Basic Information

• 英文標(biāo)題： An Integrative Model of Cellular States, Plasticity, and Genetics for Glioblastoma
• 中文標(biāo)題：整合細(xì)胞狀態(tài)盐数、可塑性和遺傳學(xué)的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤模型
• 發(fā)表日期：NA
• 文章類(lèi)型：Article
• 所屬期刊：Cell
• 文章作者：Cyril Neftel | Mario L. Suvà
• 文章鏈接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0092867419306877

Highlights

Para_01

• 四種細(xì)胞狀態(tài)驅(qū)動(dòng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤惡性細(xì)胞的異質(zhì)性
• 體內(nèi)單細(xì)胞譜系追蹤支持這四種狀態(tài)之間的可塑性
• 遺傳學(xué)和微環(huán)境影響每種狀態(tài)下細(xì)胞出現(xiàn)的頻率
• TCGA亞型反映了最高頻率的惡性狀態(tài)及微環(huán)境

Summary

Para_01

1. 多種遺傳备绽、表觀遺傳和發(fā)育程序驅(qū)動(dòng)了膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的發(fā)生议泵，這是一種無(wú)法治愈且了解不足的腫瘤占贫，但對(duì)其精確表征仍然充滿挑戰(zhàn)。
2. 在這里先口，我們采用了一種綜合方法型奥，包括28個(gè)腫瘤的單細(xì)胞RNA測(cè)序瞳收、來(lái)自癌癥基因組圖譜（TCGA）的401個(gè)樣本的大規(guī)模遺傳和表達(dá)分析、功能方法以及單細(xì)胞譜系追蹤厢汹，以推導(dǎo)出膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的統(tǒng)一細(xì)胞狀態(tài)和遺傳多樣性模型螟深。
3. 我們發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的惡性細(xì)胞存在于四種主要細(xì)胞狀態(tài)中，這些狀態(tài)重現(xiàn)了不同的神經(jīng)細(xì)胞類(lèi)型烫葬，受到腫瘤微環(huán)境的影響界弧，并表現(xiàn)出可塑性。
4. 每種狀態(tài)下細(xì)胞的相對(duì)頻率在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤樣本之間有所不同搭综，并受到CDK4垢箕、EGFR和PDGFRA位點(diǎn)拷貝數(shù)擴(kuò)增以及NF1位點(diǎn)突變的影響，這些因素各自傾向于一種特定的狀態(tài)兑巾。
5. 我們的工作為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤提供了藍(lán)圖条获，整合了惡性細(xì)胞程序、它們的可塑性及其由遺傳驅(qū)動(dòng)因素調(diào)節(jié)的情況蒋歌。

Graphical Abstract

Keywords

• glioblastoma IDH-wildtype; single-cell RNA-sequencing; lineage tracing; glioblastoma stem cells; glioblastoma subtypes; EGFR; PDGFRA; CDK4; NF1

Introduction

Para_01

1. 膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（異檸檬酸脫氫酶[IDH]野生型）是一種不可治愈的惡性腫瘤帅掘，治療失敗的主要挑戰(zhàn)在于其異質(zhì)性（Louis等人，2016年）堂油。
2. 遺傳修档、表觀遺傳和微環(huán)境信號(hào)影響細(xì)胞程序并驅(qū)動(dòng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的異質(zhì)性。
3. 異質(zhì)性的一個(gè)層面體現(xiàn)在之前描述過(guò)的轉(zhuǎn)錄亞型府框。
4. 基于整體表達(dá)譜的研究表明吱窝，至少存在三種膠質(zhì)母細(xì)胞瘤亞型，即神經(jīng)元傾向型（TCGA-PN）寓免、經(jīng)典型（TCGA-CL）和間充質(zhì)型（TCGA-MES）（Verhaak等人癣诱，2010年；Wang等人袜香，2017年）。
5. 這些基于表達(dá)的亞型部分富集了特定的遺傳事件鲫惶；例如蜈首，PDGFRA變異在TCGA-PN膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中更為常見(jiàn)，而EGFR變異在TCGA-CL膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中更為常見(jiàn)欠母。
6. 這些亞型程序在同一腫瘤樣本內(nèi)也存在差異欢策，多區(qū)域腫瘤采樣顯示不同區(qū)域的同一腫瘤中可以共存多種亞型，縱向分析表明亞型會(huì)隨時(shí)間和治療而變化赏淌，單細(xì)胞RNA測(cè)序（scRNA-seq）提示同一腫瘤中的不同細(xì)胞可以重現(xiàn)來(lái)自不同亞型的程序（Patel等人踩寇，2014年；Sottoriva等人六水，2013年俺孙；Wang等人辣卒，2017年）。

Para_02

1. 膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞在腫瘤中的發(fā)育狀態(tài)構(gòu)成了另一層異質(zhì)性睛榄。
2. 膠質(zhì)母細(xì)胞瘤劫持了神經(jīng)發(fā)育的機(jī)制荣茫，并包含一組被認(rèn)為是其驅(qū)動(dòng)力的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞（GSCs），這些細(xì)胞具有促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)的潛力场靴，并對(duì)放療和化療表現(xiàn)出優(yōu)先抗性啡莉。
3. 盡管各種標(biāo)記物可以富集潛在的GSCs，但目前尚不清楚不同的GSC標(biāo)記物是否隔離出不同的或相似的細(xì)胞狀態(tài)旨剥，以及由不同GSC亞群產(chǎn)生的腫瘤是否具有可比較的或多樣化的細(xì)胞組成咧欣。
4. 此外，解析單向?qū)蛹?jí)結(jié)構(gòu)或更可逆的狀態(tài)轉(zhuǎn)變?cè)诙啻蟪潭壬现渲z質(zhì)母細(xì)胞瘤和GSC生物學(xué)仍然具有挑戰(zhàn)性轨帜。
5. 因此该押，更好地理解膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中遺傳、表觀遺傳阵谚、發(fā)育和微環(huán)境等各種異質(zhì)性的來(lái)源是一個(gè)具有廣泛治療意義的關(guān)鍵目標(biāo)蚕礼。

Para_03

1. 單細(xì)胞RNA測(cè)序(scRNA-seq)已成為全面表征組織中細(xì)胞狀態(tài)的關(guān)鍵方法，無(wú)論是在健康狀態(tài)下還是疾病狀態(tài)下梢什。
2. 在膠質(zhì)瘤中奠蹬，我們已經(jīng)證明可以通過(guò)推斷染色體拷貝數(shù)異常(CNAs)或檢測(cè)表達(dá)轉(zhuǎn)錄本中的突變來(lái)推斷腫瘤的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，并將單細(xì)胞狀態(tài)與遺傳學(xué)聯(lián)系起來(lái)嗡午。
3. 盡管這些方法在解析異檸檬酸脫氫酶(IDH)突變和組蛋白突變膠質(zhì)瘤的關(guān)鍵生物學(xué)特征方面取得了成功囤躁，但在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中卻更具挑戰(zhàn)性。
4. 特別是荔睹，遺傳改變與表觀遺傳狀態(tài)多樣性之間的關(guān)系仍然不清楚狸演，這對(duì)該領(lǐng)域構(gòu)成了巨大挑戰(zhàn)。

Para_04

1. 這里僻他，我們采用了一種綜合方法來(lái)理解膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的轉(zhuǎn)錄和遺傳異質(zhì)性宵距，結(jié)合了20例成人和8例兒童膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（共計(jì)24,131個(gè)細(xì)胞）的單細(xì)胞RNA測(cè)序、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤模型的單細(xì)胞RNA測(cè)序與譜系追蹤以及來(lái)自癌癥基因組圖譜（TCGA）的401個(gè)大量樣本分析吨拗。
2. 我們發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的惡性細(xì)胞存在于一組有限的細(xì)胞狀態(tài)中满哪，這些狀態(tài)重現(xiàn)了（1）神經(jīng)祖細(xì)胞樣（NPC樣），（2）少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞樣（OPC樣）劝篷，（3）星形膠質(zhì)細(xì)胞樣（AC樣）哨鸭，以及（4）間充質(zhì)樣（MES樣）的狀態(tài)。
3. 盡管每個(gè)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤樣本包含多種狀態(tài)的細(xì)胞娇妓，但每種狀態(tài)的相對(duì)頻率在不同腫瘤之間有所變化像鸡。
4. 我們表明這些頻率與CDK4、PDGFRA哈恰、EGFR和NF1中的遺傳改變有關(guān)只估，每種改變都傾向于支持一種特定的狀態(tài)志群。
5. 此外，通過(guò)將帶有唯一條形碼的體內(nèi)單細(xì)胞RNA測(cè)序相結(jié)合仅乓，我們證明了各狀態(tài)之間的可塑性以及單個(gè)細(xì)胞產(chǎn)生所有四種狀態(tài)的潛力赖舟。
6. 我們的工作為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中惡性細(xì)胞的細(xì)胞程序及其可塑性和遺傳驅(qū)動(dòng)因素的調(diào)節(jié)提供了一個(gè)路線圖。

Results

scRNA-Seq Charts Malignant Cells Heterogeneity in Glioblastoma

scRNA-Seq描繪了膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中惡性細(xì)胞的異質(zhì)性

Para_01

1. 為了全面探究IDH野生型膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的腫瘤間和腫瘤內(nèi)異質(zhì)性夸楣，我們使用全長(zhǎng)單細(xì)胞RNA測(cè)序（SMART-Seq2）對(duì)來(lái)自28名跨越成人和兒童群體患者的鮮腫瘤樣本進(jìn)行了分析（圖1A和補(bǔ)充圖S1A宾抓；補(bǔ)充表S1）。
2. 為了專(zhuān)注于惡性細(xì)胞豫喧，我們根據(jù)存活標(biāo)志物以及泛免疫標(biāo)志物CD45對(duì)細(xì)胞進(jìn)行了分選石洗，并主要分析了CD45陰性的細(xì)胞，而對(duì)CD45陽(yáng)性的細(xì)胞僅進(jìn)行了有限的分析紧显。
3. 總計(jì)讲衫，7,930個(gè)細(xì)胞通過(guò)了我們的嚴(yán)格質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)；平均每個(gè)細(xì)胞檢測(cè)到了5,730個(gè)基因孵班，這突顯了我們數(shù)據(jù)集的高質(zhì)量（補(bǔ)充圖S1B涉兽；實(shí)驗(yàn)方法部分）。
4. 我們通過(guò)結(jié)合三種方法將細(xì)胞分類(lèi)為惡性細(xì)胞類(lèi)型和非惡性細(xì)胞類(lèi)型（圖1A篙程、1B和補(bǔ)充圖S1C枷畏；實(shí)驗(yàn)方法部分）。
5. 首先虱饿，我們基于每個(gè)染色體區(qū)域100個(gè)基因的平均表達(dá)推斷出染色體異常（CNAs）拥诡。
6. 該分析識(shí)別出了大多數(shù)細(xì)胞中的大規(guī)模擴(kuò)增和缺失，包括膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的標(biāo)志性變化：7號(hào)染色體獲得和10號(hào)染色體丟失氮发，這些變化在大多數(shù)成人但不是兒童腫瘤中被發(fā)現(xiàn)渴肉。
7. 其次，特定細(xì)胞類(lèi)型的標(biāo)記基因集高表達(dá)使我們能夠?qū)⒁恍┘?xì)胞分類(lèi)為巨噬細(xì)胞爽冕、T細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞（圖1B）仇祭。
8. 第三，聚類(lèi)分析（圖1B扇售；實(shí)驗(yàn)方法部分）突出顯示了三個(gè)小規(guī)模的非惡性細(xì)胞群前塔，它們?nèi)狈θ旧w異常且高度表達(dá)了特定細(xì)胞類(lèi)型的標(biāo)記。
9. 剩余的細(xì)胞形成了一個(gè)大的第四群（6,864個(gè)細(xì)胞）承冰，被認(rèn)為是惡性細(xì)胞，并與染色體異常相關(guān)聯(lián)食零。
10. 這三種方法一致地將膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞分類(lèi)為惡性細(xì)胞和非惡性細(xì)胞亞群困乒。

11. 惡性細(xì)胞在不同腫瘤之間存在顯著差異（圖1C和補(bǔ)充圖S1D），這與先前的研究一致贰谣，這些研究表明惡性細(xì)胞之間的差異大于非惡性細(xì)胞之間的差異娜搂。

    
    

• 圖1. 來(lái)自28個(gè)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的單細(xì)胞分類(lèi) (A) 基于分析基因的平均相對(duì)表達(dá)量推斷染色體CNAs迁霎。行對(duì)應(yīng)細(xì)胞；非惡性(NM)細(xì)胞（缺乏CNAs）位于頂部百宇，隨后是惡性細(xì)胞（具有CNAs考廉，如補(bǔ)充圖1所定義），按腫瘤排序并在同一腫瘤內(nèi)根據(jù)整體CNA模式聚類(lèi)携御。 (B) 所有單細(xì)胞的t-分布隨機(jī)鄰居嵌入(tSNE)圖昌粤。細(xì)胞根據(jù)是否存在CNAs（藍(lán)色）或高表達(dá)巨噬細(xì)胞（青色）、少突膠質(zhì)細(xì)胞（洋紅色）或T細(xì)胞（綠色）的標(biāo)記基因集著色啄刹。 (C) 所有惡性細(xì)胞的tSNE圖涮坐，按腫瘤著色。

• 圖S1. 與圖1相關(guān) （A） 我們隊(duì)列中代表性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤子集的蘇木精-伊紅染色誓军。圖像顯示了高級(jí)別膠質(zhì)瘤的特點(diǎn)袱讹，包括顯著的多形性和細(xì)胞核異型性。箭頭突出顯示血管增生昵时，星號(hào)標(biāo)記壞死區(qū)域捷雕，這些都是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的特征性標(biāo)志。
• （B） 在每個(gè)測(cè)序細(xì)胞中檢測(cè)到基因的數(shù)量分布壹甥。
• （C） 根據(jù)拷貝數(shù)異常信號(hào)（x軸）和拷貝數(shù)異常相關(guān)性（y軸）將細(xì)胞（點(diǎn)）分類(lèi)為惡性或非惡性救巷，分類(lèi)依據(jù)如紅色虛線所示的閾值№锿ⅲ拷貝數(shù)異常信號(hào)反映了拷貝數(shù)變異的程度征绸，而拷貝數(shù)異常相關(guān)性則反映了單個(gè)細(xì)胞的拷貝數(shù)模式與其他來(lái)自同一腫瘤的惡性細(xì)胞之間的相似性（見(jiàn)方法詳情）。映射到非惡性細(xì)胞類(lèi)型的細(xì)胞以黑色顯示俄占，其余的以藍(lán)色顯示管怠。
• （D） 上方：根據(jù)表達(dá)譜對(duì)所有惡性細(xì)胞進(jìn)行層次聚類(lèi)。下方：將細(xì)胞分配給腫瘤缸榄。成人腫瘤和兒童腫瘤分別用藍(lán)色和紅色突出顯示渤弛。

Malignant Cells Intra-tumoral Heterogeneity Is Dominated by a Few Expression Meta-modules

惡性細(xì)胞腫瘤內(nèi)異質(zhì)性主要由少數(shù)表達(dá)元模塊主導(dǎo)

• 待補(bǔ)充

  
  

• 圖2. 腫瘤內(nèi)惡性細(xì)胞間的表達(dá)特征異質(zhì)性 (A) 上方：來(lái)自MGH105樣本的惡性細(xì)胞之間的細(xì)胞到細(xì)胞相關(guān)矩陣，細(xì)胞按層次聚類(lèi)排序甚带。下方顯示了將細(xì)胞分配給潛在重疊簇的情況她肯。 (B) 定義自27個(gè)腫瘤中的269個(gè)潛在簇的特征的層次聚類(lèi)。頂部高亮顯示了潛在簇的分組鹰贵，并用于定義元模塊晴氨。 (C) 由同一組內(nèi)的潛在簇中始終上調(diào)的基因組成的元模塊。列出了選定的基因（見(jiàn)補(bǔ)充表S2獲取完整列表）碉输。 (D) 通過(guò)單細(xì)胞RNA測(cè)序測(cè)量的神經(jīng)發(fā)育相關(guān)細(xì)胞類(lèi)型中元模塊的相對(duì)表達(dá)(Darmanis等人籽前，2017年，Darmanis等人，2015年枝哄，Tirosh等人肄梨，2016b年)。誤差線對(duì)應(yīng)于標(biāo)準(zhǔn)誤差挠锥。

