常規(guī)電鏡樣品制備包括常溫化學(xué)雙固定侮繁、常溫脫水包埋、常規(guī)超薄切片赖条、普通電鏡觀察幾個步驟失乾。樣品制備過程歷時約一周，超薄切片經(jīng)醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色后纬乍，電鏡觀察仗扬。所有操作均按照以下流程進行。

試劑
0.2 mol/ L磷酸鹽緩沖液
Na2HPO4·2H2O 35.61 g 或Na2HPO4·7H2O 53.65 g / Na2HPO4·12H2O 71.64 g
NaH2PO2·H2O 27.60 g 或NaH2PO4·2H2O 31.21 g
加雙蒸水（ddH2O）到1000 mL
0.1 mol/ L磷酸鹽緩沖液（PBS）
0.2 mol/ L磷酸鹽緩沖液 250 mL
加雙蒸水到500 mL
2 % 低溫瓊脂
低溫瓊脂 1.0 g
加雙蒸水到 50 mL
加熱到沸騰蕾额，溶液均勻后備用
1 % 戊二醛固定液
25 %（m/v）戊二醛水溶液 2 mL
0.2 mol/ L磷酸鹽緩沖液 25 mL
加雙蒸水到50 mL
1 % 鋨酸固定液
2 %（m/v）鋨酸水溶液 10 mL
0.2 mol/ L磷酸鹽緩沖液 10 mL
包埋劑A液
Epon 812 樹脂 50 mL
十二烷基琥珀酸酐（modecenyl succinic anhydride, DDSA） 80 mL
包埋劑B液
Epon 812 樹脂 50 mL
六甲酸酐（methyl nadic anhydride, MNA） 44.5 mL
2早芭，4，6 - 三甲氨基甲基苯酚（2, 4, 6 - tridimethylamino methyl phenol, DMP-30）
甲苯胺藍染液
甲苯胺藍 1 g
1 mol/ L NaOH 10 mL
加雙蒸水到50 mL
混勻過濾后使用
1 % 醋酸雙氧鈾染液
醋酸雙氧鈾 0.2 g
加雙蒸水到10 mL
封口膜封口诅蝶，4℃避光保存
1 % 檸檬酸鉛染液
硝酸鉛 0.265 g
檸檬酸鈉（含2分子結(jié)晶水） 0.352 g
加雙蒸水到10 mL①
① 配制鉛染液時退个，要先加水6 mL，超聲震蕩30 min调炬，使乳白色檸檬酸鉛懸液充分混勻语盈。然后滴加1 mol/L NaOH，并不是晃動缰泡，直至溶液變清亮刀荒。最后定容至10 mL。
② 細胞樣品處理和藻類及其他游離樣品處理流程可相互參照棘钞，即細胞樣品可以酌情使用瓊脂鑄模法取材固定缠借，藻類及其他游離樣品也可以使用血清預(yù)包埋法取材固定，總體視樣品密度及其對于溫度的耐受等條件而定宜猜。
封口膜封口泼返，4℃保存

儀器
修塊機 Leica EM TRIM
切片機 Leica EM UC6
光學(xué)顯微鏡 Nikon 80i 及配套拍照系統(tǒng)DS-L1
透射電子顯微鏡 JEOL-1230
Gatan Bioscan Camera 792

實驗流程
一、 取材與固定
A. 植物樣品

1. 自來水沖洗表面泥塵后姨拥，使用滅菌水清洗2-3次绅喉，置于鋪有預(yù)濕濾紙的培養(yǎng)皿中。
2. 使用干凈鋒利的刀片切取目標(biāo)材料叫乌，所取材料體積不大于3 mm3柴罐。
   切取樣品時應(yīng)注意動作迅速、減小損傷憨奸，避免來回切拉革屠；使用的滅菌水及器具應(yīng)4℃預(yù)冷，并在操作中盡量保持低溫以降低組織細胞活性。
3. 將切下材料放入裝有預(yù)冷的戊二醛固定液的青霉素小瓶中后抽氣屠阻，抽幾次后輕搖小瓶红省，并打開瓶蓋。重復(fù)2-3次国觉，直到樣品沉入瓶底吧恃。
4. 室溫靜置1h，或搖床輕搖1h麻诀。
5. PBS清洗3次痕寓，10min/次。
6. 1%鋨酸固定液固定1h蝇闭。
7. PBS清洗3次呻率，10min/次。

