hello，大家好，這一篇我們來看一下張澤民新發(fā)表的文章轨淌，Temporal single-cell tracing reveals clonal revival and expansion of precursor exhausted T cells during anti-PD-1 therapy in lung cancer八孝，2021年12月23日發(fā)表于Nature Cancer，我們來分享一下.
先來簡(jiǎn)單總結(jié)一下全文
腫瘤浸潤(rùn)T細(xì)胞既包含能夠識(shí)別腫瘤抗原并殺傷癌細(xì)胞的腫瘤特異性T細(xì)胞灰瞻，也包含專門識(shí)別非腫瘤抗原例如流感病毒的T細(xì)胞腥例，而且在腫瘤中非腫瘤特異性T細(xì)胞占了很大一部分比例辅甥。因此在分析過程中如何排除非腫瘤特異性T細(xì)胞的潛在影響，精準(zhǔn)地研究腫瘤特異性T細(xì)胞的動(dòng)態(tài)變化是一個(gè)挑戰(zhàn)燎竖。之前的多個(gè)研究表明璃弄，由于腫瘤抗原的持續(xù)刺激，腫瘤中的腫瘤特異性CD8 T細(xì)胞克隆會(huì)同時(shí)高表達(dá)T細(xì)胞殺傷和“耗竭”相關(guān)基因构回，而非腫瘤特異性CD8 T細(xì)胞則不會(huì)表達(dá)“耗竭”相關(guān)基因夏块。因此在腫瘤中，耗竭CD8 T細(xì)胞可以當(dāng)作腫瘤特異T細(xì)胞的一個(gè)替代纤掸。
研究人員開發(fā)了一套新的分析思路脐供，首先通過聚類分析鑒定了耗竭CD8 T細(xì)胞類群，進(jìn)而以耗竭CD8 T細(xì)胞克隆的TCR序列為基礎(chǔ)借跪，將所有的CD8 T細(xì)胞分為腫瘤特異性CD8 T細(xì)胞和非腫瘤特異性CD8 T細(xì)胞：根據(jù)上面提到的結(jié)論和假設(shè)政己，與耗竭CD8 T細(xì)胞有完全相同TCR序列的細(xì)胞為腫瘤特異性T細(xì)胞，剩下的為非腫瘤特異性T細(xì)胞掏愁。研究發(fā)現(xiàn)在有響應(yīng)的腫瘤當(dāng)中歇由，治療顯著提高了耗竭信號(hào)低的腫瘤特異T細(xì)胞前體細(xì)胞的比例，表明了PD-1抗體可能阻斷了腫瘤特異T細(xì)胞向耗竭狀態(tài)的分化果港。相反沦泌，這一趨勢(shì)在治療前和治療后無響應(yīng)的腫瘤中并沒有觀察到。
有效治療后腫瘤特異T細(xì)胞前體細(xì)胞的增加有三種可能：1. 耗竭T細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)辛掠；2. 腫瘤中之前存在的前體細(xì)胞的擴(kuò)增谢谦；3. 來自腫瘤外例如外周血中的T細(xì)胞的補(bǔ)充。研究者通過相關(guān)分析排除了第一種可能萝衩，強(qiáng)調(diào)了后面兩種模式的重要性回挽。耗竭T細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)是領(lǐng)域內(nèi)長(zhǎng)期存在的一種假設(shè)，但是之前的小鼠研究表明耗竭T細(xì)胞的表觀修飾和特征是穩(wěn)定的欠气，很難改變厅各。研究者對(duì)人類腫瘤的分析進(jìn)一步支持了這一觀點(diǎn)。
此外预柒，之前斯坦福大學(xué)Howard Chang研究組提出了克隆替代（clonal replacement）的概念队塘，認(rèn)為治療后腫瘤中的腫瘤特異T細(xì)胞的克隆型都是新出現(xiàn)的。而該研究發(fā)現(xiàn)宜鸯，在肺癌治療的過程中憔古，新的克隆和之前存在的克隆都會(huì)被招募到腫瘤中進(jìn)而發(fā)揮功能。針對(duì)這一現(xiàn)象淋袖，研究人員提出了克隆復(fù)興（clonal revival）的概念官还，拓展了clonal replacement的模式良姆。
Abstract
抗 PD-1 治療在非小細(xì)胞肺癌 (NSCLC) 的治療中顯示出前所未有的臨床成功卵沉，但其潛在機(jī)制仍未完全了解或颊。在這里珠移，對(duì) 36 NSCLC 患者接受基于 PD-1 的治療的 47 腫瘤活檢進(jìn)行了時(shí)間單細(xì)胞 RNA 和配對(duì) T 細(xì)胞receptor測(cè)序。觀察到治療后反應(yīng)性腫瘤中前體耗盡 T (Texp) 細(xì)胞的水平增加，其特征是共抑制分子的低表達(dá)和 GZMK 的高表達(dá)。相比之下合敦，無反應(yīng)的腫瘤未能積累 Texp 細(xì)胞。數(shù)據(jù)表明验游，Texp 細(xì)胞不太可能來自終末耗竭細(xì)胞的重振充岛；相反，它們是通過 (1) 局部擴(kuò)張和 (2) 外周 T 細(xì)胞補(bǔ)充的新的和預(yù)先存在的克隆型而積累的耕蝉，這里將這種現(xiàn)象稱為克隆復(fù)興崔梗。研究提供了對(duì)基于 PD-1 療法的潛在機(jī)制的見解，暗示 Texp 細(xì)胞的克隆復(fù)蘇和擴(kuò)增是改善 NSCLC 治療的步驟垒在。