• 圖S2. 與圖2相關(guān) （A）頂部：按層次聚類(lèi)排序的MGH136惡性細(xì)胞間的相關(guān)性矩陣众羡。底部：將細(xì)胞分配到潛在的簇中。
• （B）頂部：通過(guò)對(duì)27個(gè)腫瘤分析定義的479個(gè)潛在簇進(jìn)行層次聚類(lèi)蓖租。底部：G1/S和G2/M細(xì)胞周期特征的表達(dá)得分粱侣。
• （C）所有非周期性特征的tSNE圖，根據(jù)它們的細(xì)胞得分聚類(lèi)菜秦，并按元模塊分配著色甜害。圓圈和三角形分別表示源自成人和兒童腫瘤的特征。
• （D）從10x獲得的表達(dá)特征與Smart-Seq2分析得出的元模塊一致球昨。從10x數(shù)據(jù)集中得到的非周期性特征根據(jù)它們的兩兩相關(guān)性層次聚類(lèi)（頂部顯示）尔店，并通過(guò)Jaccard指數(shù)評(píng)估它們與六個(gè)元模塊的相似性（底部顯示），反映了重疊基因的比例主慰。這一分析表明嚣州，大多數(shù)10x特征是明顯簇的一部分，這些簇與Smart-Seq2分析定義的元模塊一致共螺。例外是一組由紅色方框突出顯示的特征该肴。這些額外的特征以與其他特征及所有其他特征（除了來(lái)自重疊細(xì)胞簇的特征）之間的弱相關(guān)性為特征，因此并不構(gòu)成一個(gè)重復(fù)出現(xiàn)的模塊藐不。此外匀哄，它們主要與核糖體蛋白基因或血紅蛋白的高表達(dá)有關(guān)，而與連貫的功能注釋無(wú)關(guān)雏蛮。因此涎嚼，我們認(rèn)為這些特征主要反映了技術(shù)上的混淆因素。
• （E）在MSigDB中的C2和C5基因集上對(duì)元模塊進(jìn)行的功能富集分析（Subramanian等人挑秉，2005年）法梯。每個(gè)元模塊的前十個(gè)基因集在熱圖中顯示（見(jiàn)補(bǔ)充表S3）并按層次聚類(lèi)排序。
• （F）通過(guò)兩種互補(bǔ)度量顯示元模塊與通過(guò)單細(xì)胞RNA測(cè)序（Nowakowski等人犀概，2017年）剖析的神經(jīng)發(fā)育細(xì)胞類(lèi)型的相似性：顏色表示細(xì)胞類(lèi)型和元模塊之間基于全球表達(dá)值的相關(guān)性立哑；圓圈大小表示元模塊基因在給定細(xì)胞類(lèi)型中最高度表達(dá)的基因中富集的顯著水平（-log10(P值)）。以粗體顯示的細(xì)胞類(lèi)型被唯一地分配給一個(gè)元模塊姻灶，該元模塊的富集水平至少比其他細(xì)胞類(lèi)型高出兩倍铛绰，并且相關(guān)值位于前三名。
• （G）將特征分配給腫瘤（成人用黑色表示产喉；兒童用紅色表示）至耻。特征按照?qǐng)D2B所示的層次聚類(lèi)模式排列成四個(gè)元模塊若皱，元模塊間用虛線分隔镊叁。
• （H和I）當(dāng)分析限制在兒童腫瘤的特征時(shí)識(shí)別出的元模塊尘颓。（H）中間：通過(guò)對(duì)7個(gè)兒童腫瘤分析定義的109個(gè)特征進(jìn)行層次聚類(lèi)。黑色方框標(biāo)記了五個(gè)可能的僅限兒童的特征群組晦譬，這些群組源自多個(gè)腫瘤疤苹。頂部：將特征分配給腫瘤。底部：特征與六個(gè)元模塊的相似性敛腌。
• （I）六個(gè)主分析中的元模塊（y軸卧土；如圖2B所示）與五個(gè)僅限兒童的元模塊（x軸）的Jaccard相似性，這些元模塊源自（H）中定義的特征群組像樊，并按從左至右的位置編號(hào)尤莺。

Para_01

1. 頂級(jí)得分基因和元模塊的功能富集（圖2C和S2E；表S2和S3）突出了兩個(gè)與間充質(zhì)相關(guān)基因（例如生棍，VIM）及基因集合（超幾何檢驗(yàn)p值小于10的負(fù)九次方）高表達(dá)相關(guān)的元模塊颤霎。
2. 其中一個(gè)元模塊與缺氧反應(yīng)基因（例如，HILPDA）涂滴、應(yīng)激基因（例如友酱，DDIT3）以及糖酵解基因（例如，ENO2和LDHA）強(qiáng)烈關(guān)聯(lián)柔纵，表明在某些腫瘤中缔杉，間充質(zhì)狀態(tài)與缺氧及增強(qiáng)的糖酵解有關(guān)。
3. 我們將這些定義為間充質(zhì)樣（MES樣）元模塊：缺氧非依賴(lài)性（MES1）和缺氧依賴(lài)性（MES2）特征搁料。

Para_02

1. 其他四個(gè)元模塊與神經(jīng)發(fā)育基因相關(guān)或详，這些基因是神經(jīng)元/膠質(zhì)細(xì)胞譜系或祖細(xì)胞的特征局荚。
2. 其中包括元模塊#3中的星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物（S100B诱建、GFAP透硝、SLC1A3疾党、GLAST和MLC1）榴鼎，元模塊#4中的少突膠質(zhì)細(xì)胞譜系標(biāo)記物（OLIG1零聚、OMG咳短、PLP1踩晶、PLLP勋乾、TNR和ALCAM）宋下，以及元模塊#5和#6中的干細(xì)胞和祖細(xì)胞特征，包括神經(jīng)前體細(xì)胞（NPC）標(biāo)記物（SOX4辑莫、SOX11和DCX）学歧。
3. 一致的是，將這些元模塊與來(lái)自胎兒大腦各吨、成人腦以及膠質(zhì)瘤非惡性細(xì)胞的單細(xì)胞RNA測(cè)序的神經(jīng)細(xì)胞類(lèi)型特征進(jìn)行比較枝笨，元模塊#3、#4和#6分別在星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞（OPCs）和神經(jīng)前體細(xì)胞（NPCs）中表達(dá)最高横浑。（圖2D和補(bǔ)充圖S2F）

Para_03

1. 因此剔桨，元模塊模仿了發(fā)育中的細(xì)胞類(lèi)型，但與正常程序相比存在重要扭曲（附表 S4）徙融，并相應(yīng)地被命名為類(lèi)似星形膠質(zhì)細(xì)胞（AC-like）洒缀、類(lèi)似少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞（OPC-like）和類(lèi)似神經(jīng)祖細(xì)胞（NPC-like）。
2. NPC-like 進(jìn)一步細(xì)分為兩個(gè)亞程序（NPC1 和 NPC2）（星級(jí)方法欺冀；附表 S2）树绩，它們通過(guò)包含與 OPC 相關(guān)的基因來(lái)區(qū)分 NPC1（例如，OLIG1 和 TNR）與 NPC2 中的神經(jīng)元譜系基因（例如隐轩，STMN1饺饭、STMN2、STMN4职车、DLX5-AS1 和 DLX6-AS1）（圖 S2E瘫俊；附表 S2），這可能反映了 NPCs 向 OPC 或神經(jīng)元分化的潛能提鸟。
3. 每個(gè)元模塊除了對(duì)應(yīng)細(xì)胞類(lèi)型的特點(diǎn)外军援，還有其他特征，這可能反映了它們與正常細(xì)胞類(lèi)型程序之間的扭曲称勋。
4. 因此胸哥，盡管類(lèi)似星形膠質(zhì)細(xì)胞的元模塊主要由星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)，但它也在放射狀膠質(zhì)細(xì)胞（RG）中表達(dá)赡鲜，并且含有如 HOPX 這樣的 RG 標(biāo)志物（Pollen 等人空厌，2015 年）。
5. 總體而言银酬，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤內(nèi)的異質(zhì)性主要對(duì)應(yīng)于類(lèi)似于神經(jīng)祖細(xì)胞嘲更、少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞狀態(tài)揩瞪。
6. 這些狀態(tài)在成人和兒童腫瘤之間大體一致赋朦，在獨(dú)立分析的兒童樣本中也觀察到了這些狀態(tài)（圖 S2G-I）。

Cycling Cells and Hybrid Cellular States in Glioblastoma

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的循環(huán)細(xì)胞和混合細(xì)胞狀態(tài)

Para_01

1. 接下來(lái)李破，我們通過(guò)元模塊和細(xì)胞周期程序的表達(dá)對(duì)所有腫瘤中的細(xì)胞進(jìn)行了分類(lèi)（圖3A宠哄、3B和S3A）。
2. 根據(jù)細(xì)胞周期特征的表達(dá)嗤攻，每個(gè)腫瘤中有3%至51%的細(xì)胞被識(shí)別為處于細(xì)胞周期中（圖S3B）毛嫉。
3. 處于細(xì)胞周期中的細(xì)胞在OPC樣和NPC樣的狀態(tài)中富集（圖3C），特別是在兒科腫瘤中（圖S3C）妇菱。
4. 這與正常的OPC和神經(jīng)前體細(xì)胞的增殖一致承粤，并且與我們?cè)贗DH突變和H3K27M突變膠質(zhì)瘤中的先前觀察相符合暴区，這些膠質(zhì)瘤分別由增殖的NPC樣和OPC樣細(xì)胞驅(qū)動(dòng)。
5. 然而辛臊，在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中仙粱，與其他類(lèi)型的膠質(zhì)瘤不同，其他細(xì)胞狀態(tài)——AC樣和MES樣——也含有相當(dāng)數(shù)量的增殖細(xì)胞浪讳，可能反映了其非常侵襲性的特性（圖3C）缰盏。
6. Filbin等人、Tirosh等人以及Venteicher等人的研究支持了這一發(fā)現(xiàn)（2018年淹遵、2016年、2017年）负溪。

7. 但是透揣，在提及文獻(xiàn)的具體年份和作者信息時(shí)，不應(yīng)包含具體的參考文獻(xiàn)數(shù)字川抡。

   
   

• 圖3. 惡性細(xì)胞被分配至細(xì)胞狀態(tài)及其混合狀態(tài) (A) 熱圖顯示了所有非增殖期細(xì)胞（左側(cè)）和增殖期細(xì)胞（右側(cè)）的元模塊得分辐真。在每組中，細(xì)胞按其最大得分排序崖堤，首先是映射到一個(gè)元模塊的細(xì)胞侍咱，其次是映射到兩個(gè)元模塊的細(xì)胞（混合狀態(tài)，標(biāo)記為"H"）密幔。
• (B) 條形圖顯示了每個(gè)元模塊得分最高的細(xì)胞百分比楔脯。成人和兒童腫瘤被分開(kāi)展示，以證明它們各自不同的分布胯甩。誤差線對(duì)應(yīng)于通過(guò)自助法計(jì)算的標(biāo)準(zhǔn)誤差昧廷。
• (C) 條形圖顯示了在每個(gè)元模塊得分最高的細(xì)胞中，增殖期細(xì)胞的百分比偎箫。誤差線對(duì)應(yīng)于通過(guò)自助法計(jì)算的標(biāo)準(zhǔn)誤差木柬。
• (D) 條形圖顯示了共表達(dá)兩種不同元模塊的混合細(xì)胞（所有惡性細(xì)胞中的）的實(shí)際和預(yù)期百分比。預(yù)期百分比及其標(biāo)準(zhǔn)誤差是通過(guò)打亂細(xì)胞得分來(lái)計(jì)算的（星號(hào)方法部分）淹办。
• (E) 膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的原位RNA雜交顯示NPC樣（CD24）眉枕、MES樣（CD44）和增殖（Ki67）標(biāo)志物。箭頭突出顯示代表性的CD24（藍(lán)色）或CD44（紅色）陽(yáng)性細(xì)胞怜森。箭頭尖端突出顯示了一個(gè)共表達(dá)CD24和Ki67的細(xì)胞速挑。
• (F) 細(xì)胞狀態(tài)的二維表示。每個(gè)象限對(duì)應(yīng)一種細(xì)胞狀態(tài)塔插，惡性細(xì)胞（點(diǎn)）的確切位置反映了它們對(duì)元模塊的相對(duì)得分梗摇，而顏色則反映了增殖期細(xì)胞的密度（星號(hào)方法部分）。

• 圖S3. 與圖3相關(guān) (A) 顯示元模塊表達(dá)的熱圖想许，其中行對(duì)應(yīng)于所有元模塊中的基因伶授，列則對(duì)應(yīng)于所有惡性細(xì)胞断序，分為非增殖期（左側(cè)）和增殖期細(xì)胞（右側(cè)）。在每組中糜烹，細(xì)胞按其最大得分排序违诗，首先是映射到一個(gè)元模塊的細(xì)胞，隨后是映射到兩個(gè)元模塊的細(xì)胞（H疮蹦，混合狀態(tài)）诸迟。(B) 增殖期細(xì)胞的識(shí)別。顯示了所有惡性細(xì)胞的G1/S和G2/M標(biāo)記的細(xì)胞得分愕乎。定義為增殖期的細(xì)胞用綠色（G1/S）阵苇、紫色（G2/M）或紅色（兩者都有）標(biāo)出。(C) 條形圖顯示了在每個(gè)元模塊得分最高的細(xì)胞中感论，增殖期細(xì)胞的百分比绅项。成人和兒童腫瘤被分開(kāi)以展示它們不同的分布。誤差線對(duì)應(yīng)于通過(guò)自助法計(jì)算的標(biāo)準(zhǔn)誤差比肄。(D) 條形圖顯示了在成人（左側(cè)）和兒童（右側(cè)）膠質(zhì)母細(xì)胞瘤樣本中快耿，共表達(dá)兩種不同元模塊的混合細(xì)胞占所有惡性細(xì)胞的比例。假設(shè)元模塊的得分彼此獨(dú)立時(shí)預(yù)期的混合細(xì)胞百分比定義為分別打亂每個(gè)元模塊的細(xì)胞得分后得到的百分比芳绩；誤差線對(duì)應(yīng)于通過(guò)100次打亂細(xì)胞得分計(jì)算得到的標(biāo)準(zhǔn)誤差掀亥。(E) 膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的原位RNA雜交分析，用于神經(jīng)前體細(xì)胞樣（CD24）妥色、少突膠質(zhì)細(xì)胞前體樣（PDGFRA）搪花、星形膠質(zhì)細(xì)胞樣（S100B）以及增殖（Ki67）標(biāo)志物。每個(gè)面板中的箭頭突出顯示了相應(yīng)標(biāo)志物的代表性陽(yáng)性細(xì)胞垛膝。箭頭尖端突出顯示PDGFRA和Ki67的共表達(dá)鳍侣。(F) 在十個(gè)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤樣本中，通過(guò)RNA原位雜交量化共表達(dá)標(biāo)志物（混合狀態(tài)吼拥，增殖期細(xì)胞）的細(xì)胞百分比倚聚。誤差線對(duì)應(yīng)于腫瘤間的標(biāo)準(zhǔn)偏差。

Para_01

1. 有趣的是凿可，盡管大多數(shù)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞主要對(duì)應(yīng)于四種狀態(tài)之一惑折，但15%的細(xì)胞高度表達(dá)了兩個(gè)不同的元模塊，因此被定義為"混合"狀態(tài)（圖3A和3D）枯跑。
2. 一些元模塊的組合很少出現(xiàn)惨驶，而其他一些組合（AC樣/MES樣、NPC樣/OPC樣和AC樣/OPC樣）則與一個(gè)簡(jiǎn)單的模型預(yù)期的一樣常見(jiàn)敛助，該模型認(rèn)為不同元模塊之間的表達(dá)是獨(dú)立的（圖3D粗卜；STAR方法部分）。
3. 因此纳击，我們的數(shù)據(jù)支持一種模型续扔，即膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞跨越四種主要細(xì)胞狀態(tài)及其介態(tài)的混合體攻臀，每種狀態(tài)都有增殖潛力，但NPC樣和OPC樣的狀態(tài)增殖能力更高纱昧。
4. 元模塊刨啸、混合狀態(tài)以及增殖模式通過(guò)十個(gè)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤樣本中的RNA原位雜交（RNA-ISH）得到了證實(shí)（圖3E、S3E和S3F）识脆。
5. 最后设联，我們開(kāi)發(fā)了一種"細(xì)胞狀態(tài)圖"，以總結(jié)這些狀態(tài)及其介態(tài)中細(xì)胞的分布（圖3F灼捂；STAR方法部分）离例，這展示了增殖細(xì)胞的多樣性，并將在下面用于進(jìn)一步分析纵东。

Limited Relationship between Genetic Subclones and Intra-tumoral State Diversity

遺傳亞克隆與腫瘤內(nèi)狀態(tài)多樣性之間的關(guān)系有限

Para_01

1. 接下來(lái)粘招，我們探討了腫瘤內(nèi)細(xì)胞狀態(tài)多樣性是否能直接反映腫瘤內(nèi)的遺傳亞克隆。
2. 從單細(xì)胞RNA測(cè)序數(shù)據(jù)中檢測(cè)單個(gè)細(xì)胞內(nèi)的基因突變受到轉(zhuǎn)錄組部分覆蓋范圍的限制偎球。
3. 然而，大規(guī)模的染色體異常辑甜，如全染色體或染色體臂事件衰絮，可能基于每個(gè)染色體區(qū)域內(nèi)大量基因的整體上調(diào)或下調(diào)而被穩(wěn)健地檢測(cè)到，這一點(diǎn)已經(jīng)得到先前研究的證實(shí)磷醋。

