文章名稱：Single-cell landscape of immunological responses in patients with COVID-19
在由嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒 2 (SARS-CoV-2) 感染引起的冠狀病毒病 2019 (COVID-19) 中病蛉，疾病嚴重程度與宿主免疫反應之間的關系尚不完全清楚洗做。在這里龙助，我們對 5 名健康供體和 13 名 COVID-19 患者（包括中度允悦、重度和恢復期病例）的外周血樣本進行了單細胞 RNA 測序。通過確定免疫細胞的轉錄譜，結合組裝的 TCR和 BCR，我們分析了免疫細胞的功能特性齐板。 COVID-19 患者的大多數(shù)細胞類型顯示出強烈的干擾素-α 反應和整體急性炎癥反應辩稽。此外惧笛，高細胞毒性效應 T 細胞亞群的密集擴增，例如 CD4+ effector-GNLY（顆粒溶素）逞泄、CD8+ effector-GNLY 和 NKT CD160患整，與中度患者的康復有關。在重癥患者中喷众，免疫環(huán)境的特點是干擾素反應紊亂各谚、嚴重的免疫衰竭、T 細胞受體庫偏斜和廣泛的 T 細胞擴增侮腹。這些發(fā)現(xiàn)說明了疾病進展過程中免疫反應的動態(tài)性質嘲碧。
前言：
由 SARS-CoV-2 感染引起的 COVID-19 會導致一系列疾病，從輕度到重度疾病和死亡父阻。雖然 SARS-CoV-2 與 SARS-CoV 類似愈涩，使用血管緊張素轉換酶 2 (ACE2) 作為其進入靶細胞的受體 ，但兩種病毒的病毒脫落模式不同加矛。 SARS-CoV-2 病毒載量可在癥狀前階段檢測到履婉，并在疾病發(fā)作后不久達到峰值，這明顯早于 SARS-CoV斟览。這些因素導致 SARS-CoV-2 的高傳染性及其迅速傳播毁腿，導致 COVID-19 的全球大流行。 SARS-CoV-2 感染和病毒感染介導的免疫反應都可以直接和/或間接損害 COVID-19 患者呼吸道中的細胞苛茂。大多數(shù)患者表現(xiàn)出輕度至中度癥狀已烤，高達 15% 的患者發(fā)展為重癥肺炎，大約 5% 的患者最終發(fā)展為急性呼吸窘迫綜合征和/或多器官衰竭 妓羊。在患有合并癥的老年人和免疫功能低下的人中觀察到更高的死亡率胯究。
由于目前尚無針對SARS-CoV-2的有效藥物或疫苗，因此迫切需要更好地了解疾病期間的宿主免疫反應躁绸，以更好地設計預后和診斷標志物裕循，并為患有嚴重疾病的患者設計適當?shù)闹委煾深A措施。
病毒感染和抗病毒宿主免疫反應在體內相互作用并影響疾病嚴重程度以及臨床結果净刮，尤其是在急性病毒感染期間剥哑。因此，COVID-19的免疫病理學備受關注淹父。中度疾病表現(xiàn)的 COVID-19 患者的免疫反應表明株婴，急性 SARS-CoV-2 感染可引發(fā)強烈的細胞和體液免疫反應。然而暑认，仍不清楚不受控制的先天性和受損的適應性免疫反應如何與肺組織損傷相關困介。具有嚴重疾病表現(xiàn)的 COVID-19 患者表現(xiàn)出明顯的淋巴細胞減少和血清促炎細胞因子升高揪垄。我們最近報道了一例致命病例，觀察到肺組織中明顯的間質淋巴細胞浸潤和外周血中T細胞的過度激活逻翁。最近，發(fā)現(xiàn)炎癥性FCN1+巨噬細胞替代了來自嚴重SARS-CoV-2感染患者的支氣管肺泡灌洗液中的FABP4+巨噬細胞捡鱼，而在中度SARS-CoV-2感染的患者中觀察到高度擴增和功能性的組織駐留克隆CD8 T細胞八回。這些觀察結果乍看之下揭示新型冠狀病毒肺炎進展的可能的免疫致病機制。然而驾诈，仍然缺乏對不同臨床環(huán)境中的抗病毒或致病性免疫反應的整體表征缠诅。
在這里，我們實施了單細胞RNA測序 (scRNA-seq)乍迄，以獲得中度至重度癥狀的COVID-19患者外周血單核細胞 (pbmc) 免疫反應的無偏和全面的可視化管引。我們的研究描述新型冠狀病毒肺炎疾病進展過程中血液免疫細胞的高分辨率轉錄組圖，這將有助于更好地了解疾病的保護性和致病性免疫反應闯两。
結果：
結果1：外周免疫細胞的單細胞轉錄譜
為了表征 COVID-19 患者的免疫學特征褥伴，我們進行了基于液滴的 scRNA-seq（10X Genomics）來研究來自 13 名患者和 5 名健康供體（HD）作為對照的 PBMC 的轉錄組譜（圖 1a）。 13 名 COVID-19 患者分為三種臨床狀況：中度（n = 7）漾狼、重度（n = 4）和恢復期（conv重慢；n = 6，其中 4 例與中度病例配對）（圖 1a逊躁， b）似踱。還對每個受試者進行了單細胞 T 細胞受體 (TCR) 和 B 細胞受體 (BCR) 測序。在統(tǒng)一的單細胞分析流程（參見方法）之后稽煤，從所有樣本的 PBMC 的 122,542 個細胞中獲得了約 6 億個獨特的轉錄本核芽。在這些細胞中，22,711 個細胞（18.5%）來自 HD 狀態(tài)酵熙，37,901 個細胞（30.9%）來自于中度狀態(tài)轧简，24,640 個細胞（20.1%）來自于嚴重狀態(tài)，37,290 個細胞（30.4%）來自恢復期狀態(tài)绿店。所有高質量細胞都被整合到一個數(shù)據(jù)集中吉懊，并在校正讀取深度和線粒體讀取計數(shù)后進行主成分分析（補充圖 2a，b）假勿。