免疫檢查點(diǎn)阻斷 (ICB) 能夠通過破壞共抑制性 T 細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)來增強(qiáng)抗腫瘤免疫蒜魄，并代表了癌癥治療的顯著范式轉(zhuǎn)變。然而爪膊，對(duì)此類療法的顯著反應(yīng)僅限于少數(shù) NSCLC4 患者权悟，這突出了對(duì)其他治療策略的需求砸王。為了促進(jìn)下一代免疫療法的合理設(shè)計(jì)推盛，首先了解 ICB 誘導(dǎo)的腫瘤排斥反應(yīng)的分子和免疫學(xué)機(jī)制至關(guān)重要。先前的研究報(bào)道谦铃，PD-1 通路阻斷可以逆轉(zhuǎn)慢性病毒感染期間終末耗竭的 Texp 細(xì)胞的功能障礙狀態(tài)耘成，呈現(xiàn)出一種廣泛推測(cè)的 ICB 治療機(jī)制。然而驹闰，通過集中精力解決這個(gè)問題瘪菌，新出現(xiàn)的證據(jù)表明終端 Tex 細(xì)胞的表觀遺傳穩(wěn)定性很難改變，可能會(huì)限制這種重振嘹朗。最近的觀察也支持了這一觀點(diǎn)师妙，表明新滲透的新克隆而不是預(yù)先存在的克隆在癌癥治療中起主要作用 。此外屹培，多項(xiàng)研究已將臨床結(jié)果與 Texp 細(xì)胞聯(lián)系起來默穴，包括干細(xì)胞樣細(xì)胞和隨后轉(zhuǎn)化為終末 Tex 亞群的瞬態(tài)細(xì)胞，但終末 Tex 和 Texp 細(xì)胞在人類癌癥治療過程中對(duì)抗 PD-1 的反應(yīng)仍然存在難以捉摸.
以前旨在闡明 ICB 治療機(jī)制的肺癌研究集中在大塊腫瘤的全外顯子組測(cè)序上褪秀，但這些策略在理解免疫檢查點(diǎn)阻斷免疫反應(yīng)的細(xì)胞基礎(chǔ)方面是有限的蓄诽。單細(xì)胞 RNA 測(cè)序 (scRNA-seq) 是剖析復(fù)雜生物系統(tǒng)細(xì)胞多樣性的有力方法，但目前對(duì)肺癌的 scRNA-seq 分析主要集中在未經(jīng)治療的腫瘤媒吗，主要是由于高水平的挑戰(zhàn)- 在多個(gè)治療時(shí)間點(diǎn)的高質(zhì)量人類腫瘤樣本仑氛。最近的一項(xiàng)肺癌研究分析了治療后腫瘤中的新抗原特異性 T 細(xì)胞，而治療后此類細(xì)胞的時(shí)間變化仍然難以捉摸。為了解決這些局限性锯岖，我們利用 scRNA-seq 分析來全面表征抗 PD-1 與化療聯(lián)合治療后分離的腫瘤活檢中 T 細(xì)胞的時(shí)間動(dòng)態(tài)介袜，使我們能夠更好地解釋基于 PD-1 的治療的基本機(jī)制.
Result
Characterization of T cells pre- and post-PD-1 blockade by scRNA-seq
采用基于液滴的 5' scRNA-seq 和配對(duì) T 細(xì)胞受體 (scTCR-seq) 測(cè)序來分析來自 36 名 NSCLC 患者的一組 47 份腫瘤活檢，涵蓋 33 名初治患者出吹、9 名治療后響應(yīng)位點(diǎn)匹配的患者 （來自八個(gè)腫瘤）和五個(gè)治療后無反應(yīng)的腫瘤標(biāo)本米酬，在抗 PD-1 與化學(xué)療法的聯(lián)合治療后。 經(jīng)過嚴(yán)格的質(zhì)量控制過濾（方法）后趋箩，總共剩下 135,391 個(gè) Tcells赃额，其中 56.6% 具有生產(chǎn)性 TCR α-和 β-鏈對(duì)（補(bǔ)充表 2）。 通過匹配 α 鏈和 β 鏈對(duì)叫确，這些 T 細(xì)胞進(jìn)一步分為 43,713 個(gè)不同的克隆型跳芳，使我們能夠追蹤克隆譜系并測(cè)量治療后的克隆擴(kuò)增。