4. 推斷出的染色體異常（見(jiàn)明星方法）使得能夠在12個(gè)腫瘤中的37個(gè)遺傳亞克隆中穩(wěn)健地檢測(cè)到猫牡，每個(gè)腫瘤中有2-5個(gè)不同的亞克隆（圖4A邓线、4B和S4A）淌友。

   
   

• 圖4. 在遺傳和表達(dá)水平上的腫瘤內(nèi)異質(zhì)性 (A和B) 通過(guò)染色體拷貝數(shù)異常識(shí)別遺傳亞克隆。展示的是根據(jù)特定染色體的擴(kuò)增或缺失劃分出的MGH125 (A) 和MGH102 (B) 的惡性細(xì)胞推斷出的染色體拷貝數(shù)異常 (STAR 方法)骇陈。
• （C）具有基于染色體拷貝數(shù)亞克隆的六個(gè)腫瘤的細(xì)胞狀態(tài)圖（如圖3F所示）震庭。細(xì)胞按其亞克隆著色。

Para_01

1. 值得注意的是你雌，每個(gè)37個(gè)亞克隆都包含處于細(xì)胞狀態(tài)圖四個(gè)象限中的多種細(xì)胞狀態(tài)的細(xì)胞（圖4C和補(bǔ)充圖S4B）器联。
2. 因此，細(xì)胞狀態(tài)并非嚴(yán)格由任何遺傳亞克隆決定婿崭，盡管某些亞克隆偏向于特定的狀態(tài)拨拓。
3. 為了量化這種偏向性，我們比較了來(lái)自相同亞克隆和不同亞克隆的細(xì)胞對(duì)之間的細(xì)胞狀態(tài)氓栈。
4. 平均而言渣磷，來(lái)自同一腫瘤的所有細(xì)胞對(duì)中有49%具有相同的狀態(tài)。

5. 來(lái)自相同亞克隆和不同亞克隆的細(xì)胞對(duì)之間具有相同狀態(tài)的比例總體相當(dāng)（51%與46%）授瘦，因?yàn)橹挥?個(gè)亞克隆具有較高比例的相同狀態(tài)細(xì)胞對(duì)（補(bǔ)充圖S4C）（平均63%）醋界。

   
   

• 圖S4. 與圖4相關(guān) (A) 通過(guò)染色體拷貝數(shù)異常識(shí)別遺傳亞克隆竟宋。顯示的是從頂部到底部依次為BT771、BT749物独、MGH152袜硫、MGH151、MGH136挡篓、MGH105和MGH100惡性細(xì)胞推斷出的染色體拷貝數(shù)異常婉陷，根據(jù)特定染色體的擴(kuò)增/缺失將它們劃分到不同的遺傳亞克隆中。
• (B) 具有基于染色體拷貝數(shù)異常的亞克隆的六個(gè)腫瘤的細(xì)胞狀態(tài)圖（如圖3F所示）官研。細(xì)胞按其亞克隆歸屬著色（參見(jiàn)C中的顏色圖例）秽澳。
• (C) 在所有來(lái)自每個(gè)腫瘤的細(xì)胞對(duì)（白色）以及來(lái)自各個(gè)亞克隆的細(xì)胞對(duì)（如顏色圖例定義）中，映射到同一狀態(tài)（由B中的四個(gè)象限代表的狀態(tài)之一）的細(xì)胞對(duì)比例戏羽。37個(gè)亞克隆中有8個(gè)亞克隆具有顯著高比例的同狀態(tài)細(xì)胞對(duì)（通過(guò)置換檢驗(yàn)定義為p < 0.05）担神，這些亞克隆用星號(hào)標(biāo)記。
• (D) 分析不同亞克隆間的差異表達(dá)基因始花，將每個(gè)單獨(dú)亞克隆與其他在同一腫瘤內(nèi)的亞克隆進(jìn)行比較妄讯。熱圖顯示了與各元模塊相關(guān)聯(lián)（Pearson R > 0.3）或位于區(qū)分亞克隆的染色體拷貝數(shù)異常區(qū)域內(nèi)的差異表達(dá)基因的比例。右側(cè)的黑條表示差異表達(dá)基因的數(shù)量酷宵。

Para_01

1. 我們還評(píng)估了同一腫瘤內(nèi)不同亞克隆之間差異表達(dá)（DE）基因的數(shù)量（圖S4D）亥贸。
2. 亞克隆的差異表達(dá)基因中位數(shù)為20個(gè)，其中大多數(shù)與元模塊無(wú)關(guān)或不相關(guān)浇垦，而常常位于區(qū)分這些亞克隆的CNA位點(diǎn)內(nèi)炕置。
3. 雖然我們只能檢測(cè)到一些遺傳事件，但基于CNA定義的亞克隆與對(duì)應(yīng)于元模塊的表達(dá)狀態(tài)之間的有限關(guān)聯(lián)表明男韧，腫瘤內(nèi)的大部分表達(dá)狀態(tài)多樣性并非由遺傳亞克隆驅(qū)動(dòng)朴摊。
4. 這與我們?cè)贗DH突變和H3K27M突變膠質(zhì)瘤中的先前觀察一致。

Defined Genetic Drivers Influence the Distribution of Cellular States

定義的遺傳驅(qū)動(dòng)因素影響細(xì)胞狀態(tài)的分布

Para_01

1. 每個(gè)腫瘤至少包含四種細(xì)胞狀態(tài)中的兩種此虑，大多數(shù)腫瘤包含所有四種狀態(tài)（補(bǔ)充圖5A）甚纲，但不同腫瘤中這些狀態(tài)的比例各不相同（圖5A），甚至在同一腫瘤的不同區(qū)域之間也存在一定程度的變化（補(bǔ)充圖5B）寡壮。
2. 大多數(shù)腫瘤主要由神經(jīng)上皮樣細(xì)胞和少突膠質(zhì)前體細(xì)胞樣細(xì)胞組成贩疙，或由腺樣細(xì)胞和間充質(zhì)樣細(xì)胞組成，盡管有些腫瘤具有其他模式（圖5A）况既。
3. 此外这溅，對(duì)于這四種狀態(tài)中的每一種，都有些腫瘤是以該狀態(tài)為主的狀態(tài)棒仍。

4. 值得注意的是悲靴，成人和兒童膠質(zhì)母細(xì)胞瘤似乎具有相似的模式，盡管與成人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤相比莫其，兒童膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中腺樣細(xì)胞較少（圖5A和圖3B）癞尚。

   
   

• 圖S5. 與圖5相關(guān) （A） 對(duì)于每個(gè)腫瘤耸三，我們統(tǒng)計(jì)了檢測(cè)到的不同細(xì)胞狀態(tài)的數(shù)量（共四種）。顯示的是具有兩到四種狀態(tài)的腫瘤數(shù)量（沒(méi)有一個(gè)腫瘤的狀態(tài)少于兩種）浇揩。
• （B） 左側(cè)：MGH 105的MRI圖像仪壮，用彩色圓點(diǎn)表示采樣的區(qū)域。右側(cè)：MGH105四個(gè)空間區(qū)域的餅狀圖（如圖5A所示）胳徽。
• （C） 將TCGA亞型與細(xì)胞亞群聯(lián)系起來(lái)积锅。基于我們scRNA-seq數(shù)據(jù)中每種細(xì)胞亞群最高表達(dá)水平的標(biāo)記基因被分類(lèi)為六個(gè)細(xì)胞程序之一养盗。這六個(gè)程序?qū)?yīng)于四個(gè)惡性狀態(tài)（根據(jù)元模塊定義）和兩種非惡性細(xì)胞類(lèi)型：巨噬細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞（參見(jiàn)圖1）缚陷。顯示的是每種TCGA亞型中被分類(lèi)到這六個(gè)程序中的基因百分比。
• （D） 識(shí)別與特定細(xì)胞狀態(tài)富集相關(guān)的基因往核。對(duì)于四種惡性細(xì)胞狀態(tài)中的每一種箫爷，我們定義了高比例和低比例細(xì)胞的腫瘤，并檢查了它們之間的差異表達(dá)聂儒。這是針對(duì)每種細(xì)胞狀態(tài)中的細(xì)胞分別進(jìn)行的（每個(gè)面板中的行）虎锚，以便控制腫瘤組成的差異。顯示的是所有基因的差異表達(dá)（高與低腫瘤的log2比率）以及至少在兩種細(xì)胞狀態(tài)下顯著的基因（右側(cè)）衩婚，基因按平均差異表達(dá)排序翁都。
• （E） EGFR在AC-high腫瘤中的表達(dá)高于AC-low腫瘤，無(wú)論是在單細(xì)胞還是整體腫瘤中谅猾。對(duì)于四種細(xì)胞狀態(tài)中的每一種，顯示的是AC-low腫瘤（藍(lán)色點(diǎn)）和AC-high腫瘤（紅色點(diǎn)）中該狀態(tài)下所有細(xì)胞的EGFR平均相對(duì)表達(dá)量鳍悠。條形和誤差線顯示的是兩個(gè)腫瘤子集的平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差税娜。最右側(cè)的一對(duì)條形顯示的是根據(jù)TCGA整體AC-like評(píng)分劃分的AC-high和AC-low腫瘤中EGFR的整體表達(dá)（參見(jiàn)STAR方法）。
• （F） 在TCGA腫瘤中藏研，具有特定元模塊高整體評(píng)分的遺傳事件的富集情況敬矩。對(duì)于四種元模塊簽名中的每一種，我們定義了一組具有高整體評(píng)分的TCGA腫瘤蠢挡，并檢查了三種高水平擴(kuò)增（PDGFRA弧岳、CDK4和EGFR）及NF1下調(diào)的腫瘤比例。作為對(duì)照业踏，我們將這些比例與所有TCGA膠質(zhì)母細(xì)胞瘤進(jìn)行了比較禽炬。星號(hào)表示顯著性富集（p < 0.01，超幾何檢驗(yàn)）勤家。
• （G） 頂部面板：染色體丟失與TCGA整體MES-like狀態(tài)評(píng)分的相關(guān)性腹尖，如同圖5B中所示的染色體獲得情況。底部：聚焦于第5號(hào)染色體伐脖，包括丟失與MES1和MES2元模塊整體評(píng)分及巨噬細(xì)胞標(biāo)志物整體評(píng)分關(guān)聯(lián)的顯著性值（-log10(P值））热幔，表明頂部面板所示的效果主要局限于MES1元模塊乐设。

• 圖5. 在TCGA膠質(zhì)母細(xì)胞瘤隊(duì)列中，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的細(xì)胞狀態(tài)分布與染色體擴(kuò)增相關(guān) (A) 餅狀圖顯示了我們隊(duì)列中每個(gè)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤四種細(xì)胞狀態(tài)的細(xì)胞比例绎巨。每個(gè)餅狀圖上方是腫瘤索引近尚；兒童腫瘤用紅色表示，復(fù)發(fā)性腫瘤標(biāo)記為"R"场勤。根據(jù)TCGA主體亞型進(jìn)行分組戈锻，并標(biāo)出。
• （B）對(duì)TCGA膠質(zhì)母細(xì)胞瘤隊(duì)列的分析表明却嗡，EGFR舶沛、PDGFRA和CDK4的高度擴(kuò)增分別與AC樣、OPC樣和NPC樣細(xì)胞狀態(tài)的高主體評(píng)分相關(guān)窗价。圖中顯示的是關(guān)聯(lián)性的顯著性值如庭，-log10(P值)拴驮，與高主體評(píng)分（顯示在零線以上蕊退，表明細(xì)胞狀態(tài)富集）或低主體評(píng)分（顯示在零線以下，表明細(xì)胞狀態(tài)缺失）相關(guān)的染色體擴(kuò)增蛾派。單染色體獲得與高度擴(kuò)增區(qū)分開(kāi)來(lái)（Brennan等人帝牡，2013年）往毡，后者與三種細(xì)胞狀態(tài)（AC樣、OPC樣和NPC樣）有著顯著的相關(guān)性靶溜，而沒(méi)有發(fā)現(xiàn)染色體擴(kuò)增與MES樣狀態(tài)有關(guān)聯(lián)开瞭。

Para_01

1. 每個(gè)腫瘤中特定狀態(tài)（或兩種狀態(tài)的組合）的主導(dǎo)地位與TCGA先前定義的三種大體亞型高度一致（圖5A和補(bǔ)充圖S5C）。
2. 雖然TCGA-CL和TCGA-MES亞型分別對(duì)應(yīng)于富含AC樣狀態(tài)和MES樣狀態(tài)的腫瘤罩息，但TCGA-PN亞型則對(duì)應(yīng)于兩種不同的細(xì)胞狀態(tài)的組合嗤详，即OPC樣和NPC樣（圖5A和補(bǔ)充圖S5C），這反映了這兩種狀態(tài)在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的典型共存現(xiàn)象（圖5A）瓷炮，這妨礙了我們?cè)诖篌wRNA測(cè)序中區(qū)分它們各自貢獻(xiàn)的能力葱色。
3. 同樣，TCGA-MES亞型對(duì)應(yīng)于上述定義的MES樣惡性狀態(tài)與大量的小膠質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的組合（補(bǔ)充圖S5C）娘香，支持了它們?cè)诰S持惡性細(xì)胞的MES樣狀態(tài)中的潛在作用苍狰。
4. 之前提出的第四種亞型（TCGA-Neural）似乎主要反映了非惡性少突膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元的主導(dǎo)地位（補(bǔ)充圖S5C），這與最近的觀察結(jié)果一致（Wang等人烘绽，2017年）淋昭。

Para_02

1. 我們假設(shè)每個(gè)腫瘤包含多種細(xì)胞狀態(tài)，但特定狀態(tài)在腫瘤子集（即诀姚，腫瘤亞型）中富集响牛，這可以通過(guò)個(gè)體腫瘤的遺傳特性及/或微環(huán)境偏好某些特定細(xì)胞狀態(tài)而非其他狀態(tài)來(lái)解釋。
2. 例如，這可能是由于某些細(xì)胞轉(zhuǎn)變被促進(jìn)或抑制呀打。
3. 為了識(shí)別此類(lèi)效應(yīng)矢赁，我們首先利用單細(xì)胞譜系尋找與每種狀態(tài)高頻率相關(guān)的基因，但這些基因本身并不屬于該狀態(tài)的表達(dá)程序贬丛。
4. 例如撩银，我們?cè)诤懈哳l率AC樣細(xì)胞（AC高表達(dá)腫瘤）和低頻率AC樣細(xì)胞（AC低表達(dá)腫瘤）的28個(gè)腫瘤隊(duì)列中尋找差異表達(dá)基因。
5. 為了控制這些隊(duì)列中各狀態(tài)比例的差異豺憔，我們分別比較了四種狀態(tài)下的細(xì)胞（補(bǔ)充圖S5D）额获。
6. 因此，盡管AC高表達(dá)腫瘤主要由AC樣細(xì)胞組成恭应，它們也含有足夠數(shù)量的MES樣抄邀、NPC樣和OPC樣細(xì)胞，可以與AC低表達(dá)腫瘤中的相同狀態(tài)進(jìn)行比較昼榛。
7. 這種分析確定了22個(gè)基因境肾，在AC高表達(dá)腫瘤中始終高于AC低表達(dá)腫瘤（補(bǔ)充圖S5D），以及16到41個(gè)與另外三種狀態(tài)豐度相關(guān)的基因（補(bǔ)充圖S5E）

Para_03

1. 在AC-high腫瘤中上調(diào)最顯著的基因是EGFR胆屿，與AC-low腫瘤相比奥喻，在來(lái)自四種狀態(tài)的細(xì)胞中，AC-high腫瘤中的EGFR明顯更高（超過(guò)7倍）（圖S5E）非迹。
2. 這些結(jié)果表明环鲤，具有EGFR異常的腫瘤，因此在所有細(xì)胞狀態(tài)下EGFR水平都很高憎兽，可能會(huì)有利于AC樣細(xì)胞的高頻率出現(xiàn)冷离，這與先前關(guān)于EGFR作為調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細(xì)胞分化因子的報(bào)道一致。