B. 動物樣品

1. 4℃預(yù)冷生理鹽水沖洗組織塊呻引，迅速切取組織塊礼仗，體積不大于3 mm3
2. 將切取的組織塊投入裝有預(yù)冷戊二醛固定液的青霉素小瓶中，并抽氣直至樣品沉底逻悠。
3. 室溫靜置1h元践，或搖床輕搖1h。
4. PBS清洗3次童谒，10 min/次单旁。
5. 1%鋨酸固定液固定1 h。
6. PBS清洗3次饥伊，10 min/次象浑。

C. 單層培養(yǎng)細胞或懸浮培養(yǎng)細胞樣品②

1. 3000 rpm離心5 min，收集細胞樣品琅豆，盡量多的吸棄培養(yǎng)液上清愉豺。
2. 加入4℃預(yù)冷PBS液，充分吹吸混勻趋距，靜置4 min粒氧，3000 rpm離心5 min，吸棄上清节腐。
   ① 配制鉛染液時，要先加水6 mL摘盆，超聲震蕩30 min翼雀，使乳白色檸檬酸鉛懸液充分混勻。然后滴加1 mol/L NaOH孩擂，并不是晃動狼渊，直至溶液變清亮。最后定容至10 mL。
   ② 細胞樣品處理和藻類及其他游離樣品處理流程可相互參照狈邑，即細胞樣品可以酌情使用瓊脂鑄模法取材固定城须，藻類及其他游離樣品也可以使用血清預(yù)包埋法取材固定，總體視樣品密度及其對于溫度的耐受等條件而定米苹。
3. 重復(fù)步驟2一次糕伐。
4. 加入預(yù)冷的血清或蛋清，充分吹吸混勻蘸嘶，3000 rpm離心10 min良瞧，吸棄大部分上清，留少部分训唱，吹吸懸浮沉淀細胞褥蚯。（或離心后吸棄上清，留少部分上清况增，不懸浮沉淀細胞赞庶，視樣品濃度而定）
5. 緩慢加入戊二醛固定液，小心放入4℃冰箱澳骤，固定過夜尘执。
6. 吸棄上清，刀片小心劃開離心管壁宴凉，用鉗子拉開離心管誊锭，小心取出已凝成固體的血清包埋塊。
7. 使用干凈的單面刀片或手術(shù)刀弥锄，將血清包埋塊切成2 mm3左右的小塊丧靡，取3-5個富集細胞樣品效果較好的包埋小塊繼續(xù)下面實驗。
8. PBS清洗3次籽暇，10 min/次温治。
9. 1%鋨酸固定液固定1 h缭召。
10. PBS清洗3次扛门，10 min/次。

D. 藻類及其他游離培養(yǎng)樣品

1. 吸取2%低溫瓊脂液200μL到0.2mL離心管兔甘，并將離線管置于冰上绸狐，取10μL槍頭迅速插入瓊脂中并保持離心管豎直卤恳，且槍頭豎直靠中的包裹在瓊脂中。
2. 靜置1 min寒矿，待瓊脂凝固后突琳，小心拔出槍頭，形成瓊脂空腔符相，待用拆融。
3. 3000 rpm離心5 min，收集樣品，盡量多的吸棄培養(yǎng)液上清镜豹。
4. 加入4℃預(yù)冷PBS液傲须，充分吹吸混勻，靜置4min趟脂，3000 rpm離心5min泰讽，吸棄上清。
5. 重復(fù)步驟2清洗散怖，吸棄大部分上清菇绵，留極少部分上清液，吹吸懸浮樣品镇眷。
6. 使用10μL 移液器小心將樣品加入已經(jīng)制備好的瓊脂空腔中咬最，使樣品充滿空腔大部分，添加過程中盡量避免氣泡出現(xiàn)欠动。
7. 吸取50μL溶化的瓊脂永乌，快速滴加到空腔瓊脂上封口，冰浴5 min具伍，待瓊脂完全凝固翅雏。
8. 使用單面刀片小心劃開離心管壁，用鉗子拉開離心管人芽，小心取出已凝成固體的瓊脂包埋塊望几，稍作修葺。
9. PBS清洗3次萤厅，10 min/次橄抹。
10. 1%鋨酸固定液固定1 h。
11. PBS清洗3次惕味，10 min/次楼誓。

