The activity of tumor-infiltrating T cells was evaluated by in vitro activation using PMA plus Ionomycin for 4?h.
PMA(佛波酯)和 Ionomycin(離子霉素)皆為體外培養(yǎng)試驗(yàn)中常用的兩種刺激物慢显。其中 PMA 為 PKC(蛋白激酶 C)的激活物，PKC 則可激活下游眾多的蛋白激酶的磷酸化，形成級(jí)聯(lián)反應(yīng)俊犯，導(dǎo)致許多蛋白的表達(dá)顶岸，進(jìn)而引起 T 細(xì)胞的活化展鸡。在細(xì)胞內(nèi)诵盼，PKC 可被 DAG(二脂酰甘油)和 Ca2+的共同作用而 激活蓄拣，因此在 Ionomycin(Ca2+的轉(zhuǎn)運(yùn)劑拗小，可將細(xì)胞器內(nèi)的 Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)至胞漿內(nèi))的參與下重罪，T 細(xì)胞內(nèi) PKC 可被進(jìn)一步激活。
PKC屬于下游的TCR信號(hào)哀九，只會(huì)誘導(dǎo)T細(xì)胞活化和增殖剿配，因此，PMA和Ionomycin的刺激后T細(xì)胞的活化和增殖能力改變阅束，然而并不會(huì)改變T細(xì)胞的分化狀態(tài)呼胚。
TCR信號(hào)是很強(qiáng)很基礎(chǔ)的刺激，研究者更加傾向于認(rèn)為所有的T細(xì)胞亞群在TCR信號(hào)刺激下的增殖速度是一致的息裸，所以在在體外進(jìn)行PMA和Ionomycin刺激后蝇更，仍然反映的是T細(xì)胞亞群在生物體體內(nèi)的原始比例。
Proliferation was determined by CFSE dilution assay 呼盆，OT-I T cells were activated with 1?μg/ml OVA257-264 (SIINFEKL) peptides. CFSE dilution and intracellular staining were performed on day 2.
CFDA-SE是一種非極性分子,可自由穿透細(xì)胞膜并在細(xì)胞內(nèi)被酯酶轉(zhuǎn)化成帶負(fù)電荷的并具有綠色熒光的氨基反應(yīng)性羧基熒光素琥珀酰亞胺酯(carboxyfluorescein succinimidyl ester,CFSE)年扩。CFSE是一種對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性的染料,化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定。CFSE一旦進(jìn)入細(xì)胞后不能從細(xì)胞中釋出,并可自發(fā)不可逆地通過(guò)賴氨酸側(cè)鏈或其他可利用的胺偶聯(lián)到細(xì)胞蛋白質(zhì)上,也不會(huì)被代謝降解访圃。細(xì)胞中CFSE含量減少的唯一途徑是通過(guò)細(xì)胞增殖分裂,細(xì)胞中所含的CFSE隨細(xì)胞的增殖分裂進(jìn)入子代細(xì)胞厨幻。因此,CFSE含量減少的細(xì)胞代表增殖的子代細(xì)胞。
無(wú)論是MTT比色法腿时、3H-TdR摻入法,還是BrdU標(biāo)記法,都只能對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè),忽視了某些細(xì)胞已經(jīng)分裂又發(fā)生死亡的可能性;而使用CFSE標(biāo)記,死亡的細(xì)胞將在幾天內(nèi)保持熒光強(qiáng)度基本不變,同時(shí)可使用其它染料將其區(qū)分開(kāi)來(lái),為增殖分析提供了更加全面的資料况脆。
《CFSE標(biāo)記技術(shù)及其在細(xì)胞研究中的應(yīng)用進(jìn)展》
the Heatmap GO analysis on the Metascape website (http://metascape.org) to find out the key regulators.
Each C57BL/6J mouse bearing B16-OVA tumors was injected i.v. with 250?μg of Ultra-LEAF? purified mAb SA271G2 or PBS (negative control). To study the presence of B cells, blood was collected and stained with CD20 antibody.