在 CD4+ T 細(xì)胞中竹勉，我們發(fā)現(xiàn)反應(yīng)性腫瘤在治療后 FOXP3+ 調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞（Treg）略有減少飞盆，而治療后無反應(yīng)性腫瘤與反應(yīng)性腫瘤相比，此類細(xì)胞顯著增加次乓。我們之前觀察到 Treg 細(xì)胞內(nèi)的異質(zhì)性 吓歇，其特征是 4-1BB (TNFRSF9) 的雙峰分布，這是一種已知的 Treg 激活標(biāo)記物票腰。為了研究這種異質(zhì)性是否與治療反應(yīng)相關(guān)城看，進(jìn)一步對(duì) Treg 進(jìn)行了差異表達(dá)分析。與治療后反應(yīng)性腫瘤相比杏慰，治療前和非反應(yīng)性腫瘤中的 Treg 始終上調(diào) 4-1BB+ Treg 的特征测柠，包括與免疫抑制功能相關(guān)的基因（IL1R2、REL 和 LAYN）缘滥。使用基因集富集分析（GSEA）轰胁，進(jìn)一步證明了 4-1BB+ Tregs 在無反應(yīng)和治療前腫瘤中的富集，這與之前的一項(xiàng)研究一致朝扼，該研究報(bào)告 4-1BB+ Tregs 與癌癥基因組圖譜肺腺癌患者的不良預(yù)后相關(guān)(LUAD)赃阀。與 Tregs 相比，表達(dá) CXCL13 的 Th1 樣細(xì)胞在治療后表現(xiàn)出反應(yīng)性腫瘤的增加擎颖。對(duì) T 細(xì)胞克隆性的進(jìn)一步檢查顯示榛斯，與無反應(yīng)性腫瘤相比，反應(yīng)性腫瘤中擴(kuò)增的 Th1 樣細(xì)胞顯著增加肠仪，這支持此類細(xì)胞對(duì) ICB 治療的關(guān)鍵作用肖抱。使用先前發(fā)表的基底細(xì)胞癌 (BCC) 數(shù)據(jù)集，還觀察到治療后反應(yīng)性腫瘤中 Th1 樣細(xì)胞的富集异旧，表明伴隨腫瘤排斥的抗腫瘤免疫得到改善意述。
為了評(píng)估浸潤(rùn)的 CD8+ T 細(xì)胞，首先對(duì)剩余的腫瘤活檢進(jìn)行免疫組織化學(xué) (IHC) 染色，并觀察到 scRNA-seq 和染色數(shù)據(jù)之間 CD8+ T 細(xì)胞比例的顯著相關(guān)性荤崇，這表明 scRNA-seq 可能反映拌屏，至少在部分，這些細(xì)胞群的真實(shí)浸潤(rùn)水平术荤。在比較治療反應(yīng)之間的 CD8+ T 細(xì)胞群時(shí)倚喂，發(fā)現(xiàn)與無反應(yīng)性腫瘤相比，反應(yīng)性腫瘤表現(xiàn)出更高豐度的 CD8+ T 細(xì)胞瓣戚，這與之前的觀察結(jié)果一致端圈，即 CD8+ T 細(xì)胞浸潤(rùn)到腫瘤中可以預(yù)測(cè)存活率和對(duì)免疫治療的反應(yīng)。為了進(jìn)一步了解 CD8+ T 細(xì)胞對(duì)基于 PD-1 療法的反應(yīng)子库，對(duì)這 59,656 個(gè) CD8+ T 細(xì)胞進(jìn)行了聚類舱权，并確定了三個(gè)廣泛的細(xì)胞群——末端 Tex、未耗盡和增殖性 CD8+ T 細(xì)胞仑嗅。終末 Tex 細(xì)胞的特點(diǎn)是耗竭特征的高表達(dá)宴倍，包括 PDCD1、CTLA4 和 HAVCR2仓技。Emerging evidence demonstrates that terminal Tex cells in tumors are specifically derived from tumor-specific Tcells, whereas Tcells responsible for acute infections do not give rise to Tex cells.Thus, a terminal Tex subset could be used as a proxy for a tumor-reactive T-cell compartment. 為了進(jìn)一步支持這一觀點(diǎn)鸵贬，分析了先前報(bào)道的腫瘤抗原特異性 T 細(xì)胞的特征基因——ENTPD1 和 ITGAE——并發(fā)現(xiàn)它們?cè)谀┒?Tex 子集中特異性表達(dá)。此外脖捻，進(jìn)一步檢查了三個(gè)先前發(fā)表的腫瘤特異性 CD8+ T 細(xì)胞數(shù)據(jù)集阔逼，發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞始終高度表達(dá)一組耗竭特征基因，與我們數(shù)據(jù)中的終端 Tex 子集有著深刻的相似性郭变。以往的研究表明颜价，PD-1通路阻斷可以在一定程度上改善慢性病毒感染過程中末端Tex亞群的效應(yīng)功能涯保。為了確定是否可以在人肺癌中觀察到這種現(xiàn)象诉濒，我們對(duì)那些報(bào)道的效應(yīng)基因進(jìn)行了 GSEA 分析。并且夕春，事實(shí)上未荒，在響應(yīng)性腫瘤治療后，這些基因的末端 Tex 子集顯著富集及志，表明它們?cè)谥委熀笮?yīng)功能得到改善.