二、 脫水

1. 按丙酮與滅菌水體積比3：7配制30%脫水劑名挥。吸棄樣品管/瓶中的PBS疟羹，快速加入現(xiàn)配的脫水劑（脫水換液過程禁止出現(xiàn)樣品暴露空氣中現(xiàn)象，可不全部吸完禀倔，略有剩余榄融，使樣品浸潤；動作應(yīng)迅速準(zhǔn)確）蹋艺，室溫放置或搖床輕搖45 min剃袍。加入按30%、50%捎谨、70%、90%、100%（v/v）的濃度梯度進行脫水涛救。
2. 配制50%脫水劑畏邢，快速換液，室溫輕搖45 min检吆。
3. 配制70%脫水劑舒萎，快速換液，室溫輕搖45 min蹭沛。
4. 配制90%脫水劑臂寝，快速換液，室溫輕搖45 min摊灭。
5. 使用純丙酮快速換液咆贬，室溫輕搖30 min③。
6. 重復(fù)步驟5一次帚呼。

三掏缎、 滲透包埋
在此步脫水操作完成后即可開始配制滲透用包埋劑，以免安排不周煤杀。樣品浸泡在純丙酮中時間不宜過久眷蜈，以免造成樣品較脆，不利于超薄切片沈自。

1. 配制滲透用樹脂包埋劑

1. 取干凈的10 mL注射器酌儒，拔去活塞，用封閉針頭堵住注射口枯途，放于通風(fēng)櫥中忌怎。
2. 小心傾倒B液9 mL到注射器中；然后再小心傾倒A液1 mL柔袁。
3. 插入活塞呆躲，堵住注射器后，顛倒搖勻至液體顏色均勻捶索，無絲狀液體插掂。
4. 小心拔去活塞，通風(fēng)櫥中操作腥例，緩慢滴加14滴DMP-30辅甥。
5. 插入活塞，堵住注射器后燎竖，顛倒搖勻至液體顏色完全均勻璃弄，無絲絮狀分色，豎直放置待用构回。

2. 按照包埋劑與丙酮體積比3：7配制30%滲透劑夏块，快速吸棄樣品管中純丙酮并加入滲透劑疏咐，輕搖滲透3 h。
3. 按照包埋劑與丙酮體積比7：3配制70%滲透劑脐供，快速換液浑塞，輕搖滲透過夜。
4. 重新配制包埋劑政己，并小心推按注射器酌壕，將包埋劑擠到包埋模具中至液面略凸。
5. 解剖針挑取樣品到純包埋劑中歇由，滲透3 h卵牍。
6. 小心挑取樣品，濾紙上稍微沾下吸棄部分粘附的包埋劑沦泌，輕輕放置到未滲透過樣品的包埋孔中糊昙，小心將樣品按到底，擺放好位置赦肃。記錄各樣品對應(yīng)包埋塊編號溅蛉。
7. 梯度溫度聚合包埋

1. 37℃烘箱中12 h，期間定時觀察樣品有無漂移現(xiàn)象他宛，如有船侧，則再次小心擺放樣品位置。
2. 45℃烘箱中12 h厅各。
3. 60℃烘箱中24 h镜撩。

四、 修塊與切片

1. 拿到包埋塊后檢查樣品位置是否得當(dāng)队塘，選取位置好的包埋塊優(yōu)先進行修塊袁梗、切片。
2. 粗修包埋塊

1. 使用六角扳手將包埋塊固定在樣品頭上憔古，露出長度合適遮怜。
2. 將樣品頭固定在修塊機上，體視鏡觀察修塊鸿市，分四個方向?qū)駢K頭部多余的包埋劑修去锯梁，暴露出組織塊。
3. 使用鋒利的單面刀片修去組織塊周圍毛刺的包埋劑焰情，使其四邊光滑清晰陌凳。
4. 卸下樣品頭裝至切片機上，使用玻璃刀修片内舟，直至樣品表面光滑清晰合敦。