a，由條件標識 (左) 和樣本標識 (右) 著色的所有細胞的UMAP转培。
b恶导，所有細胞中基因計數(shù) (左)，UMIs (中) 和線粒體基因百分比 (右) 的UMAP浸须。
c惨寿，血漿干擾素和細胞因子水平跨越四種條件: HD (n = 10)邦泄，中度 (n = 7)，重度 (n = 4) 和Conv (n = 6) 樣本裂垦。
使用基于圖形的統(tǒng)一流形近似和投影聚類（UMAP）顺囊，我們根據(jù)典型基因標記的表達捕獲了 14 種主要細胞類型或亞型的轉錄組（圖 1c-e 和補充圖 2a，b）蕉拢。這些細胞包括幼稚狀態(tài)T（幼稚T）細胞（CD3+CCR7+）特碳、活化狀態(tài)T（活化T）細胞（CD3+PRF1+）、黏膜相關不變T（MAIT）細胞（SLC4A10+TRAV1-2+） , γδ T 細胞 (TRGV9+TRDV2+), 增殖性 T (pro T) 細胞 (CD3+MKI67+), 自然殺傷 (NK) 細胞 (KLRF1+), B 細胞 (MS4A1+), 漿 B 細胞 (MZB1+), CD14+ 單核細胞 (CD14+單核細胞晕换；LYZ+CD14+)午乓、CD16+ 單核細胞 (CD16+ mono; LYZ+FCGR3A+)、單核細胞衍生的樹突狀細胞 (mono DCs; CD1C+)闸准、漿細胞樣樹突狀細胞 (pDCs; LILRA4+)益愈、血小板 (PPBP+) 和造血干細胞 (HSCs; CYTL1+GATA2+)。因此夷家，我們清楚地定義了外周血中細胞亞群的組成蒸其。
a埂蕊，顯示整體研究設計的示意圖谚中。 scRNA-seq 在四個條件下應用于 PBMC被去，輸出數(shù)據(jù)用于 TCR 和 BCR 分析和表達分析再膳。
b坷襟，13 名感染 SARS-CoV-2 并參加我們研究的患者的病程時間表心墅。 RT-qPCR 表示對 SARS-CoV-2 核酸進行 PCR 檢測枷遂。 RT-qPCR 陽性表示鼻咽或痰液樣本對 SARS-CoV-2 核酸呈陽性漆枚。左側的顏色條表示與 a 中顏色相同的條件湿蛔。
c膀曾，確定的細胞群。來自 HD (n = 5)阳啥、中度 (n = 7)添谊、嚴重 (n = 4) 和 conv (n = 6) 樣本的 122,542 個單細胞的 UMAP 投影，顯示形成了 14 個具有相應標簽的簇察迟。每個點對應一個單元格斩狱，根據(jù)單元格類型著色。
d扎瓶，典型細胞標記用于按細胞身份標記簇所踊，如 UMAP 圖所示。數(shù)據(jù)根據(jù)表達水平著色概荷，圖例以對數(shù)刻度標記秕岛。
e，小提琴圖顯示了 14 個集群中選定的典型細胞標記的表達分布。行代表選定的標記基因继薛，列代表與 c 中顏色相同的簇修壕。
結果2：不同疾病條件下細胞組成的差異
為了揭示三種條件下（中度、重度和轉化）細胞組成的差異遏考，并與 HD 中的比較慈鸠，我們根據(jù) scRNA-seq 數(shù)據(jù)計算了每個個體 PBMC 中 14 種主要細胞類型的相對百分比（圖 2a-d）」嗑撸活化 T 細胞簇的相對百分比在中度患者中達到峰值林束，并且即使在恢復期也沒有恢復到正常水平。值得注意的是稽亏，幼稚 T 細胞、MAIT 細胞和mono DCs 的相對豐度隨著疾病嚴重程度而降低缕题，這些群體后來在 conv 患者中恢復（圖 2d）截歉。相反，pro T 細胞烟零、漿 B 細胞瘪松、CD14+ 單核細胞和血小板的相對百分比隨著疾病嚴重程度而增加，后來在 conv 患者中下降（圖 2d）锨阿。嚴重疾病患者中 CD14+ 單核細胞的大量增加與最近的一項研究一致宵睦，該研究表明由致病性 T 細胞誘導的炎性單核細胞會引發(fā) COVID-19 中的炎性風暴。