為了解決腫瘤消退是否主要由末端 Tex 細(xì)胞驅(qū)動(dòng)片排，如其他癌癥類型所示，進(jìn)一步分析了末端 Tex 細(xì)胞頻率的變化并觀察到兩種不同的模式速侈。對(duì)于治療前具有低終末 Tex 浸潤(rùn)的反應(yīng)性腫瘤率寡，PD-1 阻斷優(yōu)先增加此類細(xì)胞的比例，提示治療后腫瘤反應(yīng)性 T 細(xì)胞浸潤(rùn)增加或擴(kuò)增倚搬，這與之前的臨床觀察一致冶共，即耗竭樣 T 細(xì)胞與人類黑色素瘤和乳腺癌的抗 PD-1 療法有關(guān)。相比之下，具有高基線終末 Tex 浸潤(rùn)的腫瘤表現(xiàn)出相反的模式捅僵，這些細(xì)胞的相對(duì)頻率急劇下降家卖，表明除了終末 Tex 細(xì)胞外，其他細(xì)胞群也可能在腫瘤控制中發(fā)揮重要作用庙楚。由于多項(xiàng)小鼠研究表明抗 PD-1 也可以靶向 Texp 細(xì)胞以增強(qiáng)抗腫瘤免疫上荡，我們接下來試圖確定這些前體以解決終末 Tex 細(xì)胞比例的波動(dòng)。
Tex precursors within the tumor
分析 Texp 細(xì)胞的典型程序是首先通過聚類來識(shí)別不同的細(xì)胞組馒闷，然后檢查與終端 Tex 子集具有最多共享 TCR 的cluster酪捡。然而，之前的分析表明纳账，此類cluster可能包含與末端 Tex 和血液效應(yīng)細(xì)胞獨(dú)立連接的 TCR沛善，這意味著未耗盡的腫瘤反應(yīng)性 T 細(xì)胞和潛在的旁觀者細(xì)胞可能由于相似的轉(zhuǎn)錄表型而落入同一cluster。為了更好地識(shí)別和表征 Texp 細(xì)胞塞祈，應(yīng)用了基于 TCR 的選擇策略金刁，主要考慮兩個(gè)方面：（1）通過基于耗竭標(biāo)記的高表達(dá)的無監(jiān)督聚類，可以很容易地將終端 Tex 子集與其他細(xì)胞區(qū)分開來议薪，以及（ 2) TCR 提供了一個(gè)可靠的分子標(biāo)簽來追蹤 Tex 細(xì)胞的譜系尤蛮。因此，在這里只選擇了與終端 Tex 細(xì)胞共享 TCR 的終端 Tex 和未耗盡的 CD8+ Tcell斯议，并對(duì)這些細(xì)胞應(yīng)用了無監(jiān)督聚類产捞。除了終末和增殖性 Tex 細(xì)胞外，還確定了兩種非衰竭細(xì)胞狀態(tài)哼御，其中 TCR 與終末 Tex 子集 GZMK+NR4A2-和 GZMK+NR4A2+ Tcells 共享坯临，每個(gè)都有其獨(dú)特的特征基因。兩個(gè)cluster都顯示共抑制分子的表達(dá)減少恋昼，而 GZMK 的表達(dá)增加看靠。
以前的小鼠研究已經(jīng)定義了 Tex 細(xì)胞的詳細(xì)發(fā)育框架，因此我們使用報(bào)告的干細(xì)胞液肌、暫時(shí)性和終末 Tex 細(xì)胞的特征基因進(jìn)行了進(jìn)一步的 GSEA 分析挟炬，以更好地表征人肺癌中 Tex 亞群特異性生物學(xué)∴露撸可以肯定的是谤祖，GZMK+NR4A2–/+ 細(xì)胞與 Beltra 等人定義的中間 Tex 細(xì)胞具有最高的相似性。GZMK+NR4A2–/+ 細(xì)胞也顯示出與 Beltra 等人定義的 Texprog2 細(xì)胞高度相似老速，盡管與 GZMK+NR4A2+ 細(xì)胞相比粥喜，GZMK+NR4A2– 細(xì)胞具有更強(qiáng)的富集。值得注意的是橘券，研究中的終端 Tex 細(xì)胞被選擇性地富集了小鼠 Tex 細(xì)胞的終端分化特征额湘，證明了該cluster的穩(wěn)定性秕铛。此外，對(duì)常駐記憶和循環(huán) T 細(xì)胞特征的分析顯示缩挑，從 GZMK+NR4A2– 到 GZMK+NR4A2+ 細(xì)胞但两，再到末端 Tex 細(xì)胞，組織駐留表型增加供置，循環(huán)表型顯示相反的模式谨湘。使用先前發(fā)表的肺癌 Smart-seq2 數(shù)據(jù)進(jìn)行的類似分析進(jìn)一步證明了 GZMK+NR4A2–/+ 細(xì)胞的前體表型和末端 Tex 子集的穩(wěn)定性。這些分析為從 GZMK+NR4A2– 到 GZMK+NR4A2+ 細(xì)胞芥丧，再到末端 Tex 細(xì)胞的逐步發(fā)育程序提供了寶貴的見解紧阔，RNA velocyto分析進(jìn)一步支持了這種潛在的分化軌跡，盡管需要額外的功能驗(yàn)證续担∩玫ⅲ總之，使用基于 TCR 的選擇方法物遇，發(fā)現(xiàn) GZMK+NR4A2–乖仇、GZMK+NR4A2+、終末和增殖性 Tex 細(xì)胞是人類肺腫瘤中存在的四種轉(zhuǎn)錄不同的 Tex 細(xì)胞群询兴。為清楚起見乃沙，GZMK+NR4A2–/+ 子集在此稱為 Texp1 (GZMK+NR4A2–) 和 Texp2 (GZMK+NR4A2+) 細(xì)胞
CXCL13 expression in Tex cells