Para_04

1. 為了系統(tǒng)地研究細(xì)胞狀態(tài)與遺傳學(xué)之間的關(guān)聯(lián)纯命，我們接下來(lái)轉(zhuǎn)向了TCGA膠質(zhì)母細(xì)胞瘤數(shù)據(jù)集中的401個(gè)批量樣本酒朵。
2. 批量表達(dá)譜反映了腫瘤成分多樣性的平均情況，因此扎附，每個(gè)元模塊的表達(dá)定義了在批量樣本中對(duì)應(yīng)細(xì)胞狀態(tài)豐度的粗略估計(jì)。
3. 我們對(duì)每個(gè)批量樣本進(jìn)行了四個(gè)元模塊的表達(dá)評(píng)分结耀，并考察了表達(dá)分?jǐn)?shù)與遺傳特征之間的關(guān)聯(lián)（圖5B）留夜。
4. 正如上述分析所預(yù)期的那樣，TCGA腫瘤中EGFR高度遺傳性擴(kuò)增與較高的AC樣批量評(píng)分顯著相關(guān)（p < 10^-5）图甜。
5. 類(lèi)似地碍粥，PDGFRA和CDK4的高度擴(kuò)增分別與OPC樣和NPC樣的評(píng)分相關(guān)，這與這些基因作為正常發(fā)育中OPC和NPC調(diào)控因子的已知作用一致（Lim和Kaldis, 2012, Zhu等人, 2014）黑毅。
6. 因此嚼摩，盡管OPC樣和NPC樣的豐度在很大程度上是相互關(guān)聯(lián)的，并且共同定義了TCGA-PN亞型，但它們之間足夠不同枕面，能夠檢測(cè)到與相關(guān)調(diào)控因子擴(kuò)增的差異性關(guān)聯(lián)愿卒。
7. 幾種點(diǎn)突變也與特定的細(xì)胞狀態(tài)相關(guān)，例如NF1改變與MES高表達(dá)的腫瘤（圖S5F）潮秘，但染色體數(shù)目異常具有更強(qiáng)的影響（圖5B）琼开；每個(gè)細(xì)胞狀態(tài)與特定的染色體數(shù)目異常顯著相關(guān)。
8. 我們還觀察到枕荞，在TCGA數(shù)據(jù)集中柜候，5q染色體臂的缺失與MES樣狀態(tài)呈負(fù)相關(guān)（圖S5G），表明該染色體臂上的基因缺失可能限制了MES樣細(xì)胞的數(shù)量躏精。
9. 這一染色體區(qū)域編碼潛在的間充質(zhì)表達(dá)程序調(diào)節(jié)因子（如SMAD5和TGFBI）渣刷，以及多種細(xì)胞因子和趨化因子（如CSF2、IL3矗烛、IL4辅柴、IL5、IL13和CXCL14）高诺，這些因子可能參與與小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞和其他免疫細(xì)胞的通訊（Wang等人, 2017）碌识。

EGFR Drives an AC-Like Program and CDK4 an NPC-Like Program in Mouse Neural Cells

EGFR驅(qū)動(dòng)小鼠神經(jīng)細(xì)胞中的AC樣程序，而CDK4驅(qū)動(dòng)NPC樣程序

Para_01

1. 我們假設(shè)這些遺傳改變中的一些可能通過(guò)增加細(xì)胞生長(zhǎng)和/或誘導(dǎo)狀態(tài)轉(zhuǎn)變來(lái)促進(jìn)特定的細(xì)胞狀態(tài)虱而。
2. 為了驗(yàn)證這一假設(shè)筏餐，我們?cè)趶呐咛ジ杉?xì)胞衍生的主要小鼠神經(jīng)祖細(xì)胞中過(guò)表達(dá)了CDK4、EGFR以及對(duì)照GFP牡拇，并進(jìn)行了表型特征分析和單細(xì)胞RNA測(cè)序魁瞪。
3. 支持我們的模型，過(guò)表達(dá)EGFR的NPCs誘導(dǎo)了類(lèi)似AC的程序惠呼，這通過(guò)GFAP染色和單細(xì)胞RNA測(cè)序分析得到證實(shí)导俘。
4. 相反，過(guò)表達(dá)CDK4的細(xì)胞誘導(dǎo)了類(lèi)似NPC的程序剔蹋。
5. 因此旅薄，這些癌基因促進(jìn)了非癌性祖細(xì)胞向它們?cè)谀[瘤環(huán)境中也相關(guān)的細(xì)胞狀態(tài)的轉(zhuǎn)變。
6. 由于EGFR和CDK4在推動(dòng)細(xì)胞增殖方面有著既定的作用泣崩，我們還測(cè)試了這些癌基因?qū)Ω髯约?xì)胞類(lèi)型增殖的影響少梁。
7. 我們觀察到，過(guò)表達(dá)CDK4的小鼠神經(jīng)祖細(xì)胞比過(guò)表達(dá)EGFR或GFP對(duì)照的細(xì)胞增殖更多矫付。
8. 而過(guò)表達(dá)EGFR的小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞比過(guò)表達(dá)CDK4或GFP對(duì)照的細(xì)胞增殖更多凯沪。
9. 這表明不同的神經(jīng)細(xì)胞類(lèi)型對(duì)這些膠質(zhì)母細(xì)胞瘤癌基因的反應(yīng)不同，這反映了我們?cè)赥CGA數(shù)據(jù)集中觀察到的遺傳學(xué)與細(xì)胞狀態(tài)之間的關(guān)聯(lián)买优。

10. 綜上所述妨马，我們的結(jié)果支持一種模型挺举，在該模型中，如EGFR和CDK4這樣的癌基因在調(diào)控特定神經(jīng)發(fā)育細(xì)胞類(lèi)型的轉(zhuǎn)變和生長(zhǎng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用烘跺，因此當(dāng)它們出現(xiàn)在腫瘤中時(shí)湘纵，它們不僅驅(qū)動(dòng)腫瘤進(jìn)展，還可能塑造腫瘤內(nèi)部的細(xì)胞狀態(tài)分布液荸。

    
    

• 圖6. 膠質(zhì)母細(xì)胞瘤致癌基因驅(qū)動(dòng)定義明確的細(xì)胞狀態(tài) (A) 過(guò)表達(dá)EGFR瞻佛、CDK4或eGFP的小鼠NPCs免疫熒光顯微照片，用星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記GFAP（紅色）進(jìn)行免疫染色娇钱。
• (B) (A)部分所示GFAP+細(xì)胞的數(shù)量統(tǒng)計(jì)（星號(hào)方法）伤柄。
• (C) 過(guò)表達(dá)EGFR（紅色）或GFP（黑色）的細(xì)胞（按排名，x軸）在AC樣特征(scRNA-seq評(píng)分文搂，y軸)的評(píng)分适刀。（星號(hào)方法）。
• (D) 過(guò)表達(dá)CDK4（藍(lán)色）或GFP（黑色）的細(xì)胞（按排名煤蹭，x軸）在NPC樣特征(scRNA-seq評(píng)分笔喉，y軸)的評(píng)分。
• (E) 使用過(guò)表達(dá)eGFP硝皂、EGFR或CDK4的NPCs得到的生長(zhǎng)曲線顯示常挚，在表達(dá)CDK4的細(xì)胞中增殖增加（p < 0.0001）』铮縮寫(xiě)如下：RLU奄毡，相對(duì)光單位（任意值）。
• (F) 來(lái)自經(jīng)過(guò)工程改造的NPCs衍生的星形膠質(zhì)細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線顯示贝或，過(guò)表達(dá)EGFR的星形膠質(zhì)細(xì)胞顯著增長(zhǎng)（p < 0.002吼过，方差分析）。

• 圖S6. 與圖6和圖7相關(guān) （A） 主要的人類(lèi)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤分析中的六個(gè)元模塊（x軸）與使用相同方法從小鼠NPC單細(xì)胞RNA測(cè)序數(shù)據(jù)分析得出的四個(gè)元模塊（y軸）之間的杰卡德相似度咪奖。比較基于人-小鼠同源基因盗忱，且根據(jù)最相似的人類(lèi)元模塊命名了小鼠元模塊。
• （B） 上方：按層次聚類(lèi)排序的小鼠NPCs過(guò)表達(dá)GFP羊赵、EGFR或CDK4的細(xì)胞間相關(guān)矩陣趟佃。下方：定義于（A）中的小鼠元模塊的表達(dá)得分。
• （C） 主要的人類(lèi)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤分析中的六個(gè)元模塊（x軸）與使用相同方法從遺傳性小鼠模型單細(xì)胞RNA測(cè)序數(shù)據(jù)分析得出的四個(gè)元模塊（y軸）之間的杰卡德相似度昧捷。比較基于人-小鼠同源基因揖闸，且根據(jù)最相似的人類(lèi)元模塊命名了小鼠元模塊。
• （D） 上方：三個(gè)條形碼標(biāo)記的小鼠膠質(zhì)母細(xì)胞瘤模型中惡性細(xì)胞的細(xì)胞間相關(guān)矩陣料身，這些模型在轉(zhuǎn)化后第11天（左兩幅圖）或第5周（右圖）（星號(hào)方法），按層次聚類(lèi)排序衩茸。中間：定義于（C）中的小鼠元模塊的表達(dá)得分芹血。下方：將細(xì)胞（按頂部和中間面板的順序排列）分配給條形碼；條形碼按映射到它們的細(xì)胞數(shù)量排序（最高的位于頂部），所有孤兒條形碼（每個(gè)只在一個(gè)細(xì)胞中出現(xiàn)）組合在最低的面板中以便緊湊顯示幔烛。
• （E） 對(duì)于移植入免疫缺陷小鼠的患者來(lái)源的條形碼標(biāo)記細(xì)胞啃擦，與（B和D）相同。

Demonstration of Cellular Plasticity by Combined scRNA-Seq and Cellular Barcoding

通過(guò)單細(xì)胞RNA測(cè)序和細(xì)胞條形碼技術(shù)結(jié)合展示細(xì)胞塑性的示范

Para_01

1. 雖然已定義的遺傳事件似乎驅(qū)動(dòng)了最常見(jiàn)的細(xì)胞狀態(tài)的身份饿悬，我們推測(cè)遺傳因素可能只是不完全地偏向特定的細(xì)胞狀態(tài)令蛉，使得通過(guò)細(xì)胞塑性維持了多種狀態(tài)的存在。
2. 為了實(shí)驗(yàn)性地測(cè)試細(xì)胞在不同狀態(tài)間轉(zhuǎn)換的能力狡恬，我們?cè)噲D分離出處于特定狀態(tài)的細(xì)胞珠叔，用它們?cè)诨颊邅?lái)源的異種移植（PDX）模型中啟動(dòng)腫瘤，并確定所產(chǎn)生的腫瘤中的狀態(tài)分布弟劲。

Para_02

1. 首先祷安，為了分離特定狀態(tài)的細(xì)胞，我們從元模塊基因中尋找細(xì)胞表面標(biāo)志物兔乞，并分別在NPC樣和MES樣狀態(tài)的前四名基因中識(shí)別出CD24和CD44汇鞭。
2. 接著，我們從一個(gè)新鮮腫瘤樣本(MGH143)中分離出CD24高表達(dá)細(xì)胞庸追、CD44高表達(dá)細(xì)胞以及未選擇的惡性細(xì)胞(CD45-)(圖7A)霍骄。
3. 我們選擇了具有EGFRvIII遺傳變異的腫瘤(圖S7A)，這是一種EGFR的持續(xù)激活突變體淡溯，因此該腫瘤中有較高比例的AC樣細(xì)胞和較少比例的NPC樣及MES樣細(xì)胞读整。
4. 然而，這些后兩種狀態(tài)在CD24高表達(dá)和CD44高表達(dá)的細(xì)胞群中被有效地富集血筑，這一點(diǎn)通過(guò)排序群體的單細(xì)胞RNA測(cè)序得到了證實(shí)(圖7A绘沉、7B和S7B)。
5. 然后豺总，我們通過(guò)免疫缺陷小鼠的原位異種移植測(cè)試了這三種細(xì)胞群(CD24高表達(dá)车伞、CD44高表達(dá)和CD45-)的腫瘤起始潛力(圖7A和7B)。
6. 每種細(xì)胞群都能在多只小鼠中穩(wěn)健地引發(fā)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤喻喳，表明它們具有腫瘤起始潛能(圖S7C和S7D)另玖。

7. 腫瘤發(fā)展后，我們通過(guò)單細(xì)胞RNA測(cè)序分析了患者源性異種移植模型(PDX)表伦，以確定這些模型中的細(xì)胞狀態(tài)譜谦去，并將其與接種的患者樣本進(jìn)行比較(圖7B)。

   
   

• 圖7. 膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的細(xì)胞轉(zhuǎn)變 （A）實(shí)驗(yàn)流程蹦哼。從患者樣本MGH143中分選出了不同組分的細(xì)胞鳄哭，并將其正位注射到免疫缺陷小鼠體內(nèi)以生成患者源性異種移植瘤（PDX）。對(duì)患者樣本和PDX亞群進(jìn)行了單細(xì)胞RNA測(cè)序纲熏。
• （B）如（A）中所述的樣本分別用餅圖表示妆丘，展示了處于四種狀態(tài)的細(xì)胞比例锄俄。餅圖根據(jù)其分選組分以及是否代表注入樣本或PDX樣本定位在X軸上，并根據(jù)其與原始患者樣本組成相似性（四種狀態(tài)下曼哈頓距離的一減去該距離）定位在Y軸上勺拣。
• （C）實(shí)驗(yàn)流程奶赠。攜帶致癌基因和獨(dú)特條形碼的慢病毒被注射到小鼠海馬區(qū)（詳細(xì)方法見(jiàn)STAR Methods），隨后分析由此產(chǎn)生的腫瘤通過(guò)單細(xì)胞RNA測(cè)序药有。
• （D）在多個(gè)細(xì)胞中識(shí)別出的條形碼各自用餅圖表示毅戈，展示了每種狀態(tài)下細(xì)胞的比例。餅圖的位置基于具有相應(yīng)條形碼的細(xì)胞數(shù)量（X軸）以及這些細(xì)胞中觀察到的細(xì)胞狀態(tài)數(shù)量（Y軸）愤惰。餅圖大小與細(xì)胞數(shù)的對(duì)數(shù)2成比例苇经。
• （E）實(shí)驗(yàn)流程。從膠質(zhì)母細(xì)胞瘤樣本（MGH143和MGG23）建立原代培養(yǎng)羊苟，并感染攜帶獨(dú)特條形碼的慢病毒塑陵，隨后將這些培養(yǎng)物異種移植到小鼠腦內(nèi)，并通過(guò)單細(xì)胞RNA測(cè)序分析形成的腫瘤蜡励。
• （F）來(lái)自（E）的獨(dú)特條形碼以（D）所示的方式展示令花。
• （G）膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞狀態(tài)及其遺傳和微環(huán)境決定因素的模型。有絲分裂紡錘體指示細(xì)胞周期中的細(xì)胞凉倚。較淺或較深的色調(diào)表示每個(gè)程序的強(qiáng)度兼都。中間狀態(tài)顯示在四種狀態(tài)之間，指示轉(zhuǎn)變過(guò)程稽寒。

• 圖S7. 與圖7相關(guān) （A） EGFR基因位點(diǎn)扮碧，僅顯示外顯子1-8。不同個(gè)體細(xì)胞中的跨外顯子連接讀刃硬凇（來(lái)自+鏈的為紅色慎王，來(lái)自-鏈的為藍(lán)色）在MGH143患者和PDX中未分類(lèi)、CD44+或CD24+分類(lèi)的細(xì)胞群中進(jìn)行映射宏侍，顯示每個(gè)分類(lèi)都有EGFR野生型讀取以及跳過(guò)外顯子2-7的讀壤涤佟（EGFR vIII）。
• （B） 基于細(xì)胞狀態(tài)的二維表示（如圖3F所示）谅河。小灰色點(diǎn)反映了MGH143及其相關(guān)PDX的所有細(xì)胞咱旱，而較大的從黑色到紅色的點(diǎn)則反映了相應(yīng)樣本中的細(xì)胞，根據(jù)來(lái)自同一樣本的細(xì)胞密度進(jìn)行著色（STAR方法）绷耍。
• （C） MGH143患者樣本（左）和整體PDX（右）的蘇木精-伊紅染色和Ki67免疫組織化學(xué)吐限。腫瘤患者和PDX顯示出相似的形態(tài)學(xué)（高級(jí)別膠質(zhì)瘤的特點(diǎn)，具有重要的多形性和胞核異型性）和增殖情況褂始。
• （D） 在初次神經(jīng)癥狀出現(xiàn)時(shí)（注射后2-4個(gè)月）诸典，對(duì)MGH143整體、CD24+和CD44+亞群的PDX進(jìn)行了小型動(dòng)物磁共振成像崎苗。
• （E） 根據(jù)分析的100個(gè)基因窗口中的平均相對(duì)表達(dá)推斷PDX樣本中的染色體拷貝數(shù)變異狐粱。行對(duì)應(yīng)于細(xì)胞赘阀，這些細(xì)胞通過(guò)所有存在拷貝數(shù)變異的基因位點(diǎn)的層次聚類(lèi)進(jìn)行排序。
• （F） 放大視圖突出顯示了在PDX細(xì)胞中檢測(cè)到的4個(gè)亞克隆脑奠，其中包括三個(gè)次要亞克隆（#1-3幅慌，每個(gè)由3%-6%的細(xì)胞組成）和一個(gè)主要克滤纹邸（#4，由87%的細(xì)胞組成胰伍，包括放大視圖下方的所有細(xì)胞）齿诞。
• （G） 餅狀圖顯示了每個(gè)PDX中處于四種細(xì)胞狀態(tài)的細(xì)胞比例，當(dāng)將主要（底部）和次要（頂部）亞克隆的細(xì)胞分開(kāi)時(shí)骂租；在這個(gè)分析中合并了次要亞克隆祷杈，因?yàn)樗鼈兏髯蕴《鵁o(wú)法獨(dú)立分析。這一分析表明渗饮，細(xì)胞狀態(tài)的分布與遺傳亞克隆的分離在很大程度上是脫耦的但汞。