接下來墅诡，為了研究 SARS-CoV-2 感染期間的抗病毒和病原免疫反應壳嚎，我們評估了在四種條件下的主要細胞類型。我們發(fā)現(xiàn)末早，在 COVID-19 患者的 PBMC 的所有主要細胞類型中烟馅，對 IFN-α 的反應均顯著上調，并且在重癥患者的幾乎所有主要細胞類型中均顯示出最高值然磷，但漿 B 細胞除外郑趁，其中中度患者的 IFN-α 反應最大（圖 2e）。此外姿搜，除前T細胞外寡润，急性炎癥反應在所選細胞類型的條件下表現(xiàn)出一致和顯著的差異。幾種細胞類型顯示出與疾病嚴重程度大致對應的急性炎癥反應趨勢舅柜，包括活化的 T 細胞梭纹、γδ T 細胞、NK 細胞和 CD16+ 單核細胞（圖 2e）致份。此外栗柒，I 型 IFN、IFN-γ 和其他炎性細胞因子的血漿水平在重癥患者中表現(xiàn)出最高水平（補充圖 2c）。這些結果表明 COVID-19 患者存在強烈的整體促炎反應（圖 2e）瞬沦。
a太伊，HD、中度逛钻、重度和轉換條件的 UMAP 投影僚焦。每個點對應一個單元格，根據(jù)單元格類型著色曙痘。
b芳悲，源自 HD (n = 5)、中度 (n = 7)边坤、重度 (n = 4) 和 conv (n = 6) 樣本的每種細胞類型的平均比例名扛。
c，頂部點圖顯示每個樣本的 PBMC 中淋巴細胞和單核細胞的絕對計數(shù)總和茧痒。底部條形圖顯示了單個樣本水平的細胞組成肮韧。
d，每個集群的條件偏好旺订。 y 軸弄企，四個條件下樣本的平均百分比。條件以不同的顏色顯示区拳。每個條形圖代表一個細胞簇拘领。
e，來自 HD (n = 5)樱调、中度 (n = 7)约素、重度 (n = 4) 和 conv (n = 6) 樣本的集群中兩個 GO 生物過程項的表達水平的箱線圖。條件以不同的顏色顯示笆凌。
結果3：在先天免疫細胞中觀察到強烈的干擾素反應
為了進一步研究 SARS-CoV-2 感染后先天免疫細胞的轉錄組變化（圖 3a业汰、b），我們比較了 CD14+ 和 CD16+ 單核細胞中中度或重度疾病與 HD 疾病的表達模式菩颖。我們發(fā)現(xiàn)顯著差異表達的基因（DEGs）參與了 COVID-19 患者的 IFN 反應样漆、骨髓白細胞活化、細胞因子產(chǎn)生和NF-κB 信號通路（圖 3c晦闰，d）放祟。此外，來自嚴重疾病的單核細胞中更多的 DEG 富含分子代謝和分解代謝過程呻右，以及細胞因子分泌（補充圖 3a）跪妥。對于 NK 細胞，與單核細胞類似声滥，與 IFN 反應眉撵、細胞因子產(chǎn)生侦香、NF-κB 信號通路和白細胞細胞毒性相關的 DEG 在 COVID-19 患者中顯著富集（圖 3e、f）纽疟，表明先天免疫細胞的反應一致SARS-CoV-2 感染罐韩。此外，與中度患者相比污朽，重癥 NK 細胞的 DEG散吵，如 ITGB2、CCL5 和 CXCR2蟆肆，與遷移相關過程更密切相關（補充圖 3b矾睦，c）。
與 DEG 富集結果一致炎功，我們發(fā)現(xiàn)單核細胞和 NK 細胞在 SARS-CoV-2 感染后均表現(xiàn)出顯著上調的 IFN 和急性炎癥反應枚冗，尤其是在重癥患者中（圖 2e）。與 HD 條件相比蛇损，單核細胞和 NK 細胞中的細胞凋亡和遷移水平也上調（圖 3g）赁温。與單核細胞和 NK 細胞中相當?shù)募毎蛲鏊讲煌匕Y患者的先天免疫細胞比中度患者更容易遷移（圖 3g 和補充圖 3c）州藕。這些結果表明，COVID-19 患者的大多數(shù)先天免疫細胞類型顯示出強烈的 IFN 反應酝陈。
a床玻，單核細胞 (39,276) 和 NK 細胞 (7,479) 的 UMAP 投影。每個點對應一個單元格沉帮，根據(jù)單元格類型著色锈死。
b，HD穆壕、中度待牵、重度和轉換條件的 UMAP 投影。
c喇勋，散點圖顯示中度（n = 7）或重度患者（n = 4）與 HD（n = 5）的單核細胞中的 DEG缨该。每個紅點表示一個單獨的基因。
d川背，c中紅色DEG的基因富集分析贰拿。 GO 術語標有名稱和 ID，并按 -log10 (P) 值排序熄云。顏色越深表示 P 值越小膨更。顯示了前 20 個豐富的 GO 術語。有趣的術語用紅色標記缴允。
e荚守，類似于 c 的散點圖，但適用于 NK 細胞。
f矗漾，與 d 類似的基因富集分析锈候，但針對 NK 細胞。
g缩功，來自 HD (n = 5)晴及、中度 (n = 7)、重度 (n = 4) 和 conv (n = 6) 樣本的集群中兩個 GO 生物過程術語在單核細胞和 NK 細胞中表達水平的箱線圖.條件以不同的顏色顯示嫡锌。
a，與健康供體相比势木，中度患者而不是重度患者的單核細胞中DEGs的基因富集分析 (頂部)蛛倦，與健康供體相比，重度患者而不是中度患者的基因富集分析 (底部)啦桌。GO術語標有名稱和ID溯壶，并按-log10 (P) 值排序。顏色較深表示p值較小甫男。
b且改，類似 (a) 圖，但對于NK細胞板驳。
c又跛，點圖顯示了在四個條件下與NK細胞 (左) 和單核細胞 (右) 遷移過程相關的基因表達。
結果4：COVID-19患者T細胞亞群的特征