當(dāng)將 Tex（終端 Tex 和 Texp）細(xì)胞與那些與終端 Tex 子集（Tex 無關(guān)細(xì)胞）不共享 TCR 的 CD8+ Tcell 進(jìn)行比較時(shí)，發(fā)現(xiàn) CXCL13 在終端 Tex 和 Texp 細(xì)胞中高度且僅表達(dá)诗舰。 Tex 細(xì)胞產(chǎn)生的 CXCL13 可以介導(dǎo)免疫細(xì)胞向腫瘤募集警儒，并且可能是形成三級(jí)淋巴結(jié)構(gòu)的驅(qū)動(dòng)因素之一。然而眶根，先前對(duì)未經(jīng)治療的腫瘤的研究報(bào)告稱蜀铲，CXCL13 僅由末端 Tex 子集表達(dá)。為了解決這個(gè)問題属百，分析了處理前后 Texp 細(xì)胞中 CXCL13 的表達(dá)记劝，發(fā)現(xiàn) CXCL13 僅在處理后的 Texp 細(xì)胞中高表達(dá)，而不是預(yù)處理诸老。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這一點(diǎn)隆夯，收集了來自 NSCLC 和其他癌癥類型的四個(gè)已發(fā)表的未經(jīng)治療的 T 細(xì)胞數(shù)據(jù)集，試圖調(diào)查 CXCL13 在腫瘤浸潤(rùn) CD8+ T 細(xì)胞中的表達(dá)别伏。為了解決由dropout事件引入的潛在偏差，應(yīng)用 MetaCell 算法來識(shí)別同質(zhì)細(xì)胞組 - meta細(xì)胞忧额，其分析揭示了耗竭評(píng)分與 CXCL13 表達(dá)之間的顯著相關(guān)性厘肮。此外，發(fā)現(xiàn) CXCL13 在所有分析的癌癥類型的末端 Tex 子集中高度且唯一地表達(dá)睦番，在 Texp 和其他 CD8+ T 細(xì)胞中幾乎檢測(cè)不到表達(dá)类茂。為了進(jìn)一步探索 CXCL13 的表達(dá)耍属，專注于具有匹配血樣的數(shù)據(jù)集，并分析了外周 Tex-TCR 共享 CD8+ T 細(xì)胞的表達(dá)巩检，這些細(xì)胞處于非耗竭狀態(tài)厚骗，可以很容易地與終端 Tex 子集區(qū)分開來。值得注意的是兢哭，CXCL13 在外周 Texp 細(xì)胞中僅表現(xiàn)出罕見的表達(dá)领舰，這意味著僅當(dāng)細(xì)胞處于腫瘤微環(huán)境中時(shí) CXCL13 才會(huì)上調(diào)。最近的研究表明迟螺，在同時(shí)存在 TCR 刺激和 TGF-β 受體信號(hào)傳導(dǎo)的情況下冲秽，CXCL13 被 CD8+ T 細(xì)胞上調(diào)，進(jìn)一步支持了這樣的觀點(diǎn)矩父，即在未接受治療的腫瘤中锉桑，腫瘤反應(yīng)性 T 細(xì)胞中 CXCL13 的上調(diào)是沿著耗竭軸的由于慢性抗原刺激。因此窍株，分析結(jié)果暗示民轴，那些治療后表達(dá) CXCL13 的 Texp 細(xì)胞可能是通過 PD-1 抗體阻斷向終末 Tex 細(xì)胞的轉(zhuǎn)變而形成的，而 CXCL13 表達(dá)不受影響球订。
Accumulation of Texp cells in responsive tumors after treatment
為了進(jìn)一步檢驗(yàn)上述假設(shè)并解決終端 Tex 細(xì)胞的減少杉武，接下來研究了 Texp 細(xì)胞的豐度在治療過程中是如何變化的。在 14 個(gè)治療后腫瘤樣本中辙售，13 個(gè)來自原發(fā)性肺腫瘤 (n=7) 或淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 (n=6)轻抱。因此，首先評(píng)估了 Tex 子集在不同類型的活檢部位之間是否具有可比性旦部，并發(fā)現(xiàn)這些populations可以通過無監(jiān)督聚類和監(jiān)督細(xì)胞類型分類一致地捕獲祈搜，證明它們的穩(wěn)定性。為了能夠精確評(píng)估 Tex 子集比例士八，接下來分析了每個(gè)腫瘤中的每個(gè)顯性高置信度 Tex 克隆容燕。關(guān)注響應(yīng)性腫瘤，觀察到來自治療前腫瘤的大多數(shù) Tex 細(xì)胞處于最終耗盡狀態(tài)婚度，而治療后的 Tex 細(xì)胞富含 Texp 細(xì)胞蘸秘，并且在八個(gè)響應(yīng)性腫瘤中的六個(gè)中一致觀察到這種模式（P010、P013 蝗茁、P019醋虏、P030、P033 和 P035）哮翘。值得注意的是颈嚼，由于 Tex 細(xì)胞計(jì)數(shù)較低 (<30)，其中一種反應(yīng)性腫瘤 P029 未包括在該分析中饭寺。對(duì)反應(yīng)性腫瘤中每個(gè)顯性 Tex 克隆的進(jìn)一步差異表達(dá)分析顯示阻课，與治療前相比叫挟，治療后的 Tex 細(xì)胞始終表達(dá)較低水平的耗竭基因，支持 Texp 細(xì)胞響應(yīng)治療而增加限煞。通過對(duì)來自四個(gè)初治和三個(gè)治療中反應(yīng)性腫瘤的剩余活檢材料進(jìn)行多色 IHC 染色抹恳，證實(shí)了表達(dá) CXCL13 的 Texp 細(xì)胞（CD8A+CXCL13+TIM3–）和末端 Tex 細(xì)胞（CD8A+CXCL13+TIM3+）的存在）。此外署驻，表達(dá) CXCL13 的 Texp 細(xì)胞在處理后顯示出更高的豐度奋献，這與我們的 scRNA-seq 數(shù)據(jù)一致。