Para_02

1. 無(wú)論用于啟動(dòng)PDX的是哪種細(xì)胞群體—CD45?（主要包含AC樣細(xì)胞）、NPC樣或MES樣—所衍生的腫瘤均含有這三種狀態(tài)互站，且分布相似（圖7B）私蕾。
2. 實(shí)際上，在幾乎所有情況下胡桃，衍生的腫瘤重現(xiàn)了原始患者樣本中的細(xì)胞狀態(tài)分布踩叭。
3. 唯一的例外是一個(gè)源自CD24高表達(dá)細(xì)胞群的PDX；但即便這個(gè)PDX也有減少的分選細(xì)胞狀態(tài)比例和增加的AC樣細(xì)胞比例翠胰，而AC樣細(xì)胞是患者樣本中最常見(jiàn)的細(xì)胞狀態(tài)容贝，并與EGFR擴(kuò)增相關(guān)。
4. 這些結(jié)果表明之景，基線細(xì)胞狀態(tài)分布可以在小鼠腦微環(huán)境中重現(xiàn)斤富，而且更重要的是，細(xì)胞狀態(tài)可以從分選狀態(tài)過(guò)渡到其他狀態(tài)闺兢，即使是從單一的分選細(xì)胞群體開(kāi)始茂缚。
5. 當(dāng)對(duì)不同的PDX拷貝數(shù)異常亞克隆進(jìn)行分析重復(fù)時(shí)，也得到了相同的結(jié)果（補(bǔ)充圖S7E-G）

Para_03

1. 為了進(jìn)一步證明膠質(zhì)母細(xì)胞瘤在單細(xì)胞分辨率下的細(xì)胞可塑性屋谭，我們結(jié)合了單細(xì)胞RNA測(cè)序(scRNA-seq)和細(xì)胞條形碼技術(shù)脚囊，在遺傳性小鼠模型和患者來(lái)源的移植瘤(PDX)模型中進(jìn)行了研究。
2. 首先桐磁，我們修改了一種膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的小鼠模型悔耘，在該模型中，含有H-Ras和shP53的慢病毒通過(guò)立體定位注射到GFAP-cre動(dòng)物的海馬區(qū)我擂，這樣每個(gè)轉(zhuǎn)化細(xì)胞都會(huì)額外攜帶一個(gè)獨(dú)特且可遺傳的基因標(biāo)簽(圖7C衬以；STAR方法)(Friedmann-Morvinski等人, 2012年)缓艳。
3. 對(duì)由此產(chǎn)生的小鼠腫瘤進(jìn)行scRNA-seq分析顯示，每個(gè)腫瘤中都包含了在人類(lèi)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中鑒定出的四種細(xì)胞狀態(tài)中的三種(圖7D看峻、S6C和S6D)阶淘。
4. 由于細(xì)胞增殖，許多可遺傳的條形碼在多個(gè)細(xì)胞中被識(shí)別出來(lái)互妓，這些細(xì)胞也通過(guò)scRNA-seq被識(shí)別溪窒。
5. 重要的是，這些條形碼中有39%出現(xiàn)在不同狀態(tài)的細(xì)胞之間冯勉，明確地證明了不同狀態(tài)間的共同可塑性澈蚌。

Para_04

1. 其次，為了評(píng)估可塑性是否也出現(xiàn)在人類(lèi)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中灼狰，我們從患者樣本中提取了兩種主要的人類(lèi)細(xì)胞培養(yǎng)物（MGH143 和 MGG23）宛瞄，用含有獨(dú)特條形碼的慢病毒感染它們（圖 7E；星號(hào)方法）交胚，并將它們正位移植到免疫缺陷小鼠體內(nèi)份汗。
2. 對(duì)由此產(chǎn)生的小鼠腫瘤進(jìn)行單細(xì)胞 RNA 測(cè)序和條形碼分析，識(shí)別出具有相同遺傳條形碼但對(duì)應(yīng)不同膠質(zhì)母細(xì)胞瘤狀態(tài)的人類(lèi)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞承绸。
3. 值得注意的是裸影，存在多個(gè)單一條形碼在四種不同狀態(tài)的細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)的例子，證明了一個(gè)單一細(xì)胞可以產(chǎn)生患者身上觀察到的所有四種膠質(zhì)母細(xì)胞瘤狀態(tài)（圖 7F 和輔助圖 S6E军熏；星號(hào)方法）轩猩。
4. 總體而言，這些結(jié)果與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞顯示出狀態(tài)可塑性相一致荡澎，并且表明了一種基線分布反映了通過(guò)細(xì)胞過(guò)渡和腫瘤基因型而產(chǎn)生的穩(wěn)定狀態(tài)均践。

Discussion

Para_01

1. 更好地理解膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的多種異質(zhì)性來(lái)源及其相互關(guān)系是神經(jīng)腫瘤學(xué)的一個(gè)關(guān)鍵目標(biāo)，對(duì)治療具有廣泛的影響摩幔。
2. 在這里彤委，我們首先進(jìn)行了迄今為止最全面的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤單細(xì)胞RNA測(cè)序分析，詳細(xì)分析了來(lái)自成人和兒童的28個(gè)腫瘤或衡。
3. 每個(gè)腫瘤都是獨(dú)一無(wú)二的焦影，而腫瘤內(nèi)的多樣性是由遺傳、表觀遺傳和微環(huán)境因素的組合驅(qū)動(dòng)的封断。
4. 然而斯辰，我們發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中惡性細(xì)胞的多樣性匯聚成了少數(shù)幾個(gè)重復(fù)出現(xiàn)的表達(dá)特征凑耻，因?yàn)閹缀跛心[瘤內(nèi)異質(zhì)性的特征都被映射到了細(xì)胞周期或四種一般細(xì)胞狀態(tài)之一吩坝。
5. 盡管異質(zhì)性通常被視為一個(gè)主要障礙，但細(xì)胞特征匯聚到少數(shù)幾種共同的異質(zhì)性模式上可能會(huì)有助于識(shí)別許多腫瘤共有的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤依賴(lài)性解阅。

Para_02

1. 每一種重復(fù)出現(xiàn)的細(xì)胞狀態(tài)都與周期性細(xì)胞相關(guān)聯(lián)，其中最高的比例出現(xiàn)在NPC樣和OPC樣狀態(tài)中闸氮，特別是在兒童腫瘤中剪况。
2. 對(duì)患者中的中間狀態(tài)以及PDX和譜系追蹤實(shí)驗(yàn)的分析表明，這四種狀態(tài)之間存在可塑性蒲跨，有著多種可能的轉(zhuǎn)變译断。
3. 這意味著每個(gè)腫瘤由處于多種細(xì)胞狀態(tài)的細(xì)胞組成，這些細(xì)胞可能會(huì)增殖或轉(zhuǎn)變?yōu)槠渌麪顟B(tài)或悲。
4. 這種動(dòng)態(tài)行為意味著增殖率和轉(zhuǎn)變率最終將決定一個(gè)穩(wěn)態(tài)分布镐作，并且可以預(yù)期在不同的腫瘤中會(huì)出現(xiàn)相似的分布，反映出每個(gè)細(xì)胞固有的增殖傾向或轉(zhuǎn)變?yōu)槠渌麪顟B(tài)的傾向隆箩。
5. 然而，我們?cè)诓煌[瘤中觀察到極為不同的分布羔杨，以至于每種狀態(tài)在某些腫瘤中最常見(jiàn)捌臊，在另一些腫瘤中則最少見(jiàn)，這表明可能還有其他因素影響增殖率和轉(zhuǎn)變率兜材。
6. 我們提出理澎，某些遺傳因素決定了特定的轉(zhuǎn)變率，進(jìn)而定義了一個(gè)穩(wěn)態(tài)分布曙寡。
7. 一個(gè)相關(guān)的遺傳因素似乎是EGFR異常糠爬，它與我們的隊(duì)列以及更大的TCGA數(shù)據(jù)集中AC樣細(xì)胞的相對(duì)豐富有關(guān)。
8. 同樣举庶，CDK4和PDGFRA的擴(kuò)增分別與NPC樣和OPC樣狀態(tài)的豐富相關(guān)执隧，而5q染色體缺失和NF1改變則影響MES樣狀態(tài)的頻率（圖7G）。
9. 這些遺傳關(guān)聯(lián)也可能解釋成人和兒童膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中細(xì)胞狀態(tài)分布的不同：在兒童腫瘤中户侥，EGFR改變不如成人腫瘤常見(jiàn)镀琉，這與它們AC樣細(xì)胞頻率較低相吻合（圖3B）。
10. 遺傳學(xué)與細(xì)胞狀態(tài)之間的關(guān)聯(lián)可能構(gòu)成了TCGA整體表達(dá)亞型的生物學(xué)基礎(chǔ)蕊唐，因?yàn)槟[瘤遺傳學(xué)可能決定了更頻繁出現(xiàn)的細(xì)胞狀態(tài)屋摔，從而決定了平均（即，整體）表達(dá)譜（Verhaak等人替梨，2010年钓试；Wang等人，2017年）副瀑。

Para_03

1. 實(shí)驗(yàn)上弓熏，這一模型得到了在神經(jīng)祖細(xì)胞中超表達(dá)實(shí)驗(yàn)的支持，這些實(shí)驗(yàn)將遺傳驅(qū)動(dòng)因素與特定的細(xì)胞狀態(tài)聯(lián)系起來(lái)（圖6）俗扇，并且得到了先前研究的支持硝烂，在那些研究中，在巢蛋白(nestin)陽(yáng)性神經(jīng)祖細(xì)胞中EGFR的超表達(dá)引發(fā)了類(lèi)似星形細(xì)胞瘤的腫瘤形成，而在相同細(xì)胞中PDGFRA的超表達(dá)則導(dǎo)致了類(lèi)似少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤的腫瘤形成滞谢。
2. 因此串稀，與特定細(xì)胞狀態(tài)相關(guān)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑在腫瘤發(fā)生過(guò)程中可能會(huì)被選擇，并在穩(wěn)定特定惡性細(xì)胞狀態(tài)方面發(fā)揮作用狮杨。
3. 更廣泛地說(shuō)母截，這一模型與癌癥發(fā)生涉及產(chǎn)生具有分化能力缺陷的自我更新群體的觀點(diǎn)相一致。
4. 這些遺傳驅(qū)動(dòng)因素中的每一個(gè)都可能使特定的細(xì)胞狀態(tài)偏向于自我更新橄教，從而促進(jìn)主要由該特定狀態(tài)驅(qū)動(dòng)的腫瘤生成清寇。
5. 這一模型可以解釋為什么從不同細(xì)胞狀態(tài)衍生的PDXs驚人地匯聚到了與患者樣本觀察到相同的細(xì)胞狀態(tài)分布。
6. 因此护蝶，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的某些遺傳驅(qū)動(dòng)因素可能決定了特定的轉(zhuǎn)換概率华烟，并定義了穩(wěn)態(tài)分布。
7. 我們猜測(cè)這種定義狀態(tài)轉(zhuǎn)換的能力正在被選擇持灰，而EGFR盔夜、PDGFRA和CDK4不僅被選擇來(lái)促進(jìn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤生長(zhǎng)，而且還擴(kuò)展并穩(wěn)定了膠質(zhì)母細(xì)胞瘤生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)的某種狀態(tài)堤魁。
8. 針對(duì)這樣的遺傳驅(qū)動(dòng)因素可能調(diào)節(jié)狀態(tài)分布喂链，并有可能導(dǎo)致由不同狀態(tài)的自我更新所主導(dǎo)的替代分布。
9. 這樣的情景或許可以解釋為何在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中針對(duì)單一信號(hào)傳導(dǎo)途徑的靶向治療效果有限妥泉。

Para_04

1. 總之椭微，我們闡明了膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞表達(dá)狀態(tài)的譜系及其可塑性，確定了重現(xiàn)神經(jīng)發(fā)育盲链、細(xì)胞周期和微環(huán)境影響的細(xì)胞程序蝇率。
2. 通過(guò)展示特定的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤遺傳驅(qū)動(dòng)因素如何影響這些狀態(tài)的頻率，我們?yōu)槟z質(zhì)母細(xì)胞瘤的遺傳異質(zhì)性提供了細(xì)胞層面的相關(guān)解釋?zhuān)⑻峁┝艘粋€(gè)模型來(lái)解釋為什么不同的整體表達(dá)程序刽沾，如TCGA亞型瓢剿，會(huì)富集特定的遺傳改變。
3. 進(jìn)一步的研究將需要評(píng)估轉(zhuǎn)化機(jī)會(huì)悠轩，并評(píng)估現(xiàn)有治療手段對(duì)驅(qū)動(dòng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的細(xì)胞狀態(tài)譜系的影響间狂。

STAR★Methods

Key Resources Table

關(guān)鍵資源表格

Lead Contact and Materials Availability

主要聯(lián)系人及材料可用性

Para_01

1. 更多信息和資源及試劑的請(qǐng)求應(yīng)發(fā)送至Mario L. Suvà (Suva.Mario@mgh.harvard.edu)，他將負(fù)責(zé)處理這些請(qǐng)求火架。

Experimental Model and Subject Details

實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ团c對(duì)象詳情

Human Subjects

人類(lèi)受試者

Para_01

1. 在馬薩諸塞州總醫(yī)院（MGH）的成人患者以及波士頓兒童醫(yī)院的兒科患者及其父母鉴象，在機(jī)構(gòu)審查委員會(huì)協(xié)議DF/HCC 10-417和DF/HCC 15-370B下提供了術(shù)前知情同意參與本研究。
2. 患者包括男性和女性何鸡。
3. 臨床特征總結(jié)于補(bǔ)充表S1中纺弊。

Cell lines

細(xì)胞系

Para_01

1. 患者來(lái)源的原代培養(yǎng)物（MGH143，MGG23）在神經(jīng)基質(zhì)培養(yǎng)基（GIBCO 21103-049）中培養(yǎng)骡男，該培養(yǎng)基補(bǔ)充了1X N2/B27（GIBCO）淆游、1% 青霉素/鏈霉素（GIBCO）、1X 谷氨酰胺（GIBCO）、20 ng/mL 表皮生長(zhǎng)因子和20 ng/mL 基本成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FGF2）犹菱。
2. MGH143的詳細(xì)信息總結(jié)于（表S1）拾稳。
3. MGG23的詳情見(jiàn)（Wakimoto等人，2012年）腊脱。

Para_02

1. 利用已發(fā)表的協(xié)議從小鼠胚胎干細(xì)胞（V6.5）中建立了小鼠神經(jīng)祖細(xì)胞（NPCs）(Kerman等人, 2015年)访得。
2. NPCs通過(guò)含有L-谷氨酰胺/碳酸氫鈉的DMEM:F12（GIBCO 11320-033）培養(yǎng)基補(bǔ)充1X N2/B27、1%青霉素/鏈霉素陕凹、1微克/毫升層粘連蛋白（來(lái)源于EHS腫瘤）悍抑、20納克/毫升表皮生長(zhǎng)因子（EGF）和20納克/毫升堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF, FGF2）進(jìn)行增殖。
3. NPCs在聚-L-鳥(niǎo)氨酸包被的細(xì)胞培養(yǎng)皿上培養(yǎng)杜耙。
4. 星形膠質(zhì)細(xì)胞由NPCs衍生并在NPC培養(yǎng)基中添加4%胎牛血清（FBS）的情況下進(jìn)行增殖搜骡。