為了表征四種條件下個體中T 細胞亞群的變化若治，我們對來自 PBMC 的 T 細胞進行亞聚類慨蓝，并根據(jù)典型 T 細胞標志物的表達和分布獲得 12 個亞群（圖 4a，b）：CD4+ T 細胞的 6 種亞型（ CD3E+CD4+)端幼、3 個 CD8+ T 細胞亞型 (CD3E+CD8A+) 和 3 個 NKT 細胞亞型 (CD3E+CD4–CD8A–TYROBP+)礼烈。
CD4+ T細胞簇的六種亞型中，除了幼稚CD4+（CD4+幼稚）T細胞（CCR7+SELL+）婆跑、記憶CD4+（CD4+記憶）T細胞（S100A4+GPR183+）此熬、效應記憶CD4+（CD4+效應記憶）T細胞 (S100A4+GPR183+GZMA+) 和調節(jié)性 T (Treg) 細胞 (FOXP3+IL2RA+) 亞型，我們定義了兩種效應 CD4+ T 亞型滑进，CD4+ 效應-GZMK 和 CD4+ 效應-GNLY摹迷。 CD4+ 效應子-GNLY 簇的特征是與細胞毒性相關的基因高表達，包括 NKG7郊供、GZMA峡碉、GZMB、GZMH 和 GNLY驮审，而 CD4+ 效應子-GZMK 簇顯示 GZMK 基因的相對高表達鲫寄，但其他細胞毒性基因的低表達基因（圖4b和補充圖4a吉执，b）。此外地来，CD4+ 效應子-GNLY 細胞顯示出 TBX21 的高表達戳玫，這意味著它們是 1 型輔助 T（TH 1）樣細胞（補充圖 4c）。相反未斑，CD4+效應-GZMK和CD4+效應記憶具有2型輔助T（TH 2）細胞樣特征咕宿，GATA3高表達（補充圖4c）。CD8+T細胞簇的三個亞型包括一個初始CD8+（CD8+初始）T細胞亞群（CCR7+SELL+）和兩個效應器CD8+T細胞亞組（CD8+效應器GZMK和CD8+效果器GNLY）蜡秽，它們都具有GZMA和NKG7的高表達水平府阀。詳細地說，CD8+ 效應子-GZMK 獨特地表達 GZMK芽突，而 CD8+ 效應子-GNLY 顯示出相對高的 GZMB/H 和 GNLY 表達水平（圖 4b 和補充圖 4a试浙、b）。 NKT細胞簇的三個亞群被定義為幼稚NKT（NKT幼稚）細胞（CCR7 + SELL +）寞蚌，CD56 + NKT（NKT CD56）細胞和CD160 + NKT（NKT CD160）細胞（圖4a田巴，b）。
為了深入了解 T 細胞亞群的特征挟秤，我們評估了每個集群在四種條件下的分布（圖 4c 和補充圖 4d壹哺，e）。值得注意的是艘刚，與 HD 相比管宵，COVID-19 患者的幼稚狀態(tài) T 細胞亞群的比例，包括 CD4+ 幼稚昔脯、CD4+ 記憶啄糙、CD4+ 效應記憶笛臣、Treg云稚、CD8+ 幼稚和 NKT 幼稚亞群的比例降低（圖 4c 和補充圖. 4d)。即使在 conv 條件下沈堡，CD4+ naive静陈、CD8+ naive 和 Treg 簇的比例也沒有恢復到 HD 的水平（圖 4c 和補充圖 4d）。相反诞丽，在新型冠狀病毒肺炎患者中鲸拥，包括CD4效應子-GNLY、CD8效應子-GNLY僧免、NKT CD56和NKT CD160亞群在內的活性狀態(tài)T細胞亞群的比例增加刑赶，即使在conv患者中，這些細胞毒性亞群的比例也很高 (圖4c)懂衩。特別值得注意的是撞叨，HDs中幾乎不存在CD4效應子亞群金踪，但在中度，重度和conv患者中高度富集牵敷。此外胡岔，與中度患者相比，重癥患者的NKT CD160子集的豐度顯著降低枷餐。
然后我們評估了四種條件下不同效應狀態(tài) T 細胞亞群的細胞毒性和耗竭評分（圖 4d 和補充圖 4f）靶瘸。 CD4+ 效應子-GNLY、CD8+ 效應子-GNLY毛肋、NKT CD56 和 NKT CD160 亞群的細胞毒性評分高于其他亞群怨咪。在這些高細胞毒性簇中，HDs 都具有最低的細胞毒性評分村生，而中等條件顯示出最高的細胞毒性狀態(tài)惊暴，CD4+ 效應子-GNLY 子集除外（圖 4d、e 和補充圖 4f）趁桃。同時辽话，CD4+ 效應子-GZMK、CD8+ 效應子-GZMK 和 NKT CD160 簇顯示出比其他子集更高的衰竭分數(shù)卫病。在這些高度耗竭的亞群中油啤，HD 的耗竭評分最低，而重癥患者表現(xiàn)出最耗竭的狀態(tài)（圖 4d蟀苛、e 和補充圖 4f）益咬，這與之前檢查重癥患者的 CD8+ T 細胞和發(fā)現(xiàn)高度疲憊的狀態(tài)和功能障礙。