接下來硕舆，將分析重點(diǎn)放在治療后無反應(yīng)的腫瘤以及剩余的未經(jīng)治療的腫瘤上秽荞。與預(yù)處理響應(yīng)樣本一樣，這些腫瘤未能積累 Texp 細(xì)胞抚官，其中終端 Tex 子集占主要比例扬跋。因此，與反應(yīng)性腫瘤相比凌节，治療后無反應(yīng)性腫瘤中的 Tex 細(xì)胞表現(xiàn)出整體更高的耗竭特征表達(dá)水平钦听，證明了 Texp 細(xì)胞在癌癥治療中的重要性。接下來將 Tex 無關(guān)細(xì)胞與 Tex 細(xì)胞進(jìn)行了比較倍奢，以試圖進(jìn)一步了解前者對(duì)治療的反應(yīng)朴上。通過使用先前開發(fā)的 STARTRAC 指數(shù)定義克隆擴(kuò)增，觀察到與 Tex 無關(guān)的細(xì)胞相比卒煞，Tex 細(xì)胞表現(xiàn)出顯著更高的擴(kuò)增水平痪宰，支持 Tex 克隆的腫瘤特異性。此外畔裕，對(duì) Tex 無關(guān)細(xì)胞cluster的仔細(xì)檢查顯示衣撬，這些亞群在治療后并未始終顯示出更高的克隆擴(kuò)增，這表明 Tex 亞群可能是先前報(bào)道的對(duì)基于 PD-1 的療法有反應(yīng)的主要細(xì)胞類型扮饶，盡管未來的研究需要驗(yàn)證
為了解決 Texp 細(xì)胞的作用是否僅在肺癌治療期間存在具练，分析了來自反應(yīng)性 BCC、鱗狀細(xì)胞癌 (SCC) 和黑色素瘤腫瘤的 ICB 治療前后 CD8+ T 細(xì)胞的三個(gè)現(xiàn)有數(shù)據(jù)集甜无。由于基于 TCR 的 Texp 細(xì)胞識(shí)別需要在處理前和處理后捕獲大克隆扛点，這可能不適合這些數(shù)據(jù)集，因此隨后進(jìn)行了基于meta細(xì)胞的計(jì)算機(jī)熒光激活細(xì)胞分選 (FACS) 以區(qū)分表達(dá) CXCL13 的細(xì)胞來自其他細(xì)胞的 Texp 細(xì)胞岂丘。值得注意的是陵究，這種方法很容易在我們的數(shù)據(jù)中識(shí)別終端 Tex 和 CXCL13+ Texp 細(xì)胞，并產(chǎn)生類似于基于 TCR 選擇的聚類的結(jié)果元潘。對(duì) BCC 和 SCC 的進(jìn)一步分析顯示畔乙，PD-1 阻斷后末端 Tex 細(xì)胞增加，表明腫瘤內(nèi)腫瘤反應(yīng)性細(xì)胞數(shù)量增加翩概，但在這兩種癌癥類型中未觀察到 CXCL13+ Texp 細(xì)胞牲距，這可能是由于更大程度的免疫抑制在腫瘤微環(huán)境（TME）中。接下來檢查了黑色素瘤中的 CXCL13+ Texp 細(xì)胞钥庇。與我們的數(shù)據(jù)相似牍鞠，這些細(xì)胞在治療后在反應(yīng)性腫瘤中富集，在無反應(yīng)性腫瘤中幾乎檢測(cè)不到豐度评姨∧咽觯總的來說，我們的分析表明（1）治療后黑色素瘤中 Texp 細(xì)胞也可能增加吐句，（2）Tex 細(xì)胞可能對(duì)不同癌癥類型的 ICB 治療有不同的反應(yīng)胁后，盡管需要進(jìn)一步研究來調(diào)查這一點(diǎn)。
Local expansion of pre-existing Texp cells
關(guān)于我們數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)的 Texp 細(xì)胞增加的一個(gè)重要問題是這些細(xì)胞的來源嗦枢。 三種可能的模式可以解釋 Texp 細(xì)胞的形成：（1）通過處理將末端 Tex 亞群重編程為 Texp 細(xì)胞攀芯； (2) 預(yù)先存在的 Texp 細(xì)胞的局部擴(kuò)增； (3)用外周T細(xì)胞補(bǔ)充文虏。 關(guān)于其中的第一個(gè)侣诺，Pauken 等人先前對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒 (LCMV) 進(jìn)行了研究。 證明末端 Tex 細(xì)胞由于其表觀遺傳穩(wěn)定性而無法獲得記憶 T 細(xì)胞表型氧秘，與本報(bào)告一致年鸳，我們上述 RNA velocyto分析揭示了從 Texp 到末端 Tex 細(xì)胞的清晰單向流動(dòng)，支持不可逆分化為終末耗竭的 T 細(xì)胞丸相，盡管進(jìn)一步需要對(duì)人類腫瘤衍生的終末 Tex 細(xì)胞進(jìn)行直接測(cè)試搔确。
接下來評(píng)估了預(yù)先存在的 Texp 細(xì)胞是否可以響應(yīng)治療而擴(kuò)增。盡管 Texp 細(xì)胞豐度低灭忠，但它們確實(shí)在預(yù)處理腫瘤中被識(shí)別出來膳算，這得到了對(duì)單個(gè) Tex 克隆的更仔細(xì)檢查的進(jìn)一步支持。針對(duì)反應(yīng)性腫瘤更舞，發(fā)現(xiàn)在治療前腫瘤中可以檢測(cè)到相當(dāng)大一部分治療后 Tex 克隆型畦幢，相當(dāng)于治療后 Tex 細(xì)胞的 62.2%。此外缆蝉，這種重新出現(xiàn)的（預(yù)先存在的）克隆型在大尺寸上顯著富集宇葱，表明它們?cè)谀[瘤抗原識(shí)別和進(jìn)一步的抗腫瘤活性中起主要作用。為了進(jìn)一步驗(yàn)證第二種模式刊头，隨后將分析重點(diǎn)放在預(yù)處理增殖性 Tex 細(xì)胞上黍瞧，以研究該cluster是否包含某些 Texp 細(xì)胞。在這里原杂，使用基于 metacell 的 in silico FACS 來區(qū)分 Texp 和終端 Tex 細(xì)胞印颤。作為一個(gè)測(cè)試案例，我們首先表明這種方法可以有效識(shí)別小鼠 LCMV 模型中的祖細(xì)胞 (Tcf1+) 和末端 Tex 細(xì)胞穿肄，準(zhǔn)確率為 98.1%年局。當(dāng)將這種方法應(yīng)用于我們的數(shù)據(jù)時(shí)际看，我們?cè)陬A(yù)處理腫瘤內(nèi)鑒定了增殖性 Texp 細(xì)胞，證明可能發(fā)生預(yù)先存在的 Texp 細(xì)胞的擴(kuò)增矢否，并且是 Texp 細(xì)胞響應(yīng)治療而積累的重要模式仲闽。