3. 半薄切片

1. 將粘有水槽的玻璃刀裝至切片機刀臺上，體視鏡下小心對刀验游，不時轉(zhuǎn)動手輪充岛，使樣品上下移動保檐，調(diào)整刀臺左右角度及樣品上下角度，直至包埋塊整個表面與刀刃的距離相等裸准。
2. 轉(zhuǎn)動手輪展东，使整個樣品高于刀刃赔硫，點控制面板Start炒俱，設(shè)置切片區(qū)域上邊界；轉(zhuǎn)動手輪爪膊，使整個樣品低于刀刃权悟，點控制面板End，設(shè)置切片區(qū)域下邊界推盛。
3. 手動步進刀臺靠近樣品峦阁，至出現(xiàn)彩色干涉光，繼續(xù)步進刀臺耘成，并通過體視鏡觀察干涉光譜變化榔昔，直至干涉光消失。
4. 轉(zhuǎn)動手輪瘪菌，使樣品離開刀刃區(qū)域撒会，使用滴管將干凈的去離子水加到玻璃刀水槽中，體視鏡觀察直至液面略低于刀刃师妙。
5. 調(diào)整切片厚度與速度诵肛，按控制面板Run/Stop鍵，開始切片默穴。體視鏡觀察可見900nm厚度切片反光為亮綠色怔檩。
6. 待有切片下來形成4-6片的切片帶，按Run/Stop鍵停止切片蓄诽，體視鏡觀察下薛训，使用睫毛筆將所需薄片撥離刀刃，并將所需切片聚攏一起仑氛。
7. 用干凈撈片環(huán)輕輕沾取切片所在區(qū)域乙埃，根據(jù)水膜表面張力撈取切片，放到干凈載玻片上调衰，酒精燈略微加熱膊爪，使水蒸干，并對著光亮用記號筆標(biāo)示切片所在位置嚎莉。

4. 半薄切片染色

1. 吸取20μL甲苯胺藍染液米酬，滴加到載玻片放有切片的位置，室溫靜置30 s 趋箩。
2. 去離子水沖洗玻片赃额，直至不再有藍色加派。吸水紙上瀝干，酒精燈略微加熱跳芳，加速切片上的水分蒸發(fā)芍锦。
3. 顯微鏡觀察切片質(zhì)量和樣品位置。

5. 精修包埋塊

1. 移去裝有水槽的玻璃刀飞盆，取下裝有包埋塊的樣品頭娄琉，裝至修塊機上。
2. 根據(jù)半薄切片結(jié)果吓歇，使用新的鋒利刀口孽水，小心修理包埋塊四邊，使其盡可能的光滑城看、平整女气。

6. 超薄切片

1. 將鉆石刀裝至切片機刀臺上，體視鏡下小心對刀测柠，不時轉(zhuǎn)動手輪炼鞠，使樣品上下移動，調(diào)整刀臺左右角度及樣品上下角度轰胁，直至包埋塊整個表面與刀刃的距離相等谒主。
2. 轉(zhuǎn)動手輪，使整個樣品高于刀刃软吐，點控制面板Start瘩将，設(shè)置切片區(qū)域上邊界；轉(zhuǎn)動手輪凹耙，使整個樣品低于刀刃姿现，點控制面板End，設(shè)置切片區(qū)域下邊界肖抱。
3. 手動步進刀臺靠近樣品备典，至出現(xiàn)彩色干涉光，轉(zhuǎn)動手輪意述，使樣品上下移動提佣，調(diào)整刀臺左右角度及樣品上下角度，直至包埋塊整個表面與刀刃的干涉光譜顏色一致荤崇；繼續(xù)步進刀臺拌屏，并通過體視鏡觀察干涉光譜變化，直至干涉光消失术荤。
4. 轉(zhuǎn)動手輪倚喂，使樣品離開刀刃區(qū)域，使用滴管將干凈的去離子水加到玻璃刀水槽中瓣戚，體視鏡觀察直至液面略低于刀刃端圈。
5. 調(diào)整切片厚度與速度焦读，按控制面板Run/Stop鍵，開始切片舱权。體視鏡觀察可見70nm厚度切片反光為亮灰色及淺灰色矗晃。
6. 待有切片下來形成10-20片的切片帶，按Run/Stop鍵停止切片宴倍，體視鏡觀察下张症，使用睫毛筆將所需薄片撥離刀刃，并將所需切片聚攏一起啊楚。
7. 用干凈撈片環(huán)輕輕沾取切片所在區(qū)域吠冤，根據(jù)水膜表面張力撈取切片，輕輕放到干凈載膜銅網(wǎng)上恭理，用尖角濾紙靠近銅網(wǎng)邊緣緩慢吸干水分。
8. 輕輕移去撈片環(huán)郭变，將載有切片的銅網(wǎng)放到鋪有濾紙的平皿中颜价，晾干待染色觀察。