為了進一步研究 SARS-CoV-2 感染后 T 細胞的差異轉錄組變化帜平，我們比較了中度或重度和 HD 條件下效應 T 細胞（不包括 CD4+ 初始幽告、CD4+ 記憶、CD8+ 初始和 NKT 初始簇）的表達譜裆甩。我們觀察到在 COVID-19 患者中上調的 DEG 參與了包括 IFN 反應冗锁、細胞因子產(chǎn)生、細胞殺傷嗤栓、白細胞-細胞粘附和細胞骨架組織在內的過程（圖 4f冻河、g 和補充圖 4i）。此外茉帅，使用細胞凋亡和遷移評分系統(tǒng)叨叙，我們觀察到重癥患者中的 T 細胞可能經(jīng)歷了遷移和細胞凋亡（圖 4h，i 和補充圖 4g堪澎，h）擂错。重癥患者 PBMC 中細胞死亡和遷移途徑的顯著激活表明細胞死亡和淋巴細胞遷移可能與淋巴細胞減少有關，這是在重癥 COVID-19 患者中觀察到的常見現(xiàn)象（參考文獻 18,19,24）樱蛤。
a钮呀，55,655 個 T 細胞的 UMAP 投影桃犬。每個點對應一個單元格，根據(jù)單元格類型著色行楞。
b攒暇，小提琴圖顯示了 12 個 T 細胞亞群中典型細胞標記的表達分布。 c子房，各亞群在4個組別的占比情況形用。
d，不同集群和條件下的細胞毒性和耗竭評分的箱線圖证杭。沿 x 軸的正方形表示對應于 a 中的子集的子集田度。
e，點圖顯示了四種條件下 NKT CD160 細胞中明確的細胞毒性和衰竭相關基因的表達水平解愤。
f镇饺，中度（n = 7）或重度（n = 4）患者與 HD（n = 5）相比的 DEG。每個紅點表示單個基因送讲，示例基因標有基因名稱奸笤。
g，DEGs 的基因富集分析用紅色著色哼鬓，如 f 所示监右。GO 術語用紅色標記。
h异希，在 HD (n = 5)健盒、中度 (n = 7)、重度 (n = 4) 和 conv (n = 6) 樣本中的兩個 GO 生物過程項的每個集群的中值細胞分數(shù)的箱形圖称簿。
i扣癣，來自 HD (n = 5)、中度 (n = 7)憨降、重度 (n = 4) 和 conv (n = 6) 樣本的集群中兩個 GO 生物過程術語的表達水平父虑。
a，典型細胞標記被用于通過細胞同一性標記簇券册，如UMAP圖所示频轿。群集根據(jù)表達級別進行著色垂涯，并且圖例以對數(shù)刻度進行標記烁焙。
b，熱圖顯示了每個細胞簇中所選T細胞功能相關基因的z分數(shù)標準化平均表達耕赘。
c骄蝇，小提琴圖顯示了三個效應CD4 T亞群細胞中選定的典型T輔助標記的表達分布。
d操骡，來自HD (n = 5)九火，中度 (n = 7)赚窃，重度 (n = 4) 和Conv (n = 6) 樣本的每種T細胞亞型的平均比例。
e岔激，上圖顯示了PBMC樣品中淋巴細胞的絕對計數(shù)勒极。底部條形圖顯示了單樣本水平的T細胞組成。
f虑鼎，點圖顯示了在圖4d中細胞中某些明確定義的幼稚辱匿，細胞毒性和耗盡的基因在四個條件下的表達。
g炫彩，分別與健康供體比較匾七，中度患者 (上) 和重度患者 (下) T細胞中DEGs的基因富集分析。
h江兢，點圖顯示了與干擾素 α 和 β 反應昨忆，凋亡和遷移過程相關的某些基因在四個條件下的表達。
i杉允，跨HD (n = 5)邑贴，中度 (n = 7)，重度 (n = 4) 和Conv (n = 6) 樣本的每個干擾素 α 和 β 反應相關基因簇的中位細胞得分的盒形圖叔磷。條件以不同的顏色顯示痢缎。
結果5：T 細胞中的克隆擴增和 COVID-19 患者中 V(D)J 基因的首選使用
接下來，為了深入了解個體 T 細胞之間的克隆關系和 V(D)J 基因在四種條件下的使用世澜，我們從 TCR 測序中重建了 TCR 序列独旷。簡而言之，除了三個 NKT 亞群之外寥裂，所有亞群中有超過 70% 的細胞具有匹配的 TCR 信息（圖 5a嵌洼，b）。首先封恰，與HDs相比麻养，新型冠狀病毒肺炎患者和恢復期患者的克隆擴增明顯 (圖5c-e)。中度和conv條件下的克隆擴張程度高于重度條件下的克隆擴張程度诺舔。同時鳖昌，在嚴重狀況下不存在大的克隆擴增 (克隆大小>100) (圖5e)，表明嚴重患者可能缺乏效應T細胞的有效克隆擴增低飒。我們觀察到T細胞亞群之間不同程度的克隆擴增 (圖5c许昨，d)。效應T細胞亞群CD4效應-GNLY褥赊，CD8效應-GZMK和CD8效應-GNLY顯示高比例的克隆細胞 (圖5a糕档，d和補充圖5a)，并包含高比例的簇間克隆細胞 (圖5f)拌喉，提示效應T細胞經(jīng)歷了動態(tài)狀態(tài)轉換 (圖5a速那，f)俐银。
為了研究新型冠狀病毒肺炎和HDs患者中TCR的動態(tài)和基因偏好，我們比較了四種情況下V(D)J基因的使用情況 (圖5g-i和補充圖5b)端仰。前10個互補決定區(qū)3 (CDR3) 序列在四個條件下是不同的 (圖5h)捶惜。中度和conv條件共享一些CDR3序列，因為來自這些條件的四個樣本成對荔烧。與其他三個條件相比售躁，HD條件下的前10個CDR3序列的使用百分比更低且更平衡。值得注意的是茴晋，我們在新型冠狀病毒肺炎患者中發(fā)現(xiàn)了V(D)J基因的不同用法陪捷，其多樣性降低，這在TRA基因中更為明顯 (圖5i)诺擅。與中度和conv患者相比市袖，我們還發(fā)現(xiàn)了嚴重患者中TRAJ39和TRAJ43的過度表現(xiàn) (圖5g)。在重癥患者中優(yōu)選的TRBJ基因是TRBJ1-1的烁涌，而在中度和conv患者中優(yōu)選TRBJ2-1 (圖5i)苍碟。V(D)J基因的選擇性使用表明不同的免疫顯性表位可能驅動T細胞反應的分子組成，并且可能與SARS-CoV2特異性感染有關撮执。