Method Details

方法詳情

Tumor acquisition and single-cell sorting

腫瘤獲取與單細(xì)胞分選

Para_01

1. 新鮮腫瘤直接從手術(shù)室收集，并通過(guò)冷凍切片確認(rèn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的存在佑女。
2. 使用木瓜蛋白酶為基礎(chǔ)的腦腫瘤分離試劑盒（Miltenyi Biotec）進(jìn)行機(jī)械和酶解離浆兰，此前已有報(bào)道。
3. 腫瘤細(xì)胞用含1%牛血清白蛋白的漢克斯平衡鹽溶液（BSA / HBSS）阻斷珊豹。
4. 腫瘤首先用CD45-Vioblue直接抗體偶聯(lián)物（克隆REA747，Miltenyi Biotec）在4°C下染色30分鐘榕订。
5. 細(xì)胞用冷PBS洗滌店茶，然后懸浮在含1微摩爾calcein AM（Life Technologies）和0.33微摩爾TO-PRO-3碘化物（Life Technologies）的1毫升BSA / HBSS中，共同染色30分鐘劫恒，隨后進(jìn)行分選贩幻。
6. 對(duì)于MGH143樣本，使用CD45 MicroBeads（Miltenyi Biotec）去除免疫細(xì)胞两嘴。
7. CD45陰性細(xì)胞用calcein AM（Life Technologies）標(biāo)記存活狀態(tài)丛楚，并用CD24-APC（人抗體，克隆REA832憔辫，Miltenyi Biotec）和CD44-VioBlue（人抗體趣些，克隆REA690，Miltenyi Biotec）進(jìn)行染色贰您，以分選可行的非免疫細(xì)胞亞群坏平。
8. 分選使用FACS Aria Fusion特制系統(tǒng)（Becton Dickinson）完成，采用488納米（calcein AM锦亦，530/30濾光器）舶替、640納米（TO-PRO-3或CD24-APC，670/14濾光器）和405納米（CD45-VioBlue或CD44-VioBlue杠园，450/50濾光器）激光顾瞪。
9. 使用標(biāo)準(zhǔn)、嚴(yán)格的前向散射高度與面積標(biāo)準(zhǔn)來(lái)區(qū)分雙倍體細(xì)胞，僅選擇單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行分析陈醒。
10. 可存活的單個(gè)細(xì)胞被確定為calcein AM陽(yáng)性且TO-PRO-3陰性惕橙。
11. 我們將單獨(dú)的、可存活的孵延、免疫的和非免疫的單個(gè)細(xì)胞分別分選到含有TCL緩沖液（QIAGEN）和1%β-巰基乙醇的96孔板中吕漂。
12. 分選后立即將板放在干冰上冷凍，并在進(jìn)行全轉(zhuǎn)錄組擴(kuò)增尘应、文庫(kù)制備和測(cè)序前儲(chǔ)存在-80°C惶凝。
13. 對(duì)于在10x基因組學(xué)平臺(tái)上處理的樣本，使用Dead Cell Removal Kit（Miltenyi Biotec）從單細(xì)胞懸浮液中去除死細(xì)胞

RNA in situ hybridization

RNA原位雜交

Para_01

1. 根據(jù)機(jī)構(gòu)審查委員會(huì)批準(zhǔn)的協(xié)議犬钢，從馬薩諸塞州總醫(yī)院和波士頓兒童醫(yī)院獲取了腫瘤的石蠟包埋組織切片苍鲜。
2. 將切片安裝在玻璃載玻片上，并儲(chǔ)存在-80°C下玷犹。
3. 使用RNAscope 2.5 HD Duplex檢測(cè)試劑盒（Advanced Cell Technologies混滔，目錄號(hào)322430）對(duì)載玻片進(jìn)行染色，具體方法如先前所述歹颓。
4. 簡(jiǎn)而言之坯屿，載玻片在60°C下烘焙1小時(shí)，然后用二甲苯和乙醇進(jìn)行脫蠟和脫水巍扛。
5. 組織在室溫下用RNAscope過(guò)氧化氫處理10分鐘领跛，在98°C下用RNAscope靶標(biāo)檢索試劑處理15分鐘。
6. 之后撤奸，將RNAscope蛋白酶Plus（目錄號(hào)322331）在40°C下應(yīng)用于組織30分鐘吠昭。
7. 通過(guò)將C2探針（紅色）稀釋到C1探針（綠色）中1:50來(lái)制備雜交探針。
8. 使用的Advanced Cell Technologies RNAscope靶標(biāo)探針包括Hs-CD24（目錄號(hào)313021胧瓜；313021-C2）矢棚，Hs-CD44（目錄號(hào)311271-C2），Hs-PDGFRA（目錄號(hào)604481-C2）府喳，Hs-S100B（目錄號(hào)430891）蒲肋，Hs-MKI67（目錄號(hào)591771；591771-C2）钝满。
9. 將探針加入到組織中并在40°C下雜交2小時(shí)肉津。
10. 使用RNAscope 2.5 HD Duplex檢測(cè)試劑盒提供的說(shuō)明書(shū)和試劑進(jìn)行了10步放大程序。
11. 組織在室溫下用Gill’s蘇木精復(fù)染25秒舱沧，隨后用VectaMount封固介質(zhì)（Vector Laboratories）進(jìn)行封固妹沙。
12. 對(duì)于ISH定量，至少在腫瘤代表區(qū)域計(jì)數(shù)了1000個(gè)細(xì)胞熟吏。

Intracranial patient-derived xenografts

顱內(nèi)患者來(lái)源的異種移植瘤

Para_01

1. 從人類(lèi)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤手術(shù)時(shí)直接分離的新鮮腫瘤細(xì)胞被立體定向注射到5至12周齡的雌性NSG小鼠（NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ, 杰克遜實(shí)驗(yàn)室, 緬因州巴港）的右側(cè)紋狀體距糖。
2. 簡(jiǎn)而言之, 小鼠用2%異氟烷與醫(yī)用空氣混合麻醉后置于立體定位框架上玄窝。
3. 通過(guò)一個(gè)小皮膚切口暴露小鼠的顱骨，并使用25號(hào)針頭在選定的立體定位坐標(biāo)處鉆一個(gè)小孔悍引。
4. 將懸浮于6微升PBS中的細(xì)胞裝入33號(hào)漢密爾頓注射器中恩脂，并根據(jù)以下坐標(biāo)緩慢注入：位于頂點(diǎn)骨2.0毫米側(cè)方，皮質(zhì)表面下2毫米趣斤。
5. 注射完成后俩块，針頭保持原位一分鐘，然后緩慢抽出浓领，以幫助減少細(xì)胞回流玉凯。
6. 縫合和固定頭皮后，小鼠放回籠子置于加熱墊上联贩，并視覺(jué)監(jiān)測(cè)直至完全恢復(fù)漫仆。
7. 之后每天檢查小鼠是否有痛苦跡象，包括抽搐泪幌、共濟(jì)失調(diào)盲厌、體重下降和震顫。
8. 通過(guò)小型動(dòng)物MRI進(jìn)行監(jiān)測(cè)祸泪，首次是在注射后8周吗浩，再次則是在小鼠開(kāi)始出現(xiàn)神經(jīng)癥狀時(shí)，如頭部?jī)A斜没隘、抽搐懂扼、突然體重下降、失去平衡和共濟(jì)失調(diào)升略。
9. 一旦小鼠出現(xiàn)癥狀，就立即進(jìn)行安樂(lè)死屡限，安樂(lè)死后立即收集腦組織品嚣，患者來(lái)源的異種移植瘤（PDX）同一天進(jìn)行單細(xì)胞分選處理，采用與人原發(fā)腫瘤相同的協(xié)議钧大。
10. 所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均按照達(dá)納-法伯/哈佛癌癥中心機(jī)構(gòu)以及索爾克研究所動(dòng)物護(hù)理和使用委員會(huì)（IACUC）批準(zhǔn)的方案進(jìn)行翰撑。

Small animal MRI

小型動(dòng)物磁共振成像

Para_01

1. MRI實(shí)驗(yàn)是在布魯克BioSpec 7T/30厘米USR水平孔超導(dǎo)磁體系統(tǒng)（布魯克公司，比勒里卡啊央，馬薩諸塞州）上進(jìn)行的眶诈，該系統(tǒng)配備B-GA12S2梯度線圈和最高至二階的室溫勻場(chǎng)系統(tǒng)，可提供最大梯度幅度440毫特斯拉/米和切換率3440特斯拉/米/秒瓜饥。
2. 布魯克制造的23毫米內(nèi)徑鳥(niǎo)籠型體積射頻（RF）線圈用于射頻激發(fā)和接收逝撬。
3. 布魯克AutoPac帶有激光定位系統(tǒng)用于精確定義感興趣區(qū)域。
4. 動(dòng)物使用1.5%異氟烷與醫(yī)用空氣混合麻醉乓土，流速為每分鐘2升宪潮。
5. 使用暖風(fēng)風(fēng)扇將體溫保持在37°C溯警。
6. 腹部放置壓力傳感器用于呼吸門(mén)控。
7. 動(dòng)物的呼吸和體溫由SAII（薩儀器公司狡相，石溪梯轻，紐約州）監(jiān)測(cè)和門(mén)控系統(tǒng)型號(hào)1025T監(jiān)控并調(diào)節(jié)。
8. 使用布魯克Paravision 6.0.1軟件獲取MRI數(shù)據(jù)尽棕。
9. 通過(guò)快速自旋回波（RARE）序列結(jié)合脂肪抑制技術(shù)獲得T2加權(quán)圖像喳挑，參數(shù)設(shè)置如下：重復(fù)時(shí)間（TR）為6000毫秒，回波時(shí)間（TE）為36毫秒滔悉，視野（FOV）為19.2×19.2毫米2伊诵，矩陣大小為256×192，空間分辨率75×100微米2氧敢，切片厚度0.5毫米日戈，切片數(shù)量29，RARE因子15孙乖，平均次數(shù)8次浙炼，采集時(shí)間7分鐘。
10. 使用半自動(dòng)分割分析軟件ClinicalVolumes（ClinicalVolumes唯袄，倫敦弯屈，英國(guó)）對(duì)圖像進(jìn)行分析并提取腫瘤體積。

Barcoded lentiviral vector design, construction, and production

條形碼慢病毒載體的設(shè)計(jì)恋拷、構(gòu)建與生產(chǎn)

Para_01

1. 一個(gè)包含16×N混合堿基（估計(jì)多樣性超過(guò)4×10^9）及常用引物序列的393堿基對(duì)DNA片段被綜合资厉，這些序列用于高效的擴(kuò)增（CAT-R Fw / LucN Rv / pBABE5′ / EF1a Fw），由Integrated DNA Technologies合成蔬顾。
2. 該DNA片段通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）進(jìn)行擴(kuò)增宴偿，限制循環(huán)次數(shù)為20次以減少擴(kuò)增過(guò)程中可能引入的偏差，使用Q5高保真聚合酶（New England Biolabs）以及含有CAT-R Fw或EF1a Fw序列和與慢病毒載體有25bp重疊序列的引物進(jìn)行擴(kuò)增诀豁，用于吉布森組裝反應(yīng)窄刘。
3. 擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)并提取，使用QIAquick凝膠提取試劑盒（QIAGEN）舷胜，然后再次使用QIAquick PCR純化試劑盒（QIAGEN）進(jìn)行純化娩践，并通過(guò)吉布森組裝方法（New England Biolabs）克隆到HrasV12-IRES-GFP-shp53（Friedmann-Morvinski等人，2012年）或僅含GFP并用EcoRI（New England Biolabs）消化的載體中烹骨。
4. EcoRI位點(diǎn)位于GFP編碼區(qū)域之后和土撥鼠肝炎病毒后轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件（WPRE）之后翻伺，以及含病毒多聚腺苷酸化信號(hào)的3′長(zhǎng)末端重復(fù)序列（LTR）之前。
5. 組裝后的載體使用Endura電轉(zhuǎn)化細(xì)胞（Lucigen）在LB瓊脂平板上放大沮焕，限制時(shí)間為12至14小時(shí)以減少菌落競(jìng)爭(zhēng)可能引入的偏差吨岭，并使用PureLink HiPure Maxiprep試劑盒（Thermo Fisher Scientific）進(jìn)行純化。
6. 含有16個(gè)混合堿基的慢病毒載體通過(guò)桑格測(cè)序驗(yàn)證了相應(yīng)的條形碼區(qū)域峦树。
7. 使用Lipofectamine 2000（Thermo Fisher Scientific）為基礎(chǔ)的轉(zhuǎn)染技術(shù)未妹，在293T細(xì)胞（每15厘米板5×10^6個(gè)細(xì)胞簿废，共20塊板）中與轉(zhuǎn)移質(zhì)粒、包裝質(zhì)粒（GAG/POL络它，RSV-Rev）及包膜質(zhì)粒（VSV-G）共同轉(zhuǎn)染產(chǎn)生假型化的第三代慢病毒族檬。
8. 轉(zhuǎn)染時(shí)和更換培養(yǎng)基時(shí)向培養(yǎng)基中加入2 μM丁酸鈉以增加病毒產(chǎn)量。
9. 轉(zhuǎn)染效率基于熒光表達(dá)進(jìn)行評(píng)估化戳。
10. 轉(zhuǎn)染后48和72小時(shí)收集上清液单料，并通過(guò)超速離心濃縮慢病毒。
11. 慢病毒的生物滴度根據(jù)293T細(xì)胞上的熒光表達(dá)進(jìn)行評(píng)估点楼。

Intracranial injection of barcoded lentivirus

條形碼標(biāo)記的慢病毒的顱內(nèi)注射

Para_01

1. 慢病毒通過(guò)立體定位技術(shù)被注射到6至16周齡的hGFAP-cre小鼠的海馬區(qū)（杰克遜實(shí)驗(yàn)室扫尖，緬因州巴港）。所有小鼠都在索爾克研究所的無(wú)病原體條件下飼養(yǎng)掠廓，并且所有操作均得到了機(jī)構(gòu)動(dòng)物護(hù)理和使用委員會(huì)的批準(zhǔn)换怖。
2. 慢病毒（1×10^5感染單位）懸浮于1微升PBS中，并裝入33號(hào)規(guī)格的漢密爾頓注射器中蟀瞧，然后緩慢注射（每30秒至1分鐘注射0.1微升）沉颂，坐標(biāo)如下：相對(duì)于前囟點(diǎn)，后方2.0毫米悦污、側(cè)邊1.5毫米铸屉、背側(cè)2.3毫米。
3. 完成注射后切端，針頭留在原地3分鐘彻坛，然后緩慢拔出，以幫助減少2分鐘內(nèi)的病毒回流踏枣。

In vitro labeling of patient derived cells with barcoded lentiviruses

使用條形碼慢病毒對(duì)患者來(lái)源的細(xì)胞進(jìn)行體外標(biāo)記

Para_02

1. 患者來(lái)源細(xì)胞（MGH143昌屉、MGG23）在含有條形碼的慢病毒稀釋液中孵育12小時(shí)，孵育介質(zhì)為神經(jīng)基質(zhì)培養(yǎng)基（GIBCO 21103-049）茵瀑，補(bǔ)充了1X N2/B27（GIBCO）间驮、1%青霉素/鏈霉素（GIBCO）、1X Glutamax（GIBCO）瘾婿、20 ng/mL 表皮生長(zhǎng)因子和20 ng/mL堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FGF2）蜻牢。
2. 條形碼標(biāo)記的細(xì)胞用PBS洗滌三次烤咧，然后用預(yù)熱的TrypLE Express（GIBCO）解離偏陪，制備單細(xì)胞懸液（每只小鼠使用2x10^4-1x105個(gè)細(xì)胞）以進(jìn)行顱內(nèi)注射。
3. 剩余細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)煮嫌，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析來(lái)評(píng)估綠色熒光蛋白表達(dá)及慢病毒感染效率笛谦。

Fluorescence-activated cell sorting of GFP positive mouse and human GBM cells

利用熒光激活的細(xì)胞分選對(duì)綠色熒光蛋白陽(yáng)性的小鼠和人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞進(jìn)行分選

Para_02

1. 所有小鼠在安樂(lè)死后均用冰冷的PBS灌注。
2. 收集到的大腦組織使用含木瓜蛋白酶的大腦腫瘤分離試劑盒（Miltenyi Biotec）進(jìn)行機(jī)械和酶解離昌阿，并補(bǔ)充了0.1%的I型膠原酶（Thermo Fisher Scientific）/PBS饥脑。
3. 細(xì)胞首先用鈣黃綠素藍(lán)AM（Life Technologies）和Zombie NIR（BioLegend）染色30分鐘恳邀，在4°C下進(jìn)行，并用抗小鼠CD16/32（BD Biosciences）染色5分鐘灶轰。
4. 用冰冷的2%胎牛血清/PBS洗滌細(xì)胞后谣沸，再用抗小鼠CD45-PerCP（克隆30-F11，BD Biosciences）染色30分鐘笋颤，在4°C下進(jìn)行乳附。
5. 使用Becton Dickinson Influx流式細(xì)胞儀（Becton Dickinson）進(jìn)行分選，激光波長(zhǎng)分別為640 nm（Zombie NIR伴澄，750LP濾光片）赋除、355 nm（鈣黃綠素藍(lán)AM，460/50濾光片）非凌、488 nm（CD45-PerCP举农，692/40濾光片）和488 nm（GFP，530/40濾光片）敞嗡。
6. 使用側(cè)向散射（SSC）寬度與前向散射（FSC）面積颁糟，以及觸發(fā)脈沖寬度與FSC的標(biāo)準(zhǔn)來(lái)區(qū)分雙倍體細(xì)胞，僅對(duì)單細(xì)胞進(jìn)行門(mén)控秸妥。
7. 存活的單細(xì)胞被鑒定為鈣黃綠素藍(lán)AM陽(yáng)性且Zombie NIR陰性滚停。
8. 我們將存活的、CD45陰性/GFP陽(yáng)性的單細(xì)胞分選到含有5微升TCL緩沖液（QIAGEN）及1%β-巰基乙醇的96孔板中粥惧。
9. 分選后立即將孔板冷凍键畴，并在-80°C儲(chǔ)存，直至進(jìn)行全轉(zhuǎn)錄組擴(kuò)增突雪、文庫(kù)制備和測(cè)序起惕。