B細(xì)胞清除：C57小鼠靜脈注射250ug Ultra-LEAFTM Purified anti-mouse CD20 Antibody（Clone：SA271G2）或Ultra-LEAFTM Purified rat IgG2b, κ isotype control。7天之后處死小鼠批糟，取脾臟格了，淋巴結(jié)，骨髓徽鼎，腹腔灌洗液笆搓，并染色性湿。
CD20是4A膜結(jié)構(gòu)域（MS4A）家族的成員，與B細(xì)胞的跨膜鈣流满败、激活和增殖有關(guān)肤频。CD20最初表達(dá)于Pre-B細(xì)胞上，并且除了漿細(xì)胞以久算墨，持續(xù)表達(dá)于B細(xì)胞分化的各個(gè)階段宵荒。
B細(xì)胞清除策略是利用抗體藥物靶向結(jié)合B細(xì)胞特異性抗原，通過(guò)抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用（Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity净嘀，ADCC）或補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒性作用（Complement dependent cytotoxicity报咳，CDC）介導(dǎo)B細(xì)胞裂解，從而清除B細(xì)胞挖藏，或者通過(guò)靶向B細(xì)胞存活需要的細(xì)胞因子暑刃，如B細(xì)胞激活因子（B-cell activation factor，BAFF）誘導(dǎo)B細(xì)胞凋亡膜眠，達(dá)到清除B細(xì)胞的目的岩臣。
Macrophages were depleted by i.v. application of clodronate liposomes (200?μl per mouse; YEASEN, Shanghai, China). The efficiency of macrophages depletion was evaluated using F4-80 antibody by flow cytometry.
氯膦酸二鈉（Clodronate）是一種雙膦酸鹽藥物，在臨床上主要用于癌癥引起的溶骨性骨轉(zhuǎn)移宵膨、骨質(zhì)疏松癥和高鈣血癥架谎。其作用機(jī)理是氯膦酸二鈉在細(xì)胞內(nèi)代謝成不可水解的ATP類似物，抑制線粒體中的ADP/ATP轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制辟躏，從而阻斷線粒體呼吸鏈誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡谷扣。但是該藥物親脂性低，不能跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)捎琐，在口服或是靜脈給予游離藥物后会涎，2小時(shí)后即可達(dá)半衰期，48小時(shí)內(nèi)80%藥物隨尿液排出瑞凑。
氯膦酸鹽包裹進(jìn)磷脂體的水相中形成氯膦酸鹽脂質(zhì)體(4°保存)在塔，氯膦酸鹽不能自由的通過(guò)脂質(zhì)體磷脂體雙分子層。注射到生物體內(nèi)后拨黔，氯膦酸鹽脂質(zhì)體會(huì)被巨噬細(xì)胞吞噬蛔溃，在巨噬細(xì)胞內(nèi)的溶酶體磷酸酶的作用下，溶解在脂質(zhì)體內(nèi)的氯膦酸鹽會(huì)被逐步釋放出來(lái)并在細(xì)胞內(nèi)積累篱蝇，當(dāng)達(dá)到一定濃度時(shí)贺待，巨噬細(xì)胞將會(huì)受到不可逆損傷，誘發(fā)細(xì)胞凋亡零截。死亡細(xì)胞內(nèi)的氯膦酸鹽會(huì)被釋放到細(xì)胞外麸塞，隨尿液排出體外。
可以用于體外巨噬細(xì)胞的清除涧衙，但是這種方法比較適合體內(nèi)實(shí)驗(yàn)哪工。主要是由于在體外培養(yǎng)過(guò)程中奥此，從死亡細(xì)胞釋放的氯膦酸或者是從脂質(zhì)體中“滲漏”出來(lái)氯膦酸，會(huì)一直存在于培養(yǎng)基中雁比，但是在體內(nèi)稚虎，氯膦酸的半衰期很短，很快就會(huì)被腎臟清除偎捎。雖然游離的氯膦酸不會(huì)進(jìn)入細(xì)胞也不會(huì)進(jìn)入脂質(zhì)體蠢终，但是一旦他們?cè)谂囵B(yǎng)基中積累就會(huì)慢慢地進(jìn)入細(xì)胞中。
https://www.yeasen.com/news/detail/122
