題目：Immune cell profiling of COVID-19 patients in the recovery stage by single-cell sequencing
發(fā)表期刊：Cell Discovery(IF:10.8)
發(fā)表年份：2021-05-04
摘要
背景：COVID-2019冠狀病毒的關(guān)鍵免疫細(xì)胞亞群變化及其狀態(tài)尚不清楚。
方法：在COVID-19患者早期恢復(fù)期階段(early recovery stage (ERS))批狱，采用單細(xì)胞組學(xué)技術(shù)，對(duì)病人的外周血單個(gè)核細(xì)胞 (peripheral blood mononuclear cells) 進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序并分析。
結(jié)果：COVID-19患者ERS階段，T細(xì)胞明顯減少觅够，而單核細(xì)胞增多澄港。具體來(lái)說(shuō)，在ERS階段视搏，炎癥相關(guān)基因表達(dá)的經(jīng)典CD14++單核細(xì)胞比例增加，CD14+IL1β+單核細(xì)胞的比例也是如此县袱。而CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞顯著減少浑娜，并且其炎癥相關(guān)基因表達(dá)量較高。在B細(xì)胞中式散，漿細(xì)胞顯著增加筋遭，而naive B細(xì)胞減少。
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及質(zhì)控
樣本來(lái)源：15個(gè)樣本暴拄，包括5個(gè)早期恢復(fù)階段(ERS, early recovery stage)的COVID-19病人漓滔，5個(gè)晚期恢復(fù)階段(LRS, late recovery stage)的COVID-19病人和5個(gè)健康對(duì)照組(HC, healthy control)的外周血標(biāo)本。
那么是如何定義ERS和LRS的呢乖篷？在mehods有提到响驴，ERS組病人定義為檢出該病人第1次核酸陽(yáng)性后，其后續(xù)轉(zhuǎn)陰時(shí)間少于7天撕蔼。LRS定義為定義為該病人第1次核酸陽(yáng)性后豁鲤，其后續(xù)轉(zhuǎn)陰時(shí)間超過(guò)14天秽誊。
標(biāo)本處理：15個(gè)外周血標(biāo)本，經(jīng)過(guò)密度離心后琳骡，提取單個(gè)核細(xì)胞锅论。每個(gè)樣本的細(xì)胞存活率都大于80%。
細(xì)胞過(guò)濾標(biāo)準(zhǔn)： gene number between 200 and 7000楣号。過(guò)濾后最易，剩下128096個(gè)細(xì)胞(13092/10035/13624/8329/12158 cells for HCs; 5163/7685/7171/10058/6581 cells for ERS; 3242/7895/7487/7164/8412 cells for LRS) 進(jìn)入下游分析。
結(jié)果
1.總體免疫細(xì)胞表達(dá)譜
先聚類(lèi)注釋?zhuān)鶕?jù)經(jīng)典marker, 初分為髓系細(xì)胞炫狱、B細(xì)胞耘纱，NK細(xì)胞和T細(xì)胞，3種大類(lèi)細(xì)胞(Figure 1c-d)毕荐。
2.COV2019患者血液中NK和T細(xì)胞束析、B細(xì)胞、髓系細(xì)胞表達(dá)譜
接著分析128096個(gè)細(xì)胞憎亚，包括15個(gè)樣本的36442個(gè)髓系細(xì)胞员寇、64247個(gè)NK和T細(xì)胞，以及10177個(gè)B細(xì)胞(Figure 2a)第美。
3.恢復(fù)期COVID-19患者的髓系細(xì)胞亞群及其狀態(tài)變化
將髓系細(xì)胞分為6群：Classical CD14++ monocytes (M1), non-classical CD16++ (FCGR3A) CD14?/+ monocytes (M2), intermediate CD14++ CD16+ monocytes (M3), CD1C+ cDC2 (M4), CLEC9A+ cDC1 (M5), and pDC (CLEC4C+CD123+) (M6) (Figure 3a-b)。
COVID-19患者的CD14+單核細(xì)胞，上調(diào)的基因主要富集在細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)和炎癥激活相關(guān)的通路赃蛛，這些通路主要參與基因是IFITM3恃锉，IFI6，IL1β呕臂、JUN淡喜、FOS、JUNB和KLF6(Figure 3g)诵闭×锻牛總的來(lái)說(shuō)，這些發(fā)現(xiàn)表明ERS患者單核細(xì)胞群的平衡失調(diào)表現(xiàn)為Classical CD14++ monocytes (M1)顯著增加疏尿。在SARS-CoV-2感染期間瘟芝，Classical CD14++ monocytes (M1)在外周循環(huán)中增加，從而加劇炎癥褥琐。
