人造血液嘗試始于七十多年前晕鹊，1900年浅浮，奧地利醫(yī)學(xué)家卡爾·蘭德斯坦納發(fā)現(xiàn)了ABO血型，讓輸血救人成為了可能偶器。目前斩萌，接受手術(shù)、癌癥治療和創(chuàng)傷治療的患者所需的血液供應(yīng)依賴于志愿獻(xiàn)血者屏轰。由于需求量大颊郎，研發(fā)人造血液以替代人自身血液的想法便產(chǎn)生了。到了20世紀(jì)中后期霎苗，由于獻(xiàn)血和輸血造成一些傳染病如艾滋病姆吭、乙肝、丙肝等的傳播和流行唁盏，也讓人對輸血用血產(chǎn)生恐懼内狸，因此人們正在努力開發(fā)一種更安全、更容易獲得的血液供應(yīng)來源厘擂。
這一挑戰(zhàn)通過可能的血液嫁接來解決昆淡，利用胚胎細(xì)胞、骨髓細(xì)胞或誘導(dǎo)干細(xì)胞在體外產(chǎn)生血細(xì)胞刽严。通過癌基因能夠增加細(xì)胞增殖和減少細(xì)胞死亡的能力昂灵，來促進(jìn)通常難以連續(xù)培養(yǎng)的紅系祖細(xì)胞系的細(xì)胞生長，往往在培養(yǎng)中細(xì)胞系有強(qiáng)勁的增長，但細(xì)胞群表現(xiàn)出多異質(zhì)表型眨补。由于Cytena克隆篩選單細(xì)胞打印（single-cell printer?管削，scp?）能夠高通量生成單細(xì)胞克隆，以識別具有理想紅系標(biāo)記表達(dá)的克隆撑螺。利用這一工作流程含思，獲得200多個(gè)單克隆可用于進(jìn)一步的表達(dá)標(biāo)記分析。
本研究為了實(shí)現(xiàn)分化的去核血細(xì)胞的持續(xù)供應(yīng)甘晤，開發(fā)了從轉(zhuǎn)染到單細(xì)胞克隆的工作流程含潘，以選擇克隆進(jìn)一步分化為成熟的紅細(xì)胞(圖1)。首先线婚，將5種不同的癌基因(c-myc, BCL-XL, SV40, geT, Bmi-1, LhX-2)單獨(dú)或成對地轉(zhuǎn)染到來自CD34+干細(xì)胞的紅系祖細(xì)胞系中调鬓。
注：轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，通過向培養(yǎng)物中添加dox激活癌基因表達(dá)酌伊，從而實(shí)現(xiàn)持續(xù)培養(yǎng)腾窝。使用single-cell printer?進(jìn)行單細(xì)胞克隆的篩選，挑出具有表面標(biāo)記的特異性單克隆居砖，在通過添加干細(xì)胞因子(SCF)和促紅細(xì)胞生成素(EPO)進(jìn)一步分化虹脯，進(jìn)一步分化為紅系細(xì)胞。
轉(zhuǎn)染48小時(shí)后奏候，通過添加強(qiáng)力霉素(dox)激活癌基因表達(dá)循集。發(fā)現(xiàn)個(gè)體癌基因轉(zhuǎn)導(dǎo)不會導(dǎo)致細(xì)胞永生化，只有聯(lián)合轉(zhuǎn)導(dǎo)c-myc和BCL-XL才能使紅系前體細(xì)胞永生化蔗草，細(xì)胞可以在培養(yǎng)中保存并增殖一年以上(圖2A)咒彤，除了長期培養(yǎng)的能力外，永生化細(xì)胞還表現(xiàn)出早期造血祖細(xì)胞的典型標(biāo)志物咒精，包括CD34very lowCD45+/-CD133+/-CD71+CD44highCD105highCD235avery low镶柱。然而，去除dox致癌基因表達(dá)失活模叙，使進(jìn)一步分化成為可能(圖2B)歇拆。
?注：圖2（A）永生化紅系祖細(xì)胞的增殖率。（B）去除dox降低了三種不同細(xì)胞克隆的c-myc和BCL-XL癌基因的mRNA表達(dá)(編號8,29和34)范咨。
與傳統(tǒng)方法相比故觅，single-cell printer?提供了一種高通量分離單細(xì)胞克隆的方法，用于進(jìn)一步的下游分析和篩選渠啊。此技術(shù)基于類似噴墨的原理输吏，將細(xì)胞樣品加入至包含微流體結(jié)構(gòu)的芯片中，芯片的底部有一個(gè)噴嘴替蛉，自由飛行的小液滴在那里被分配贯溅，對噴嘴進(jìn)行連續(xù)成像炼杖，以確定產(chǎn)生的液滴中是否含有0、1或多個(gè)細(xì)胞盗迟，如果一個(gè)液滴含有一個(gè)細(xì)胞，它將被分配到目標(biāo)孔板熙含，如果液滴不包含細(xì)胞/多個(gè)細(xì)胞罚缕，液滴將作為廢物處理。
紅系祖細(xì)胞被分配到5個(gè)充滿半固體培養(yǎng)基的96孔板（兼容384孔板）怎静。連續(xù)的五張圖像(圖3A)作為單克隆源性的保證邮弹，并確保只分配了一個(gè)細(xì)胞。經(jīng)統(tǒng)計(jì)有97.7%的孔(469/480)分配到單個(gè)細(xì)胞蚓聘，其中超過200個(gè)可以形成單克隆腌乡，在進(jìn)一步分析形態(tài)和表面標(biāo)記物中發(fā)現(xiàn)表達(dá)較理想(CD71、CD45夜牡、CD34与纽、CD235a)。從培養(yǎng)物中去除Dox塘装，在7天內(nèi)進(jìn)一步分化為產(chǎn)生血紅蛋白的細(xì)胞(圖3B)急迂，突出了可能發(fā)育為成熟紅細(xì)胞的潛力。
注：圖3（A）single-cell printer?記錄沉積到目標(biāo)板中的單個(gè)細(xì)胞來源的克隆性保證蹦肴，單細(xì)胞沉積效率為97.7%僚碎。（B）紅系祖細(xì)胞克隆(29)進(jìn)行進(jìn)一步分化，去除dox阴幌，加入SCF和EPO勺阐。通過染色顯示，培養(yǎng)物中存在產(chǎn)生血紅蛋白的細(xì)胞矛双。
本研究表明渊抽，通過轉(zhuǎn)染c-myc和BCL-XL癌基因，典型的非分裂前體RBC前體可以獲得永生化议忽。所得到的細(xì)胞系是異質(zhì)的腰吟，需要單細(xì)胞克隆來篩選理想的細(xì)胞特征。與傳統(tǒng)方法相比徙瓶，single-cell printer?在保持細(xì)胞活力的同時(shí)毛雇，實(shí)現(xiàn)了高通量、穩(wěn)健的單細(xì)胞克隆開發(fā)方法侦镇，能夠產(chǎn)生超過200個(gè)克隆灵疮，這些克隆后來被進(jìn)一步分化并鑒定為具有關(guān)鍵的祖細(xì)胞標(biāo)記物。
參考文獻(xiàn)：
single-cell printer??| Generating single-cell clones of immortalized red blood cell (RBC) precursors using single-cell dispensing. Romy Kronstein Widemann1, Stefan Zimmermann2, Torsten Tonn1.
艾貝泰? 細(xì)胞