a微峰，源自 PBMC 的 T 細胞的 UMAP。簇由標記有推斷細胞類型（左上）抒钱、TCR 檢測（右上）蜓肆、屬于相同簇（左下）和不同簇（右下）的選定 TCR 克隆的顏色表示。
b谋币，條形圖顯示每個 T 細胞簇中 TCR 檢測的百分比仗扬。
c，T細胞克隆數(shù)與每個克隆型細胞數(shù)之間的關聯(lián)蕾额。虛線將非克隆細胞和克隆細胞分開早芭。黃土擬合被標記為實線，顯示兩個軸之間的負相關诅蝶。
d退个，每個簇中T細胞克隆狀態(tài)的分布。
e调炬，四種條件下 T 細胞的克隆狀態(tài)百分比（左）和不同水平的克隆 T 細胞百分比（右）语盈。
f，每個子集中克隆細胞的比例（x 軸）和具有跨集群共享的 TCR 的細胞百分比（y 軸）之間的比較筐眷。
g黎烈，在四種條件下使用一些 TRAV（左上）习柠、TRAJ（左下）匀谣、TRBV（右上）和 TRBJ（右下）基因照棋。
h，顯示了前十個 CDR3 用法武翎。每個條都按條件標識著色烈炭。共享的 CDR3 序列以紅色字體顯示。
i宝恶，四個條件下的 TRA/B 重排差異符隙。顏色表示特定 V-J 基因對的使用百分比。
a垫毙，餅圖顯示了在HD霹疫，中度，重度和Conv條件下不同簇中克隆擴增細胞的分布综芥。
b丽蝎，在HD，中度膀藐，重度和Conv條件下使用TRAV屠阻，TRAJ，TRBV和TRBJ基因额各。條件以不同的顏色顯示国觉。
結果6：COVID-19患者B細胞亞群的特征
為了追蹤不同B亞型的動態(tài)變化，我們根據(jù)典型B細胞標記物的表達和分布將B細胞亞群分成六個亞群（圖6a虾啦、B和補充圖6a）麻诀。我們確定了一個原始B亞群（MS4A1+IGHD+）、一個記憶B亞群（MS4A1+CD27+）傲醉，一個中間過渡記憶B亞群（“中間記憶B”针饥；IGHD+CD27+）和一個生發(fā)中心B亞群（“MS4A1+NEIL1+）和兩個血漿亞群，血漿B（MZB1+CD38+）和分裂血漿B（MZB1+CD38+MKI67+）需频。
值得注意的是丁眼，與HDs患者相比，新冠肺炎患者的活性狀態(tài)B亞群（包括生發(fā)中心B昭殉、血漿B和分裂血漿B亞群）的比例增加苞七。相反，與HDs患者相比挪丢，新冠肺炎患者的記憶B細胞比例下降（圖6c-e）蹂风。
為了進一步研究 SARS-CoV-2 感染后 B 細胞的差異轉錄組變化，我們比較了中度或重度疾病 B/漿細胞與 HD 疾病的表達譜乾蓬。在 COVID-19 患者中最顯著富集的 DEG 參與了與 IFN 反應相關的基因（圖 6f惠啄、g 和補充圖 6c）。此外，重癥患者的 DEG 與蛋白質合成撵渡、成熟和運輸相關的生物過程相關（補充圖 6b）融柬。這些結果揭示了 COVID-19 患者 B 細胞亞群的轉錄組學特征。
a趋距，11,377 個 B 細胞的 UMAP 投影粒氧。每個點對應一個單元格，根據(jù)單元格類型著色节腐。
b外盯，典型細胞標記用于按細胞身份標記簇，如 UMAP 圖所示翼雀。數(shù)據(jù)根據(jù)表達水平著色饱苟，圖例以對數(shù)刻度標記。
c狼渊，源自 HD (n = 5)掷空、中度 (n = 7)、重度 (n = 4) 和 conv (n = 6) 樣本的每種 B 細胞亞型的平均比例囤锉。
d坦弟，條形圖顯示單個樣本水平的 B 細胞組成祈惶。
e胸私，每個集群的條件偏好。 y 軸顯示四種條件下的平均樣本百分比踪区。條件以不同的顏色顯示驱入。每個條形圖代表一個細胞簇赤炒。
f，散點圖顯示中度（n = 7）或重度（n = 4）患者與 HD（n = 5）患者的 DEG亏较。每個紅點表示一個單獨的基因莺褒，示例基因標有基因名稱。
g雪情，DEGs 的基因富集分析用紅色著色遵岩，如 f 所示。 GO 術語標有名稱和 ID巡通，并按 -log10 (P) 值排序尘执。顏色越深表示 P 值越小。顯示了前 20 個豐富的 GO 術語宴凉。值得注意的術語用紅色標記誊锭。
a弥锄，小提琴圖顯示了六個b細胞簇中選定的典型細胞標記的表達分布丧靡。列對應于所選擇的標記蟆沫，并且行對應于圖6a中具有相同顏色的簇。
b温治，分別與HDs比較饭庞，中度患者 (上) 和重度患者 (下) b細胞中DEGs的基因富集分析。GO術語標有名稱和ID罐盔，并按-log10 (P) 值排序但绕。c救崔，橫穿HD (n = 5)惶看，中度 (n = 7)，重度 (n = 4) 和Conv (n = 6) 樣本的每個干擾素 α 和 β 反應相關基因簇的中位細胞得分的盒圖六孵。條件以不同的顏色顯示纬黎。