In vitro overexpression experiments

體外過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)

Para_02

1. 利用已發(fā)表的協(xié)議從小鼠胚胎干細(xì)胞（V6.5）中建立了NPCs（Kerman等人，2015年）咏删。
2. NPCs使用含DMEM:F12（GIBCO 11320-033惹想，含L-谷氨酰胺/碳酸氫鈉）的培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)增，該培養(yǎng)基補(bǔ)充了1X N2/B27督函、1%青霉素/鏈霉素嘀粱、1 μg/mL層粘連蛋白（來(lái)源于EHS腫瘤）、20 ng/mL表皮生長(zhǎng)因子和20 ng/mL堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FGF2）辰狡。
3. NPCs在聚-L-鳥(niǎo)氨酸包被的細(xì)胞培養(yǎng)皿上進(jìn)行培養(yǎng)锋叨。
4. 星形膠質(zhì)細(xì)胞從NPCs中衍生并使用補(bǔ)充了4%胎牛血清（FBS）的NPC培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)增。
5. 使用的構(gòu)建體包括：含有CMV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)T2A-eGFP表達(dá)的空載體宛篇、人EGFR-T2A-eGFP或小鼠CDK4-T2A-eGFP娃磺。
6. 所有構(gòu)建體通過(guò)Sanger測(cè)序以及全質(zhì)粒下一代測(cè)序進(jìn)行了驗(yàn)證。
7. 在96孔板中（每孔2,000個(gè)細(xì)胞）使用ATPlite按照制造商的說(shuō)明測(cè)量細(xì)胞增殖叫倍。
8. 細(xì)胞在鋪板后1小時(shí)（第0天）偷卧、第2天和第4天裂解豺瘤。
9. 定量結(jié)果歸一化至第0天的數(shù)據(jù)

Imaging of GFAP positive cells in mouse NPC cultures

在小鼠NPC培養(yǎng)中GFAP陽(yáng)性細(xì)胞的成像

Para_02

1. 將表達(dá)eGFP、EGFR或CDK4的NPCs以每孔80,000個(gè)細(xì)胞的密度接種于8孔玻璃載玻片(BD生物科學(xué))上听诸。
2. 使用4%甲醛固定細(xì)胞坐求，然后在4°C下用0.5% Triton X-100透化10分鐘。
3. 使用含10%正常山羊血清的PBS阻斷晌梨，隨后用GFAP抗體(Dako, Z0334)以1:2500的比例稀釋過(guò)夜染色瞻赶。
4. 然后用PBS洗滌細(xì)胞静尼，并用與Alexa-555偶聯(lián)的山羊抗兔二抗(在封閉緩沖液中的稀釋比例為1:500)進(jìn)行染色滓玖。
5. 用Hoechst 33342(PBS中的稀釋比例為1:10,000)對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色克饶。
6. 載玻片隨后用Vectashield封固介質(zhì)封固河泳，并在Zeiss LSM 800共聚焦顯微鏡下成像罢缸。
7. 然后在ImageJ軟件中組裝最大強(qiáng)度圖像痴施。
8. 接著利用ImageJ軟件中的Find Maxima工具津滞，在設(shè)定噪聲容限以排除背景陽(yáng)性信號(hào)的情況下計(jì)數(shù)GFAP陽(yáng)性的細(xì)胞

Quantification and Statistical Analysis

量化與統(tǒng)計(jì)分析

Single-cell RNA-seq data generation and processing

單細(xì)胞RNA-seq數(shù)據(jù)生成與處理

Para_01

1. Smart-seq2全轉(zhuǎn)錄組擴(kuò)增类早、文庫(kù)構(gòu)建和測(cè)序按照先前發(fā)表的方法進(jìn)行(Filbin等人, 2018年; Picelli等人, 2014年; Tirosh等人, 2016年; Venteicher等人, 2017年)豆混。
2. 作為質(zhì)量控制手段, 我們檢查了每個(gè)細(xì)胞檢測(cè)到的基因數(shù)目(補(bǔ)充圖S1B)篓像。
3. 我們觀察到了雙峰分布, 并保守地排除了28%測(cè)序細(xì)胞, 這些細(xì)胞檢測(cè)到的基因少于3,000個(gè)。
4. 在剩余的細(xì)胞中, 我們平均每個(gè)細(xì)胞檢測(cè)到5,730個(gè)基因, 這突出了我們的單細(xì)胞RNA測(cè)序數(shù)據(jù)集的高質(zhì)量皿伺。
5. 表達(dá)水平量化為Ei,j = log2(TPMi,j/10 + 1), 其中TPMi,j表示樣本j中基因i的每百萬(wàn)轉(zhuǎn)錄本數(shù), 由RSEM計(jì)算得出(Li和Dewey, 2011年)员辩。
6. 由于我們估計(jì)單細(xì)胞文庫(kù)的復(fù)雜度約為100,000個(gè)轉(zhuǎn)錄本, 為了避免每個(gè)轉(zhuǎn)錄本大約被計(jì)數(shù)10次的情況, TPM值除以10。
7. 對(duì)于剩余細(xì)胞, 我們計(jì)算每個(gè)基因的匯總表達(dá)量為Ea(i) = log2(平均值(TPMi,1...n) + 1), 并定義分析基因集合為Ea大于4的基因鸵鸥。
8. 然后, 我們通過(guò)將每個(gè)基因的表達(dá)水平歸零, 定義相對(duì)于剩余細(xì)胞和分析基因的相對(duì)表達(dá)量, 即Eri,j = Ei,j - 平均值[Ei,1...n]奠滑。
9. 對(duì)于一部分樣本, 單細(xì)胞通過(guò)10X Chromium 3′單細(xì)胞平臺(tái)處理, 使用Chromium單細(xì)胞3′文庫(kù)、凝膠珠和芯片試劑盒(10X Genomics, 加利福尼亞州普萊森頓), 遵循制造商的協(xié)議妒穴。
10. 簡(jiǎn)而言之, 在芯片的每個(gè)通道中加入7,000個(gè)細(xì)胞, 在Chromium儀器中將它們分隔成凝膠珠在乳液(GEMs)中, 接著進(jìn)行細(xì)胞裂解和條形碼標(biāo)記的RNA逆轉(zhuǎn)錄宋税。
11. 乳液破裂后, 進(jìn)行擴(kuò)增、打斷以及添加接頭和樣品索引讼油。

tSNE analysis and identification of non-malignant cell types

tSNE分析及非惡性細(xì)胞類(lèi)型的鑒定

Para_01

1. 使用相對(duì)表達(dá)值并通過(guò)tSNE對(duì)所有通過(guò)質(zhì)量控制的細(xì)胞進(jìn)行分類(lèi)杰赛，采用MATLAB實(shí)現(xiàn)的tsne，默認(rèn)參數(shù)（圖1B）矮台。
2. 出現(xiàn)了三個(gè)小的聚類(lèi)乏屯，與三種非惡性細(xì)胞類(lèi)型的標(biāo)記物高表達(dá)相關(guān)。
3. 因此瘦赫，我們?yōu)檫@三種細(xì)胞類(lèi)型定義了標(biāo)記基因集辰晕，并通過(guò)它們的平均表達(dá)來(lái)給每個(gè)細(xì)胞打分。
4. 對(duì)于巨噬細(xì)胞：CD14耸彪、AIF1伞芹、FCER1G忘苛、FCGR3A蝉娜、TYROBP唱较、CSF1R。
5. 對(duì)于T細(xì)胞：CD2召川、CD3D南缓、CD3E、CD3G荧呐。
6. 對(duì)于少突膠質(zhì)細(xì)胞：MBP汉形、TF、PLP1倍阐、MAG概疆、MOG、CLDN11峰搪。
7. 當(dāng)評(píng)分高于4時(shí)岔冀，將細(xì)胞歸類(lèi)為這些細(xì)胞類(lèi)型之一。
8. 第二次僅對(duì)惡性細(xì)胞進(jìn)行tSNE分析概耻，且"NumPCAComponents"設(shè)置為30（圖1C）

Definition of single-cell gene signature scores

單細(xì)胞基因特征分?jǐn)?shù)的定義

Para_01

1. 給定一組基因 (Gj)使套，該組基因反映特定細(xì)胞類(lèi)型或生物學(xué)功能的表達(dá)特征，我們?yōu)槊總€(gè)細(xì)胞 i 計(jì)算一個(gè)分?jǐn)?shù) SCj(i)鞠柄，用以量化基因集 Gj 在細(xì)胞 i 中的相對(duì)表達(dá)水平侦高，計(jì)算方式為 Gj 中各基因的平均相對(duì)表達(dá)量 (Er) 減去對(duì)照基因集 (Gjcont) 的平均相對(duì)表達(dá)量：SCj(i) = 平均[Er(Gj,i)] – 平均[Er(Gjcont,i)].
2. 對(duì)照基因集的定義方法是首先將所有分析的基因按聚合表達(dá)水平 (Ea) 分成 30 個(gè)等級(jí)，然后對(duì)于基因集 Gj 中的每個(gè)基因厌杜，從相同表達(dá)等級(jí)中隨機(jī)選擇 100 個(gè)基因奉呛。
3. 這樣，對(duì)照基因集具有與 Gj 相似的表達(dá)水平分布夯尽，并且對(duì)照基因集的規(guī)模是 Gj 的 100 倍侧馅，因此其平均表達(dá)量類(lèi)似于從與考慮中的基因集同樣大小的 100 個(gè)隨機(jī)選擇的基因集中取平均。
4. 通過(guò)這種方式呐萌，對(duì)照基因集具有與 Gj 類(lèi)似的表達(dá)水平分布馁痴，而且它的規(guī)模比 Gj 大 100 倍，使其平均表達(dá)量相當(dāng)于從 100 個(gè)與所考慮的基因集相同大小的隨機(jī)選擇的基因集中取平均肺孤。

CNA inference from single-cell data

從單細(xì)胞數(shù)據(jù)推斷CNA

Para_01

1. 通過(guò)按染色體位置對(duì)分析基因進(jìn)行排序罗晕，并對(duì)相對(duì)表達(dá)值應(yīng)用移動(dòng)平均，使用每條染色體上100個(gè)基因的滑動(dòng)窗口來(lái)估算CNAs赠堵，這與我們先前描述的方法一致小渊。
2. 被歸類(lèi)為非惡性細(xì)胞類(lèi)型的細(xì)胞用于定義正常核型的基線，即從所有細(xì)胞中減去它們的平均CNA值茫叭。
3. 然后酬屉，根據(jù)兩個(gè)基于CNA的指標(biāo)對(duì)每個(gè)細(xì)胞進(jìn)行評(píng)分。
4. "CNA信號(hào)"反映了整個(gè)基因組CNAs的整體程度，定義為基因組中CNA值平方的均值呐萨。
5. "CNA相關(guān)性"指的是每個(gè)細(xì)胞的CNA譜與來(lái)自相應(yīng)腫瘤的所有細(xì)胞（除通過(guò)基因表達(dá)分類(lèi)為非惡性的細(xì)胞外）的平均CNA譜之間的相關(guān)性杀饵。
6. 如果細(xì)胞的CNA信號(hào)超過(guò)0.02且CNA相關(guān)性超過(guò)0.4，則通過(guò)CNA分析將其分類(lèi)為惡性細(xì)胞（圖S1C）谬擦。

Integrated definition of malignant cells

惡性細(xì)胞的綜合定義

Para_01

1. 然后切距，我們將CNA分類(lèi)與基于tSNE的分類(lèi)和基于基因集的分類(lèi)相結(jié)合，使得最終的惡性細(xì)胞列表包括那些根據(jù)CNA被分類(lèi)為惡性的細(xì)胞惨远、屬于惡性tSNE聚類(lèi)的細(xì)胞谜悟、以及根據(jù)標(biāo)記基因集未被歸類(lèi)為任何非惡性細(xì)胞類(lèi)型的細(xì)胞。
2. 同樣地北秽，只有當(dāng)這三種分析方法的分配一致時(shí)葡幸，細(xì)胞才會(huì)被歸類(lèi)為每種非惡性細(xì)胞類(lèi)型。

Identification of intra-tumor variability programs using hierarchical clustering

使用層次聚類(lèi)識(shí)別腫瘤內(nèi)變異性的程序

Para_01

1. 首先贺氓，我們分別對(duì)每個(gè)腫瘤中的單個(gè)惡性細(xì)胞進(jìn)行了基于平均連接法的層次聚類(lèi)礼患，采用一減皮爾遜相關(guān)系數(shù)（針對(duì)所有分析基因）作為距離度量。
2. 為了選擇聚類(lèi)而不預(yù)設(shè)嚴(yán)格的聚類(lèi)數(shù)量或它們?cè)趯哟螛?shù)中的層級(jí)掠归，我們首先恢復(fù)所有潛在的聚類(lèi)缅叠，然后根據(jù)大小、差異表達(dá)信號(hào)以及與其他聚類(lèi)的冗余性排除它們虏冻，具體方法如下：(1) 我們排除了包含少于5個(gè)細(xì)胞或超過(guò)相應(yīng)腫瘤中惡性細(xì)胞總數(shù)80%的聚類(lèi)肤粱。
3. (2) 對(duì)于每個(gè)聚類(lèi)，我們估計(jì)了偏好表達(dá)基因的數(shù)量：我們確定了所有在該聚類(lèi)中的平均表達(dá)量比在同一腫瘤中的其他惡性細(xì)胞高出三倍厨相，并且相應(yīng)的p值低于0.05（使用t檢驗(yàn)并用Benjamini-Hochberg方法校正了假發(fā)現(xiàn)率）的基因领曼。
4. 接著，我們分別計(jì)算調(diào)整后p值低于0.05（Nsig1）和低于0.005（Nsig2）的顯著基因數(shù)目蛮穿。
5. 所有Nsig1大于50且Nsig2大于10的聚類(lèi)被定義為具有足夠的差異表達(dá)信號(hào)庶骄，并保留用于進(jìn)一步分析。
6. (3) 對(duì)于每一對(duì)Jaccard指數(shù)超過(guò)75%的聚類(lèi)践磅，我們排除了Nsig1較低的那個(gè)聚類(lèi)单刁。
7. 將這種方法應(yīng)用于27個(gè)腫瘤，發(fā)現(xiàn)了479個(gè)聚類(lèi)府适，其中包括（正如所期望的那樣）許多大型聚類(lèi)及其較小的子聚類(lèi)的情況羔飞。
8. 最后，我們將差異表達(dá)基因（Nsig1）作為每個(gè)聚類(lèi)的特征檐春，從而得到了479個(gè)特征逻淌。

Integration of individual signatures into meta-modules

將個(gè)體簽名整合到元模塊中

Para_01

1. 利用Jaccard指數(shù)反映各對(duì)特征簽名之間的重疊程度，并采用平均連接法進(jìn)行層次聚類(lèi)疟暖。
2. 識(shí)別出了四組特征簽名卡儒，其中兩組又穩(wěn)健地分為兩個(gè)子組（圖3）田柔，最終得到六組特征簽名，作為定義六個(gè)元模塊的基礎(chǔ)骨望。
3. 對(duì)于每組特征簽名硬爆，我們基于對(duì)應(yīng)的特征簽名的平均表達(dá)log2比率來(lái)定義元模塊：對(duì)于每個(gè)特征簽名，通過(guò)比較對(duì)應(yīng)潛在群集中的所有細(xì)胞與同一腫瘤中的其他惡性細(xì)胞锦募，定義了表達(dá)log2比率。
4. 然后將構(gòu)成一個(gè)組（或子組）的所有特征簽名的這些log2比率取平均值邻遏，在每種情況下糠亩，這些組至少包括六種不同的腫瘤。
5. 每個(gè)元模塊被定義為平均log2比率高于2的所有基因准验，并限制為該組程序中l(wèi)og2比率最高的50個(gè)基因赎线。

Identification of cycling cells

循環(huán)細(xì)胞的識(shí)別

Para_01

1. 還為細(xì)胞周期的G1/S和G2/M階段定義了元模塊，這是通過(guò)對(duì)與細(xì)胞周期相關(guān)的特征進(jìn)行分析得出的糊饱。
2. 接下來(lái)垂寥，利用這些元模塊的細(xì)胞得分來(lái)將細(xì)胞分類(lèi)為處于細(xì)胞周期中的或非細(xì)胞周期中的（圖S3A和S3B）。
3. 對(duì)于這兩個(gè)細(xì)胞周期得分中的每一個(gè)另锋，所有惡性細(xì)胞的得分分布被擬合到一個(gè)正態(tài)分布滞项，并使用p值小于0.001的閾值來(lái)區(qū)分處于細(xì)胞周期中的細(xì)胞。