4.COVID-19患者外周血T細(xì)胞和NK細(xì)胞的特征
T and NK lymphocytes可被分為10個(gè)亞群(Figure 4a-b)锌俱。
COVID-19患者的CD4+T細(xì)胞中，上調(diào)基因富集通路中材蛛，含有較多細(xì)胞因子途徑和炎癥激活相關(guān)的基因史飞，包括IFITM3和IFI6、IL1B仰税、JUN构资、FOS、JUNB和KLF6(Figure 4f)陨簇。
接著做了TCR-seq 分析吐绵。TCR-seq分析顯示，ERS組的T細(xì)胞擴(kuò)增水平明顯低于HC組(Figure 4g).此外河绽，na?ve or central memory T細(xì)胞幾乎沒(méi)有克隆性擴(kuò)增己单，而effector memory T cells, terminal effector CD8+ T cells (CTLs), and proliferating T cells的擴(kuò)增水平更高。此外耙饰，與HCs相比纹笼，擴(kuò)增克隆的CD8+CTL也表現(xiàn)出過(guò)度激活的炎癥和抗病毒活性(Figure 4h-i)。
5.COVID-19患者外周血B細(xì)胞的特征
B細(xì)胞可分為4群苟跪，na?ve B cells廷痘，memory B cells， immature B cells 和 plasma cells(Figure 5a-b)件已。
最后做了個(gè)BCR杆故，發(fā)現(xiàn)memory B cells幾乎沒(méi)有克隆擴(kuò)增，而CD27+CD38+ memory B cells在不同的B細(xì)胞亞群中表現(xiàn)出最高的擴(kuò)增水平(Figure 6a).與HCs比溉愁，Covid-19患者的細(xì)胞克隆擴(kuò)增較多处铛，提示SARS COV-2感染下B細(xì)胞經(jīng)歷獨(dú)特的VDJ重排。與LRS患者相比拐揭，ERS患者的B細(xì)胞克隆擴(kuò)增較高(Figure 6b)撤蟆。此外，對(duì)每個(gè)個(gè)體來(lái)說(shuō)堂污，ERS組中最大克隆的比率高于HCs組(Figure 6c)家肯。
Covid-19患者免疫細(xì)胞的細(xì)胞通訊
B細(xì)胞-單核細(xì)胞和B細(xì)胞-T細(xì)胞的相互作用提示B細(xì)胞可以分泌大量IL-6、LTA和LTB彻磁，它們與單核細(xì)胞中表達(dá)的IL-6R碍沐、LTAR和LTBR結(jié)合，并將大量IL-6作用于T細(xì)胞衷蜓，并促進(jìn)IFN-γ累提、IL-1β和其他炎性細(xì)胞因子和趨化因子的分泌。因此磁浇，ERS組患者中斋陪，高表達(dá)IL-6的炎性單核細(xì)胞及其子代形成級(jí)聯(lián)信號(hào)(Figure 7c)。在LRS中置吓，DC產(chǎn)生IL-18无虚、TNFSF13和TNFSF13B，以促進(jìn)B細(xì)胞的增殖衍锚，向血液中分泌許多抗體友题。從DC-T和T細(xì)胞-B細(xì)胞的相互作用中，發(fā)現(xiàn)DC不僅產(chǎn)生IL-18戴质，還產(chǎn)生IL-7以促進(jìn)T細(xì)胞的增殖度宦；此外，T細(xì)胞產(chǎn)生IL-2以促進(jìn)B細(xì)胞的增殖和抗體產(chǎn)生(Figure 7d)置森。
討論
關(guān)于討論比較長(zhǎng)斗埂，我挑了一些簡(jiǎn)單的講。
1.文中發(fā)現(xiàn)ERS患者中出現(xiàn)了炎癥反應(yīng)凫海，這也許可以解釋為什么一些患者在出院后生病呛凶，并建議應(yīng)該重新評(píng)估目前的出院標(biāo)準(zhǔn)。
2.文中發(fā)現(xiàn)幾個(gè)COVID-19感染特有的位點(diǎn)行贪，配對(duì)頻率最高的是IGHV3-23-IGHJ4漾稀，這尚未被報(bào)道過(guò)。目前已有多個(gè)類(lèi)似的位點(diǎn)與病毒相關(guān)建瘫，例如IGHV3-30 和 IGKV3-11可參與編碼一抗中和人巨細(xì)胞病毒崭捍。IGHV3-30和IGHV3-21已被用于分離流感病毒抗體，并用于生產(chǎn)病毒疫苗啰脚。此外瞧壮，結(jié)合 IGHV3-15/IGLV1-40 片段的抗體對(duì)埃博拉病毒具有很好的中和活性。
結(jié)論
總之浙炼，該研究提供了第一份COVID2019患者康復(fù)出院后出現(xiàn)適應(yīng)性免疫失調(diào)現(xiàn)象的免疫細(xì)胞圖譜，對(duì)較大隊(duì)列中康復(fù)患者的縱向研究可能有助于了解疾病的后果亮航。本研究下確定的新BCR可能會(huì)促進(jìn)我們對(duì)B細(xì)胞機(jī)制的理解，并在COVID-19免疫療法中具有潛在的臨床應(yīng)用匀们。
