嬉，在低密度區(qū)域可檢測到高達~的270個蛋白（圖2e）。

空間蛋白譜的聚類得到了10個聚類（圖2d）朗鸠，相應(yīng)的空間分布（圖2f）與空間轉(zhuǎn)錄組聚類具有高度的差異和很強的一致性蚯撩。與空間轉(zhuǎn)錄組結(jié)合進行聚類，得到13個主要聚類烛占，并根據(jù)基因腫瘤學(xué)確定主要細胞類型（圖2g）胎挎。細胞類型的標(biāo)簽轉(zhuǎn)移從scRNA-seq到空間組織像素，可以可視化不同類型的分布（圖2h）忆家。

進一步可視化單個基因的表達

凋亡相關(guān)基因CCNL2和NOL3在血管區(qū)域表達犹菇；APOC1（負責(zé)脂蛋白代謝）、GJA1（連接蛋白編碼）和PRDX2（過氧化物還蛋白編碼）主要在血管中表達芽卿〗疑郑跨膜蛋白編碼基因TMEM132D和糖基轉(zhuǎn)移酶ALG5均在真皮區(qū)表達。編碼CYP450蛋白的CYP4F8出現(xiàn)在大部分皮膚區(qū)域卸例。

對幾種免疫細胞類型進行重點研究

作者重點研究了幾種免疫細胞類型称杨，包括抗原提呈細胞（APCs）、B細胞和T細胞的兩個亞群筷转，如差異表達蛋白所示（圖2j）姑原。apc和T細胞定位于空間上不同的區(qū)域，而B細胞分布在整個組織中（圖2k）呜舒。具體來說锭汛，T細胞亞群2表達了一組標(biāo)記物，包括淋巴細胞激活基因3（LAG3），與外周輔助T（Tph）細胞群16 17相關(guān)（圖2m）店乐，這肯定是由LAG3艰躺、PD-1和CXCR6的表達水平定義的Tph簽名評分確定的（圖2n）呻袭。圖2.在COVID-19 mRNA疫苗注射部位的人類皮膚活檢組織的綜合空間和單細胞分析顯示局部外周T細胞激活眨八。

結(jié)論

Tph細胞與疫苗接種后的局部T細胞激活有關(guān)，過整合空間高蛋白質(zhì)和轉(zhuǎn)錄組映射與scRNA-seq數(shù)據(jù)從相同的皮膚活檢組織左电，我們確定主要皮膚和免疫細胞類型和Tph細胞高度關(guān)聯(lián)廉侧，可能有助于局部免疫激活啟動系統(tǒng)疫苗反應(yīng)。

空間cite-seq技術(shù)結(jié)合了擴展了200-300大小的蛋白標(biāo)記與檢測篓足，大大提高了組織定位的能力段誊，可以廣泛應(yīng)用于包括癌癥、免疫學(xué)栈拖、傳染病和解剖病理學(xué)等領(lǐng)域连舍。

教授介紹：

Rong Fan

Rong Fan，耶魯大學(xué)哈羅德·霍奇金森生物醫(yī)學(xué)工程教授涩哟，在中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)獲得學(xué)士學(xué)位索赏，在加州大學(xué)伯克利分校獲得博士學(xué)位，美國醫(yī)學(xué)與生物工程研究所（AIMBE）院士贴彼，美國國家發(fā)明家學(xué)院（NAI）院士潜腻，2021年獲得耶魯大學(xué)癌癥中心癌癥研究獎。

Rong Fan博士的研究重點是開發(fā)和部署單細胞和空間多組學(xué)分析技術(shù)器仗，通橙诨粒基于微制設(shè)備，以研究復(fù)雜人類疾病的發(fā)病機制和治療反應(yīng)精钮，包括癌癥威鹿，自身免疫和心血管疾病。特別是轨香，他的實驗室對血液系統(tǒng)惡性腫瘤忽你，腦腫瘤和系統(tǒng)性紅斑狼瘡感興趣。他還對細胞免疫功能表征和在癌癥免疫療法中的應(yīng)用感興趣弹沽。他的實驗室開發(fā)了一種微芯片技術(shù)檀夹，用于同時測量單細胞中的42種免疫效應(yīng)蛋白，這是迄今為止單細胞蛋白質(zhì)分泌測定的最高多重檢測策橘，已被商業(yè)化為IsoCode和IsoLight炸渡，目前被美國和世界各地的>100家制藥公司和醫(yī)療中心使用。最近丽已，他的實驗室開發(fā)了一種名為DBiT-seq的基于NGS的新型方法蚌堵，用于空間轉(zhuǎn)錄組圖譜，空間高叢蛋白圖譜和空間表觀基因組圖譜，這可能在發(fā)育生物學(xué)吼畏，癌癥研究督赤，神經(jīng)科學(xué)和免疫生物學(xué)中得到廣泛應(yīng)用。

參考文獻：

Liu, Y., DiStasio, M., Su, G. et al. High-plex protein and whole transcriptome co-mapping at cellular resolution with spatial CITE-seq. Nat Biotechnol (2023).