Assignment of cells to meta-modules and their hybrids

將細(xì)胞分配給元模塊及其雜交體

Para_01

1. 惡性細(xì)胞最初被分配到得分最高的元模塊夭坪，包括六個(gè)元模塊（MES1-like文判、MES2-like、NPC1-like室梅、NPC2-like戏仓、AC-like、OPC-like）亡鼠，但不包括細(xì)胞周期元模塊赏殃。
2. 對(duì)于大多數(shù)分析，我們將MES1和MES2細(xì)胞群合并為一個(gè)MES-like細(xì)胞群间涵，并且類(lèi)似地仁热，將NPC1和NPC2細(xì)胞合并為一個(gè)NPC-like細(xì)胞群。
3. 接下來(lái)勾哩，我們根據(jù)三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)定義了混合型細(xì)胞：(1) 第二個(gè)元模塊的得分高于1股耽；(2) 第二個(gè)元模塊的得分高于映射到該元模塊（作為其最高得分元模塊）的細(xì)胞中的10%的得分；(3) 第二個(gè)元模塊與第三個(gè)元模塊之間的得分差至少為0.3钳幅。

Para_02

1. 當(dāng)我們使用不同的標(biāo)準(zhǔn)時(shí)物蝙，雜交體的百分比和模式基本沒(méi)有變化。
2. 對(duì)于每一對(duì)元模塊（圖 3D）敢艰，通過(guò)打亂每個(gè)腫瘤中細(xì)胞的元模塊得分來(lái)定義一個(gè)"預(yù)期數(shù)量"的雜交體诬乞。
3. 每個(gè)元模塊獨(dú)立被打亂，這樣就消除了元模塊之間的任何關(guān)聯(lián)，而得分的分布保持不變震嫉，腫瘤間的分布差異也保持不變森瘪。
4. 這一打亂過(guò)程進(jìn)行了100次，并且每次我們都會(huì)使用上述定義的標(biāo)準(zhǔn)來(lái)計(jì)算雜交體的數(shù)量票堵。
5. 然后扼睬，這些計(jì)數(shù)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差被用作預(yù)期雜交體數(shù)量的對(duì)照。

Identification of genetic subclones by inferred CNAs

通過(guò)推斷的拷貝數(shù)異常識(shí)別遺傳亞克隆

Para_01

1. 在每個(gè)細(xì)胞中悴势，我們定義了每個(gè)染色體或染色體臂推斷出的平均CNA值窗宇。
2. 接下來(lái)，我們檢查了每個(gè)腫瘤中是否存在一個(gè)或多個(gè)染色體臂在惡性細(xì)胞中的CNA值呈雙峰分布特纤。
3. 我們使用MATLAB的fitgmdist函數(shù)將CNA值擬合到雙峰高斯分布军俊，并檢查了細(xì)胞屬于兩種模式的后驗(yàn)概率。
4. 在大多數(shù)腫瘤和對(duì)于大多數(shù)染色體臂來(lái)說(shuō)捧存，兩種模式非常相似粪躬，細(xì)胞無(wú)法被自信地分配到不同的模式中。
5. 然而昔穴，在特定情況下（特定腫瘤中的特定染色體臂）镰官，兩種模式差異顯著，以至于大多數(shù)細(xì)胞可以被自信地分配到其中一種模式吗货。
6. 在這些情況下朋魔，當(dāng)一個(gè)腫瘤中有超過(guò)80%的惡性細(xì)胞對(duì)兩種模式之一的后驗(yàn)概率高于0.95，并且至少有10個(gè)細(xì)胞被分配給兩種模式時(shí)卿操，我們定義了亞克隆警检。
7. 那些無(wú)法自信地被分配到任一模式的少數(shù)細(xì)胞被排除在亞克隆分析之外。
8. 如果一個(gè)腫瘤只有一個(gè)染色體（或染色體臂）具有雙峰分布害淤，我們定義了兩個(gè)克隆扇雕，對(duì)應(yīng)于兩種模式。
9. 如果一個(gè)腫瘤有多個(gè)這樣的染色體窥摄，則我們將所有組合的模式（至少包含三個(gè)細(xì)胞）視為亞克隆

Characterization of meta-modules by comparison to external data

通過(guò)與外部數(shù)據(jù)比較來(lái)表征元模塊

Para_01

1. 我們通過(guò)四種互補(bǔ)的方法來(lái)表征這些元模塊镶奉。
2. 首先，通過(guò)每個(gè)元模塊中非惡性細(xì)胞類(lèi)型的相對(duì)表達(dá)分?jǐn)?shù)（圖2）崭放。
3. 為此哨苛，我們從多個(gè)來(lái)源獲得了非惡性腦細(xì)胞的單細(xì)胞RNA測(cè)序數(shù)據(jù)（Darmanis等人, 2015年, Nowakowski等人, 2017年, Pollen等人, 2015年, Tirosh等人, 2016b年）。
4. 對(duì)于每個(gè)來(lái)源币砂，我們根據(jù)細(xì)胞類(lèi)型分類(lèi)匯總細(xì)胞建峭，定義每種細(xì)胞類(lèi)型的平均表達(dá)譜（或使用原始研究產(chǎn)生的相應(yīng)數(shù)據(jù)），最后通過(guò)減去所有細(xì)胞類(lèi)型的平均表達(dá)量來(lái)定義細(xì)胞類(lèi)型的相對(duì)表達(dá)决摧。
5. 第二亿蒸，通過(guò)發(fā)育中的人類(lèi)皮層中的47種非惡性細(xì)胞類(lèi)型與隨機(jī)抽取的250個(gè)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞映射到每個(gè)元模塊的平均表達(dá)譜之間的全局表達(dá)相似性（皮爾遜相關(guān)系數(shù)）（圖S2F）凑兰。
6. 第三，通過(guò)非惡性細(xì)胞類(lèi)型中元模塊基因的富集情況（圖S2F）（Nowakowski等人, 2017年）边锁。
7. 富集程度被定義為給定細(xì)胞類(lèi)型中最高度表達(dá)的元模塊基因的比例的顯著水平（-對(duì)數(shù)10(P值)）姑食，并通過(guò)超幾何檢驗(yàn)計(jì)算。
8. 類(lèi)似地茅坛，我們使用R中的clusterProfiler::enricher函數(shù)測(cè)試了這些元模塊在MSigDB中的C2和C5基因集合（總數(shù)10,679個(gè)基因）中的富集情況（圖S2E）音半。

Two-dimensional representation of malignant cellular states

惡性細(xì)胞狀態(tài)的二維表示

Para_01

1. 細(xì)胞首先根據(jù)D = max(SCopc,SCnpc) - max(SCac,SCmes)的符號(hào)被分為OPC/NPC與AC/MES，其中D定義了所有細(xì)胞的y軸贡蓖。
2. 接下來(lái)曹鸠，對(duì)于OPC/NPC細(xì)胞（即，D > 0）摩梧，x軸值被定義為log2(|SCopc – SCnpc|+1)物延，而對(duì)于AC/MES細(xì)胞（即宣旱，D < 0）仅父，x軸被定義為log2(|SCac – SCmes|)。
3. 為了可視化兩個(gè)維度表示中的細(xì)胞子集（例如浑吟，增殖細(xì)胞）的富集情況笙纤，我們計(jì)算了每個(gè)細(xì)胞在其100個(gè)最近鄰中的屬于相應(yīng)子集的細(xì)胞比例，這些最近鄰由歐幾里得距離定義组力，并通過(guò)顏色顯示這些比例省容。

Bulk scores defined for TCGA samples

為T(mén)CGA樣本定義的大規(guī)模得分

Para_01

1. TCGA樣本的表達(dá)數(shù)據(jù)基于Agilent微陣列平臺(tái)，因?yàn)樵撈脚_(tái)具有最多的樣本數(shù)量燎字。
2. 對(duì)元模塊的大批量樣本進(jìn)行表達(dá)評(píng)分腥椒，方法如上所述針對(duì)單細(xì)胞所進(jìn)行的一樣，但有兩個(gè)例外候衍。
3. （1）大樣本中基因的表達(dá)反映了多種表達(dá)細(xì)胞類(lèi)型的綜合效應(yīng)笼蛛，因此，在單細(xì)胞數(shù)據(jù)中是特定細(xì)胞狀態(tài)良好標(biāo)記的許多基因蛉鹿，在大樣本數(shù)據(jù)中可能不是良好的標(biāo)記滨砍。
4. 為了排除這類(lèi)基因，我們首先通過(guò)元模塊平均表達(dá)定義初始大樣本得分妖异。
5. 接著惋戏，我們計(jì)算了每個(gè)元模塊基因與初始得分的相關(guān)性。
6. 如果基因的相關(guān)性低于0.4或相關(guān)性更高的情況出現(xiàn)在不同的元模塊中他膳，則排除這些基因响逢。
7. 然后使用剩余的基因來(lái)定義改進(jìn)后的大樣本得分。
8. （2）那些不屬于元模塊但被發(fā)現(xiàn)與元模塊高頻率相關(guān)聯(lián)的基因（補(bǔ)充圖S5D和S5E）也被納入到這個(gè)分析中棕孙。

Association of bulk scores with CNAs

體細(xì)胞分?jǐn)?shù)與拷貝數(shù)異常的關(guān)聯(lián)

Para_01

1. 染色體拷貝數(shù)丟失龄句、獲得以及高水平擴(kuò)增數(shù)據(jù)來(lái)源于TCGA（Brennan等人回论，2013年）。
2. 對(duì)于每個(gè)基因分歇，如果至少有10個(gè)腫瘤樣本具有特定的染色體異常模式（獲得傀蓉、丟失或高水平擴(kuò)增），則使用t檢驗(yàn)比較所有具有該模式和沒(méi)有該模式的腫瘤樣本的總分职抡。
3. 圖5B和補(bǔ)充圖S5G顯示了與-log10(P)對(duì)應(yīng)的顯著性值葬燎，其中P是t檢驗(yàn)的概率值，對(duì)于文中提到的所有遺傳事件（EGFR缚甩、PDGFRA和CDK4擴(kuò)增及5號(hào)染色體q臂缺失）而言谱净，這些值均大于5。
4. 我們進(jìn)一步檢查了在每個(gè)元模塊得分最高的腫瘤子集中每個(gè)事件的發(fā)生率（包括NF1下調(diào)）擅威，排除了所有得分低于1的腫瘤樣本壕探，并發(fā)現(xiàn)了每個(gè)正相關(guān)事件的顯著富集（超幾何檢驗(yàn)p值小于0.001）（補(bǔ)充圖S5F）。

Assignment of TCGA subtypes to tumors profiled by scRNA-seq

將TCGA亞型分配給通過(guò)單細(xì)胞RNA測(cè)序描繪的腫瘤

Para_01

1. 我們模擬了每個(gè)腫瘤的整體表達(dá)水平郊丛，表示為 Ei,J = log2(TPMi,J+1)李请，其中 J 指該腫瘤中的所有惡性細(xì)胞。
2. 得到的整體表達(dá)譜隨后根據(jù)三種 TCGA 亞型進(jìn)行評(píng)分厉熟，并被分配到得分最高的亞型或如果第一和第二亞型之間的得分差異小于 0.05导盅，則被分配到"混合"類(lèi)別。

Integration of the 10X Genomics data

10X Genomics數(shù)據(jù)的整合

Para_01

1. 對(duì)由10x Genomics平臺(tái)生成的第二個(gè)數(shù)據(jù)集進(jìn)行了處理和分析揍瑟，處理方式與上述SMART-Seq2數(shù)據(jù)相同白翻，但有以下例外：預(yù)處理：(i) 由于不同腫瘤之間檢測(cè)到的基因數(shù)量差異較大，與SMART-Seq2數(shù)據(jù)相比绢片，我們排除了所有檢測(cè)到的基因數(shù)少于該腫瘤平均基因數(shù)一半或多于兩倍的所有測(cè)序細(xì)胞（占所有測(cè)序細(xì)胞的26％）滤馍。(ii) 非惡性細(xì)胞識(shí)別：通過(guò)一種或兩種方法識(shí)別非惡性細(xì)胞。(1) 我們定義了正常細(xì)胞類(lèi)型的標(biāo)記基因集（參見(jiàn)前面的STAR方法部分）底循，并對(duì)所有細(xì)胞的每種特征的平均表達(dá)量進(jìn)行評(píng)分巢株。巨噬細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞的評(píng)分呈現(xiàn)雙峰分布。因此此叠，選擇大于等于0.5和大于等于3的閾值來(lái)界定非惡性細(xì)胞纯续。(2) 所有細(xì)胞采用平均鏈接法進(jìn)行層次聚類(lèi)，使用配對(duì)皮爾遜相關(guān)系數(shù)作為距離度量灭袁。識(shí)別出三個(gè)大聚類(lèi)猬错，其中一個(gè)聚類(lèi)與高表達(dá)非惡性細(xì)胞標(biāo)志物（特別是巨噬細(xì)胞）相關(guān)聯(lián)。該聚類(lèi)中的100％細(xì)胞被第一種方法捕獲茸歧【氤矗總體上，通過(guò)兩種方法定義的非癌細(xì)胞占通過(guò)質(zhì)量控制的細(xì)胞總數(shù)的40％软瞎。(iii) 基因特征生成：我們分析了來(lái)自9個(gè)腫瘤的9,870個(gè)癌細(xì)胞逢唤，以識(shí)別我們數(shù)據(jù)中差異基因表達(dá)的一致性特征拉讯。定義了577個(gè)特征，并通過(guò)成對(duì)的Jaccard重疊進(jìn)行比較鳖藕，如前所述魔慷。重疊的層次聚類(lèi)揭示了一個(gè)強(qiáng)烈的細(xì)胞周期特征元模塊。剩下的78％的非細(xì)胞周期特征與SMART-Seq2平臺(tái)產(chǎn)生的特征進(jìn)行了比較（并在正文討論）

Comparison of 10x and SMART-Seq2 results

Para_02

1. 從10x數(shù)據(jù)中獲得的448個(gè)非周期性特征依據(jù)平均連接層次聚類(lèi)著恩，并使用特征間的Jaccard重疊作為距離度量院尔。
2. 隨后，根據(jù)對(duì)應(yīng)聚類(lèi)中的細(xì)胞表達(dá)與同一腫瘤中所有其他惡性細(xì)胞相比喉誊，對(duì)聚類(lèi)后的特征與正文中的六個(gè)元模塊（NPC1邀摆、NPC2、OPC伍茄、AC栋盹、MES1和MES2）的對(duì)應(yīng)關(guān)系進(jìn)行評(píng)分，評(píng)分定義如上文所述（參見(jiàn)單細(xì)胞基因特征評(píng)分定義）敷矫。

Analysis of barcoded cells

條形碼細(xì)胞的分析

Para_01

1. 本研究中使用的條形碼包括獨(dú)特的（即例获，可變的）16核苷酸序列，這些序列可以通過(guò)兩個(gè)常見(jiàn)的29核苷酸側(cè)翼序列來(lái)識(shí)別（參見(jiàn)STAR方法部分）沪饺。
2. 為了將細(xì)胞分配給條形碼躏敢，我們首先在單細(xì)胞RNA測(cè)序讀段中搜索側(cè)翼序列以定位條形碼序列闷愤。
3. 如果在一個(gè)細(xì)胞中計(jì)數(shù)至少三次整葡，或者比任何其他條形碼多計(jì)數(shù)至少三倍，則將條形碼分配給該細(xì)胞讥脐。
4. 未分配條形碼的細(xì)胞被排除在下游分析之外遭居。
5. 接下來(lái)，檢測(cè)到條形碼的細(xì)胞如果得分最高且得分至少為1分旬渠，并且與次高得分之間的差距至少為0.5分俱萍，則被分配到相應(yīng)的元模塊（有關(guān)單細(xì)胞得分定義，請(qǐng)參見(jiàn)上文）告丢。
6. 根據(jù)這些標(biāo)準(zhǔn)未分配到元模塊的細(xì)胞也被排除枪蘑。
7. 在保留的細(xì)胞中，53%和78%屬于至少包含兩個(gè)細(xì)胞的條形碼群體（圖7C和7D以及圖7E和7F分別所示）岖免。

Data and Code Availability

數(shù)據(jù)和代碼的可獲得性

Para_01

1. 為本研究生成的數(shù)據(jù)可通過(guò)博德研究所單細(xì)胞門(mén)戶獲取岳颇。(https://portals.broadinstitute.org/single_cell/study/SCP393/single-cell-rna-seq-of-adult-and-pediatric-glioblastoma) 以及基因表達(dá)聚類(lèi)數(shù)據(jù)庫(kù) (GEO: GSE131928)。
2. 支持當(dāng)前研究的代碼可應(yīng)要求從相應(yīng)作者處獲得颅湘。

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