題目：A single-cell survey of cellular hierarchy in acute myeloid leukemia
發(fā)表期刊：Journal of Hematology & Oncology (IF:23.2)
發(fā)表年份：2020-09
摘要
Background:急性髓系白血病 （AML） 是一種致命的造血惡性腫瘤螟凭，其預后與遺傳復雜性相關(guān)。目前尚未有從單細胞水平對不同 AML 亞型進行綜合分析掂榔。
Methods:使用Microwell-seq平臺弯予，分析了來自40名患者和3名健康供體的骨髓樣本的單細胞轉(zhuǎn)錄組測序。還使用single-cell single-molecule real-time (SMRT)測序來研究AML細胞的克隆異質(zhì)性。
Results：通過對191727個AML細胞的數(shù)據(jù)分析籍滴，建立了一個單細胞層面的AML“景觀”，并鑒定了一群具有新型AML marker的AML祖細胞群體,推斷出兩種具有不同臨床結(jié)局的AML亞型榴啸。聯(lián)合 Microwell-seq 和 SMRT sequencing探究AML中的線粒體突變孽惰。且提出存在一種表型“cancer attractor”, 這可能有助于定義AML祖細胞具有的共同表型。最后插掂，通過比較AML landscape和Human Cell Landscape來探索潛在的藥物靶點灰瞻。
Conclusion:他們鑒定出了一群的AML祖細胞群腥例。核糖體蛋白基因水平高表明提示病人預后不良辅甥。還推斷出具有不同臨床結(jié)局的AML亞型，并探索了潛在的藥物靶點燎竖。這些結(jié)果表明AML存在cancer attractor璃弄。
實驗設計及質(zhì)控
樣本： 40 病人和3個健康對照人的骨髓單核細胞(BMMC,Bone marrow mononuclear cell)
細胞：
結(jié)果
1.正常人BMMC單細胞分析
使用了Microwell-seq對三個健康供體BMMC進行分析(Figure 1A and B).
2.鑒定初發(fā)AML的造血細胞群體
對40個AML樣本和3個健康對照樣本進行批次矯正后纤掸，得到20個亞群脐供。中性粒細胞，單核細胞借跪，紅系細胞和淋巴細胞都可在AML樣本和正常樣本中找到(Figure 2A and B).但是中央有一團細胞無特異性的基因表達(Figure 2C).
3.AML progenitor cells的特征
與髓系細胞相比掏愁，AML progenitor cells和HSPC有許多共同的上調(diào)基因歇由，尤其是核糖體蛋白基因(RP,ribosomal protein genes,Figure 3A).通路富集分析顯示AML祖細胞具有較高的RB基因轉(zhuǎn)錄活性（圖卵牍。(Figure 3B).
盡管存在RP基因表達的相似性，但是一些基因在HSPC沦泌，糊昙，AML progenitor cells和髓系細胞中的表達差異還是比較大的。
4.AML progenitor cells的瘤內(nèi)異質(zhì)性可預測預后
AML progenitor cells比例在病人異質(zhì)性很大(Figure S5A).
富集分析表明，在RP gene high clusters中榔昔，C1和C2在調(diào)節(jié)肌動蛋白細胞骨架中起作用驹闰。C4與P53通路有關(guān)。C11富含癌蛋白聚糖撒会。在neutrophil-like種嘹朗，C5和C15與IL-17信號通路和癌癥翻譯失調(diào)有關(guān)。C7和C8富含MYC通路(Figure 4C).
5.AML progenitor cells對于從AML的診斷和復發(fā)的臨床意義
接著觀察治療前后的細胞比例變化，將N02作為對照薛训，在緩解樣本中(P-extra 1隊列)媒吗，治療后的大多數(shù)細胞與正常細胞的重疊，其中AML progenitor cells和增殖細胞的數(shù)量減少乙埃，而中性粒細胞增加(Figure 5A-B). 髓系亞群基因在正常細胞中高表達闸英，而AML progenitor cells 基因主要在P-extra 1隊列治療前的隊列表達(Figure 5J). 在緩解的樣本中，RP和primitive genes在治療前表達量高介袜，治療之后卻比較低甫何，中性粒細胞基因則表現(xiàn)出相反的趨勢(Figure 5J).在復發(fā)樣本中（P20 隊列），骨髓中AML progenitor cells 占主導地位米酬，RP和primitive genes在治療前和治療后表達量均高(Figure 5K).