Clonal revival of tumor-specific T cells
除了處理前和處理后都存在的克隆外，通過進(jìn)一步分析處理前不存在的新克隆來探索 Texp 細(xì)胞增加的現(xiàn)象僵朗，發(fā)現(xiàn)這些新克隆也表現(xiàn)出相對(duì)于克隆而言更高比例的 Texp 細(xì)胞赖欣。 之前有人提出新的 Tex 克隆來自腫瘤外的位點(diǎn)，這促使我們認(rèn)為我們研究中重新出現(xiàn)的克隆验庙，就像新克隆一樣顶吮，除了局部擴(kuò)增模式外，也可能用最近招募的新鮮細(xì)胞進(jìn)行補(bǔ)充
為了進(jìn)一步研究 Texp 細(xì)胞是否可以從外周補(bǔ)充粪薛，我們對(duì)匹配的治療前和治療后血液樣本進(jìn)行了批量 TCR-seq悴了，用于四個(gè)響應(yīng)樣本，發(fā)現(xiàn)在腫瘤組織中擴(kuò)增的那些克隆型也可以在血液中檢測(cè)到汗菜。此外让禀，通過將腫瘤中的所有共享克隆型與血液中的克隆型進(jìn)行匹配來擴(kuò)展我們的分析，并觀察到克隆大小的普遍且顯著的相關(guān)性陨界，這與先前的觀點(diǎn)一致巡揍，即外周 T 細(xì)胞可以作為腫瘤內(nèi) T 細(xì)胞池提供。為了進(jìn)一步證明這一觀點(diǎn)菌瘪，分析了外周血治療后出現(xiàn)的新的瘤內(nèi) Tex 克隆型的克隆豐度腮敌。值得注意的是，大多數(shù)新的 Tex 克隆型 (87%) 僅在治療后的血液中檢測(cè)到俏扩，支持在治療后激活具有新腫瘤抗原特異性的新克隆糜工。有趣的是，對(duì)于那些治療后預(yù)先存在的腫瘤內(nèi) Tex 克隆型也觀察到了類似的模式录淡，63% 的預(yù)先存在的 Tex 克隆型僅在治療后的血液中檢測(cè)到捌木，并且許多此類克隆型在治療前在腫瘤中是大尺寸的。為了解決這種現(xiàn)象是否由潛在的測(cè)序偏差引起嫉戚，我們分析了已發(fā)布的 BCC 數(shù)據(jù)集刨裆，并進(jìn)一步證實(shí)了治療后血液中重新出現(xiàn)的 Tex 克隆型的富集。治療可能增強(qiáng)了腫瘤反應(yīng)性克隆的激活和擴(kuò)增彬檀，導(dǎo)致外周血中此類克隆的豐度增加帆啃。
盡管外周和瘤內(nèi) T 細(xì)胞共享 TCR，但 Texp 細(xì)胞遷移的方向尚不清楚窍帝。 為了進(jìn)一步解決這個(gè)問題努潘，對(duì) P019 的剩余冷凍治療后血樣進(jìn)行了配對(duì) scRNA-seq 和 scTCR-seq，其采樣時(shí)間點(diǎn)與治療后腫瘤活檢的采樣時(shí)間點(diǎn)相同，但 CXCL13 均不表達(dá) 在這些外周 Texp 和其他 CD8+ T 細(xì)胞中疯坤。 為了解決這一觀察結(jié)果是否是由于dropout事件报慕，對(duì)治療后的瘤內(nèi) Texp 細(xì)胞進(jìn)行了排列分析，以估計(jì)平均 CXCL13 表達(dá)的分布贴膘，并且該分析進(jìn)一步證明了外周和瘤內(nèi) Texp 細(xì)胞之間 CXCL13 表達(dá)的差異卖子。 我們的數(shù)據(jù)以及之前的報(bào)告支持 T 細(xì)胞向腫瘤的遷移略号，盡管需要更直接的證據(jù)來證實(shí)這種遷移方向
正如我們的分析表明刑峡，除了用新的 Tex 克隆進(jìn)行克隆替換外，與預(yù)先存在的 Tex 克隆共享相同克隆型的細(xì)胞可以被重新激活并在治療后進(jìn)一步進(jìn)入腫瘤玄柠。為了進(jìn)一步了解新的和重新出現(xiàn)的（預(yù)先存在的）Tex 克隆在癌癥治療過程中的貢獻(xiàn)突梦，我們將我們的數(shù)據(jù)與已發(fā)布的 BCC 和 SCC 數(shù)據(jù)集相結(jié)合，并將治療前腫瘤中 Tex 克隆的數(shù)量與重新出現(xiàn)的比例進(jìn)行匹配處理后的 Tex 克隆羽利。很明顯宫患，重新出現(xiàn)的 Tex 克隆的頻率隨著預(yù)處理 Tex 克隆的數(shù)量而單調(diào)增加。該分析表明这弧，大多數(shù) BCC 腫瘤的基線 Tex 浸潤(rùn)較低娃闲，因此阻斷 PD-1 將增強(qiáng)新 Tex 克隆的擴(kuò)增和浸潤(rùn)，大概是通過促進(jìn)新腫瘤新抗原的處理匾浪。相比之下皇帮，肺癌樣本往往是“熱腫瘤”，治療前的腫瘤內(nèi) Tex 克隆庫(kù)已經(jīng)包括大量腫瘤特異性克隆型蛋辈∈羰埃總的來說，我們的數(shù)據(jù)表明冷溶，新的和預(yù)先存在的 Tex 克隆在癌癥治療中都可能很重要渐白，我們將治療后外周 T 細(xì)胞補(bǔ)充的現(xiàn)象稱為“克隆復(fù)興”，作為對(duì)以前的確認(rèn)和延伸克隆替換模型逞频。