d，b細胞克隆數(shù)與每個克隆型細胞數(shù)之間的關聯(lián)劫窒。虛線將非克隆細胞和克隆細胞分開本今。黃土擬合被標記為實線，顯示兩個軸之間的負相關主巍。
e冠息，IGHV/J，IGKV/J和IGLV/J基因在四個條件下的使用孕索。條件以不同的顏色顯示逛艰。
結果7：重癥患者的 B 細胞擴增和 V(D)J 基因的特異性重排
我們還從 BCR 測序重建了 BCR 序列（補充表 3）并分析了 BCR 克隆擴增的狀態(tài)。簡而言之搞旭，每個簇中 BCR 的檢測百分比超過 75%（圖 7a散怖，b）。我們發(fā)現(xiàn)來自重癥患者的 B 細胞比其他三種情況表現(xiàn)出明顯的克隆擴增（圖 7c 和補充圖 6d）肄渗，表明 B 細胞活性和體液免疫反應在重癥患者中被強烈激活镇眷，這讓人想起之前的觀察結果：較高的抗體滴度與較差的臨床結果相關。這引起了人們的關注翎嫡，即針對病原體的抗體可以促進疾病病理欠动，導致類似于在 SARS 中觀察到的抗體依賴性增強。
接下來惑申，我們分別評估了中度翁垂、重度和 conv 條件下每位患者的 IgA、IgD硝桩、IgG 和 IgM（未檢測到 IgE）的分布沿猜。在大多數(shù)患者中，IgM 是主要的免疫球蛋白（圖 7d碗脊，e）啼肩。與 HD 相比橄妆，COVID-19 患者的 IgG 豐度增加，而 IgM 減少祈坠。在恢復期患者中害碾，IgG 和 IgM 水平恢復到與 HD 相似的水平。
為了研究 BCR 的偏向 V(D)J 重排赦拘，我們比較了四種條件下 V(D)J 基因的使用（圖 7f慌随，g 和補充圖 6e）。與其他三種情況相比躺同，我們發(fā)現(xiàn)在嚴重情況下更具體的 V(D)J 使用阁猜，表明 B 細胞可能在嚴重患者中經(jīng)歷了獨特和特異性的 V(D)J 重排（圖 7g）。我們還發(fā)現(xiàn) IGHJ4 在所有 HD 和患者中的綜合使用（圖 7f）蹋艺，但與其他三種情況的患者相比剃袍，重癥患者的 IGHJ4 的配對 IGHV 基因不同（圖 7g）。我們觀察到重癥患者中 IGHV3-7 的過度表達（圖 7f）捎谨。此外民效，嚴重患者的前兩對 V-J 頻率是 IGHV3-7/IGHJ4 和 IGKV3-15/IGKJ3（圖 7g）。綜上所述涛救，重癥患者 B 細胞克隆性的增加和 IGHV 和 IGKJ 基因的傾斜使用表明 SARS-CoV-2 感染與宿主 B 細胞中的 V(D)J 重排有關畏邢。值得注意的是，在重癥患者中選擇性使用優(yōu)勢 IGV 基因检吆，尤其是 IGHV3-7 和 IGKV3-15舒萎，可能有助于疫苗的設計。
a咧栗，源自 PBMC 的 B 細胞的 UMAP逆甜。簇用顏色表示并用推斷的細胞類型標記（左）。 B 細胞的 UMAP 也根據(jù) BCR 檢測著色（右）致板。 b交煞，條形圖顯示每個 B 細胞簇中 BCR 檢測的百分比。
c斟或，條形圖顯示每個簇中 B 細胞的克隆狀態(tài)分布素征。
d，條形圖顯示每種條件下 IGHA萝挤、IGHD御毅、IGHG 和 IGHM 的百分比，
e怜珍，條形圖顯示了單個樣本水平上 IGHA端蛆、IGHD、IGHG 和 IGHM 的百分比酥泛。
f今豆，一些 IGHV（左上）嫌拣、IGHJ（右上）、IGKV（左中）呆躲、IGKJ（右中）异逐、IGLV（左下）和 IGLJ（右下）基因在 HD、中度插掂、重度和 conv 中的使用條件灰瞻。條件以不同的顏色顯示。
g辅甥，熱圖顯示了 HD酝润、中度、重度和 conv 條件下的 IGH/K/L 重排差異肆氓。顏色表示特定 V-J 基因對的使用百分比袍祖。
Discussion
COVID-19 通常被認為是一種急性自限性病毒性疾病底瓣，盡管尚不清楚 SARS-CoV-2 感染是否會導致無癥狀攜帶者的慢性疾病谢揪。宿主對急性 SARS-CoV-2 感染的免疫反應不僅起到抗病毒作用，還會導致器官和組織同時發(fā)生致病性損傷捐凭，尤其是 COVID-19 患者的肺部拨扶，這決定了疾病的嚴重程度、進展和結果.研究報告了先天性和適應性免疫反應的特征茁肠，這有助于我們了解 SARS-CoV-2 感染的潛在發(fā)病機制患民。然而，很難獲得 SARS-CoV-2 感染后細胞和分子免疫反應的綜合情景垦梆。為了解決這個問題匹颤，我們以單細胞分辨率分析了新冠肺炎患者的免疫反應情況，這說明了疾病進展過程中細胞反應的動態(tài)性質托猩，并揭示了中重度患者抗病毒免疫和發(fā)病機制的關鍵因素印蓖。