五诉濒、 染色

1. 醋酸雙氧鈾染色

1. 按每片載網(wǎng)20μL染液的量吸取醋酸雙氧鈾染液周伦，13 200 rpm離心5 min。
2. 將放有切片的載網(wǎng)小心放到染色盤上未荒，有切片面靠上专挪，并稍微用鑷子按載網(wǎng)邊緣，使其與染色盤接觸粘附牢固片排。
3. 吸取20μL染液滴加到載網(wǎng)上面寨腔，蓋上平皿防塵，室溫染色30 min率寡。
4. 將染色盤整個放到裝有去離子水的清洗缸中迫卢，輕搖清洗1 min。
5. 小心取出染色盤冶共，更換水洗液乾蛤，輕搖清洗5min。
6. 重復(fù)清洗2次捅僵。

2. 檸檬酸鉛染色

1. 按每片載網(wǎng)20μL染液的量吸取醋酸雙氧鈾染液家卖，13 200 rpm離心5 min。④
2. 在放置染色盤的平皿中放入2片固體NaOH庙楚，用以吸收平皿中CO2氣體上荡。
3. 吸取20μL染液滴加到載網(wǎng)上面，蓋上平皿防塵醋奠，室溫染色8 min榛臼。
4. 將染色盤整個放到裝有去離子水的清洗缸中伊佃，輕搖清洗1 min。
5. 小心取出染色盤沛善，更換水洗液航揉，輕搖清洗5min。
   連續(xù)染色時金刁，載網(wǎng)不需要從染色盤上拿下帅涂，清洗后直接進行鉛染即可，但是鉛染液要現(xiàn)用現(xiàn)取尤蛮。
6. 重復(fù)清洗2次媳友。
7. 小心夾取載網(wǎng)，放置到鋪有濾紙的干凈平皿中产捞，晾干待電鏡觀察醇锚。

六、 電鏡觀察

1. 取出樣品桿坯临，打開樣品夾焊唬，小心放入載網(wǎng)，合上樣品夾看靠，并轉(zhuǎn)動樣品桿赶促，輕敲確保樣品夾已準(zhǔn)確固定載網(wǎng)。
2. 將樣品桿插入透射電鏡樣品室挟炬，開始抽氣鸥滨。
3. 打開燈絲開關(guān)，等待檢測電流出現(xiàn)后谤祖，打開觀察窗開始觀察婿滓。
4. 先在低倍下找到切片，再高倍觀察切片泊脐，尋找待看目標(biāo)空幻，仔細對焦。
5. 將切片目標(biāo)區(qū)域遇到觀察窗中間后容客，調(diào)整燈絲電流密度為3.8 pA/cm2秕铛。
6. 插入拍照CCD，Start View缩挑，微調(diào)焦距但两，Start Acquire 拍照。
7. 拍照完畢供置，按格式需求保存照片到指定文件夾谨湘。
8. 使用專用寫保護閃存盤拷貝數(shù)據(jù)到公共電腦觀察、使用。
   常規(guī)電鏡樣品制備標(biāo)準(zhǔn)方法--中國科學(xué)院腦科學(xué)與智能技術(shù)卓越創(chuàng)新中心 (ion.ac.cn)