6.單核細胞白血病的瘤內(nèi)異質(zhì)性
然后沛豌，將分析重點放在一種亞型AML-M5上趋箩，并整合了15種單核細胞白血病的數(shù)據(jù)赃额。在此研究中，P06叫确、P14和P16是難治型AML患者跳芳；其余12例為非難治性患者。
AML祖細胞在患者中的比例差異很大（Figure S11A）竹勉。隨機選擇了12000個細胞難治型樣本（C5）和非難治性患者（C13）分析（Figure S11B-E）飞盆。GSEA表明與C13相比，MYC、SRC吓歇、RELA孽水、原癌基因MTOR相關(guān)通路在C5中過表達，表明C13惡性程度更高（Figure S11F）城看。TCGA-AML中女气，SRC和MTOR的高表達水平提示預后較差（FigureS11G）。GO分析揭示了
C5中的TF测柠，如CEBPG炼鞠、GATA2、MAX和
JUN基因集在C5中處于激活狀態(tài)轰胁，而CEBPE谒主、GATA1、MAZ赃阀、费尽，
7.單細胞水平SMRT測序與遺傳突變的關(guān)系
由于覆蓋范圍的限制，3′端的單細胞轉(zhuǎn)錄組分析未能識別基因突變磕诊。因此扼脐，將 long-read sequencing與Microwell seq實驗相結(jié)合。我們使用靶向上游引物和通用下游引物從單細胞cDNA中擴增特定基因進行SMRT測序肖抱，可以獲得mutation sites and cell barcodes(Figure 6a).既往研究報道备典，mtDNA突變可提供 innate and natural barcodes來推斷細胞的克隆進化。他們選擇線粒體基因MT-ND4意述，使用SMRT測序進行譜系追蹤提佣。從P25、P10和P17樣本的單個細胞中鑒定到了MT-ND4的異質(zhì)變體荤崇。過濾后拌屏，以MT-ND5轉(zhuǎn)錄本為參考，得到平均3406個讀數(shù)术荤。突變位點的平均測序深度為3041倚喂。其中，UMAP聚類后瓣戚，每個樣本約有711個read端圈。接著將這些細胞分為幾個亞克隆（Figure S12A-C）子库。采用monocle3包舱权，描繪了髓系、紅系和淋巴系的分化軌跡(Figure 6B and Figure S12D and E)仑嗅。這些亞克隆與細胞表型的相關(guān)性很差宴倍。在不同的細胞亞群中檢測到所有MT突變的亞克隆张症，這表明多個細胞克隆可能有助于AML分級，不同的細胞可能在AML中屬于相似類型的“attractor”(Figure 6C and Figure S12 D-E).
8.結(jié)合HCL 數(shù)據(jù)庫探究AML靶點
分析AML landscape和Human Cell Landscape兩者的數(shù)據(jù)后，差異分析得到了AML中高表達基因周伦。在前10個基因中夕春，F(xiàn)LT3是眾所周知的，POU4F1也有報道专挪。其中有一半基因是lncRNA及志。其他是PRSS21、CCL1和DNTT(Figure 7A)寨腔。相關(guān)分析顯示速侈，這前10個基因與AML中最相關(guān)的基因一起屬于兩個網(wǎng)絡(Figure 7B)。RP基因在這兩個網(wǎng)絡中都起著重要作用迫卢。接著倚搬，研究了AML祖細胞群中的前5個相關(guān)蛋白編碼基因，這些基因與腫瘤或髓系分化相關(guān)(Figure 7C).
結(jié)論
研究中使用Microwell-seq分析了來自40名AML患者的191727細胞乾蛤，以建立單細胞層面的AML景觀每界。鑒定出具有新型AML標志物的惡性AML祖細胞亞群。祖細胞RP基因高表達的患者的緩解率較低家卖。推斷出兩種具有不同臨床結(jié)局的AML眨层。我們表明，單細胞分析可用于預測和評估AML治療效果上荡。最后趴樱，通過將Microwell-seq與SMRT測序相結(jié)合，追蹤了AML景觀中的線粒體突變酪捡，并證明了AML克隆與轉(zhuǎn)錄組表型之間缺乏關(guān)聯(lián)叁征。總體研究表明“cancer attractor”的存在可能有助于定義AML祖細胞的共同表型沛善。