Discussion
在這項(xiàng)研究中纯衍，我們利用 scRNA-seq 來了解抗 PD-1 與化療聯(lián)合治療的機(jī)制。 使用基于 TCR 的譜系追蹤苗胀，我們確定了人類肺癌中存在的兩種 Texp 細(xì)胞狀態(tài)襟诸，這些狀態(tài)與 GZMK 的高表達(dá)和衰竭特征的低表達(dá)相關(guān)。 這些 Texp 細(xì)胞在治療后反應(yīng)性腫瘤中顯著增加柒巫，并且可能是對(duì)基于 PD-1 的療法有反應(yīng)的主要細(xì)胞類型励堡，這與之前的研究一致。 我們的數(shù)據(jù)表明堡掏，這些 Texp 細(xì)胞不太可能來自終端 Tex 子集的恢復(fù)应结； 相反，它們是通過克隆復(fù)蘇和預(yù)先存在的 Texp 細(xì)胞的擴(kuò)增而積累的，提供了對(duì) ICB 治療機(jī)制的見解鹅龄。
盡管某些 NSCLC 腫瘤中存在高基線 Tex 浸潤(rùn)細(xì)胞揩慕，但僅在治療后的血液中檢測(cè)到腫瘤中許多預(yù)先存在的 Tex 克隆型。 一種可能的解釋是扮休，隨著腫瘤進(jìn)展的免疫抑制活性增加迎卤，在早期癌癥階段激活的某些腫瘤反應(yīng)性克隆隨著時(shí)間的推移在血液中逐漸減少。 通過基于 PD-1 的治療玷坠，這些克隆被激活和擴(kuò)展蜗搔，導(dǎo)致血液中的豐度增加。 此外八堡，新的和預(yù)先存在的 Tex 克隆的克隆復(fù)蘇表明樟凄，除了局部擴(kuò)增外，新招募的 Texp 細(xì)胞兄渺，無論是來自外周還是其他來源缝龄，如淋巴器官，可能是成功治療的另一個(gè)關(guān)鍵因素挂谍，盡管各自的 這兩種模式對(duì)抗腫瘤免疫的貢獻(xiàn)需要進(jìn)一步研究叔壤。
Our analysis revealed that ICB treatment in different cancer types may have varied effects on Tex cell subsets. BCC and SCC tumors exhibited a notable expansion of terminal Tex cells in response to ICB and this expansion was also observed in a recent breast cancer study, whereas lung cancer and melanoma tumors tended to accumulate Texp cells, with terminal Tex cells dramatically decreased following treatment. This difference was possibly due to a variable degree of immunosuppression in different cancer types, or to the concurrent chemotherapy used in these patients with lung cancer. Future therapeutic strategies to enhance the accumulation of Texp cells may further improve the clinical response of these cancers. In this study, we considered terminal Tex cells as a proxy for a tumor-reactive T-cell compartment and performed subsequent analysis based on these Tex clonotypes, although future in vitro experiments would be needed
to demonstrate tumor specificity. Given the challenge in collecting consecutive clinical tumor biopsies from patients with NSCLC before and during anti-PD-1 treatment, limited samples were used in this study and thus future work based on larger cohorts of anti-PD1-treated patients is needed to generalize our findings. In addition, our results are mainly based on transcriptomic data and further functional experiments are required for validation.
Methods
張澤民老師很喜歡python的單細(xì)胞處理軟件scanpy啊~~~
Metacell的算法還是要認(rèn)真研究一下
生活很好，有你更好