我們的研究為新型冠狀病毒肺炎患者的免疫標志提供了公正的可視化。首先新型冠狀病毒肺炎患者表現(xiàn)出一致且強烈的IFN-α 反應京腥，整體急性炎癥反應和增強的遷移能力赦肃，在pbmc中大多數(shù)主要細胞類型的嚴重疾病患者中達到頂峰。其次公浪，新型冠狀病毒肺炎患者中觀察到廣泛的免疫激活他宛，其證據(jù)是活化的T，pro T和血漿b細胞的比例增加欠气，而幼稚的T和mono DC的比例減少厅各。第三，活躍狀態(tài)T細胞簇的比例在COVID-19患者中顯著更高预柒，效應T細胞亞群優(yōu)先富集队塘，如中等患者中的CD4效應-GNLY琐鲁、CD8效應-GNLY和NKT CD160細胞，重癥患者中的NKT CD56亞群人灼。T細胞在中度患者中顯示出更高的細胞毒性和更強大的擴增围段，而在重度患者中觀察到更高的衰竭水平和更低的特異性克隆擴增。第四投放，b細胞在重癥患者中經(jīng)歷了獨特且特定的V(D)J重排奈泪，這表現(xiàn)為b細胞克隆性的增加以及IGHV和IGKJ基因的使用偏斜。最后灸芳，盡管大多數(shù)臨床參數(shù)在康復初期恢復到正常范圍涝桅，但免疫系統(tǒng)的狀態(tài)并未完全恢復，例如幼稚T和Treg亞群的比率烙样。需要進行長期隨訪研究冯遂，以調查COVID-19患者實現(xiàn)完全免疫恢復需要多長時間。
中度患者的有效抗病毒免疫反應的特征是先天免疫信號的中度和廣泛激活以及高度細胞毒性效應T細胞亞群的擴增谒获。擴展的效應T簇蛤肌，包括CD4效應子-GNLY，CD8效應子-GNLY批狱，NKT CD56和NKT CD160裸准，具有NKG7，GZMA赔硫，GZMB炒俱，GZMH和GNLY的高表達特征，并可能通過其直接細胞毒性促進SARS-CoV-2感染的快速解決爪膊。CD4效應子-GNLY簇類似于經(jīng)典的CD4細胞毒性T細胞权悟。CD4細胞毒性T細胞具有主要的組織相容性復合體II類限制的細胞毒性活性，在病毒感染推盛，自身免疫病和惡性腫瘤中起重要作用峦阁。此外，識別可能預測或預防嚴重疾病進展的免疫因素非常有意義小槐。值得注意的是拇派，在重度患者中，NKT CD160簇在中度患者中的擴展幾乎沒有凿跳。NKT CD160簇是指先前描述的 γ δ NKT或vδ1t細胞亞群件豌，其顯示出與傳統(tǒng)NK細胞的表型和功能相似性。此外控嗜，F(xiàn)CGR3A也是NKT CD160簇中富集的基因之一茧彤，表明它可能介導抗體依賴性細胞介導的細胞毒性。此外疆栏，vδ1t細胞與對病毒感染的免疫反應有關曾掂，特別是對巨細胞病毒惫谤，Epstein-Barr病毒和vδ1t細胞也可以識別廣泛的癌細胞。新型冠狀病毒肺炎一樣珠洗，NKT CD160細胞的優(yōu)先擴增可能通過直接的細胞毒性以及介導抗體依賴性細胞介導的細胞毒性作用來促進疾病的快速控制溜歪。型冠狀病毒肺炎中NKT CD160細胞擴增和功能的潛在機制值得進一步研究。研究vδ1t細胞是否可用于過繼細胞療法以抑制明顯的COVID-19相關組織和器官損傷將是有價值的许蓖。
嚴重患者疾病惡化的免疫病理特征是IFN反應紊亂蝴猪，嚴重的免疫衰竭，TCR譜傾斜和T細胞廣泛擴增膊爪。值得注意的是自阱，先前傳染性非典型肺炎-CoV的研究表明，該病毒可以利用多種機制來拮抗宿主細胞12中的IFN反應米酬。根據(jù)體外細胞感染的結果沛豌，SARS-CoV-2被認為是I型 IFNs的弱誘導劑。然而赃额，我們觀察到加派，與中度患者相比，重癥患者PBMC中幾乎所有類型的細胞都有強烈的IFN-α反應爬早『哒桑考慮到病毒負擔在發(fā)病后不久即達到峰值启妹，然后逐漸降低筛严，似乎重癥患者的系統(tǒng)性IFN-α 信號激活可能是由除單獨病毒以外的其他因素引起的。IFN通路的過度激活可能導致嚴重新型冠狀病毒肺炎患者的免疫功能障礙和免疫損傷饶米。特別是桨啃，IFN-α2b霧化在SARS-CoV-2感染中得到廣泛應用，它是從治療中東呼吸綜合征和SARS42發(fā)展而來的檬输。使用IFN進行治療可能需要仔細的重新考慮和復查照瘾，尤其是在嚴重新型冠狀病毒肺炎病例中。
這項研究有幾個局限性丧慈。例如析命，當我們進行這項研究時，由于生物安全原因逃默，在COVID-19爆發(fā)期間很難在支氣管肺泡灌洗液中獲得免疫細胞鹃愤。此外，樣本量相對較小完域。因此软吐，未來對更多COVID-19患者的縱向樣本的研究可能有助于確定不同細胞類型的免疫特性與疾病結局之間的因果關系。
綜上所述吟税，我們研究中的這種整合的多細胞描述為將來表征對SARS-CoV-2感染的復雜的動態(tài)免疫反應奠定了基礎凹耙。轉錄組數(shù)據(jù)姿现，加上詳細的基于TCR和BCR的譜系信息，可以作為更深入了解新型冠狀病毒肺炎患者外周血淋巴細胞的豐富資源肖抱，并為合理設計療法和開發(fā)SARS-CoV-2特異性疫苗鋪平道路备典。
