單細(xì)胞測序(single-cell sequencing)，顧名思義就是能從單個細(xì)胞中獲取遺傳信息的測序技術(shù)。單細(xì)胞測序技術(shù)為什么近來大火，那么它能幫科研工作者能解決哪些問題隆敢？單細(xì)胞測序技術(shù)原理和以及存在的問題有哪些？帶著這些疑問政基，今天起跟隨小編開啟單細(xì)胞學(xué)習(xí)之路示辈。

scRNA-seq?發(fā)展概述

單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序(single-cell RNA-seq)這項技術(shù)是由Tang et al.[1]在2009?年首次發(fā)表，但是由于測序的成本和當(dāng)時有限的protocols掌桩，直到2014年scRNA-seq才得到廣泛普及?[2]边锁。近年來，隨著單細(xì)胞測序技術(shù)的日漸成熟波岛，以及以10x Genomics?為代表的生物公司將其商業(yè)化之后茅坛，這項技術(shù)也被愈來愈多的應(yīng)用到生物學(xué)研究當(dāng)中。今天小編給大家簡單的介紹一下则拷。

Scaling of scRNA-seq experiments; from Svensson, V. et al., [2].

scRNA-seq?優(yōu)勢

為什么我們要使用單細(xì)胞測序贡蓖？它與傳統(tǒng)的bulk?sequencing相比具備哪些優(yōu)勢呢？

對于多細(xì)胞生物來說煌茬，細(xì)胞與細(xì)胞之間是有差異性的(cell heterogeneity)斥铺。這種差異性可以體現(xiàn)為不同的遺傳背景，不同的分化狀態(tài)坛善，不同的物理特征?晾蜘，不同的基因突變譜和轉(zhuǎn)錄組邻眷、蛋白質(zhì)組表達(dá)譜等?[3]。?這些差異可以幫助我們理解和研究不同細(xì)胞的臨床生理表現(xiàn)剔交。例如具有高度多樣性腫瘤細(xì)胞耗溜。腫瘤在發(fā)生發(fā)展過程中，細(xì)胞持續(xù)產(chǎn)生新的突變而形成了許多亞細(xì)胞群省容，由于它們不同的免疫特性抖拴，生長速度以及轉(zhuǎn)移能力等方面的差異，使得對藥物或者放療的臨床反應(yīng)有所不同腥椒。傳統(tǒng)的研究中阿宅，大家往往根據(jù)細(xì)胞的物理形態(tài)或者marker genes來區(qū)分不同的細(xì)胞種類，對比之下單細(xì)胞測序則更加精確笼蛛，大大的提高了細(xì)胞差異性研究的分辨率洒放。

Picture taken from?https://github.com/hbctraining/scRNA-seq?[3].

針對轉(zhuǎn)錄組來說,?在傳統(tǒng)的bulk RNA-seq?中，由于我們檢測到的是是來自于多細(xì)胞的基因的平均表達(dá)滨砍，?自然就掩蓋了細(xì)胞差異性的信號往湿，特別對于一些來自罕見細(xì)胞亞群的信號就會被中和。

Taken from https://www.10xgenomics.com/blog/single-cell-rna-seq-an-introductory-overview-and-tools-for-getting-started [4].

而scRNA-seq的優(yōu)勢是它能夠檢測出這種差異性惋戏，提高了基因表達(dá)研究的分辨率领追，?因此它常被應(yīng)用于以下幾個方面?[5]：

1）?探索組織中存在哪些細(xì)胞類型或者亞群。

2）?識別未知或稀有的細(xì)胞類型或狀態(tài)?响逢。

3）?闡述在細(xì)胞分化過程?或者不同時間?(time-courses)?內(nèi)基因表達(dá)變化绒窑。

4）?檢測特定細(xì)胞亞群的差異表達(dá)；通過表達(dá)譜進(jìn)行聚類舔亭，推斷基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)些膨。

Common applications of single-cell RNA sequencing, from?Trapnell et al.,?2016 [5].

scRNA-seq 工作流程

當(dāng)前scRNA-seq?的典型工作流程包括分離單細(xì)胞，提取RNA,?逆轉(zhuǎn)錄钦铺，擴(kuò)增订雾，構(gòu)建文庫和測序。早期的操作非常直接矛洞， 就是先將單個細(xì)胞逐個分離出來再分別進(jìn)行建庫洼哎，然而這種操作通量低且成本高。目前更常見的是將單個細(xì)胞包裹在微流體裝置中的液滴中?(droplet-based)缚甩，在那里將mRNA轉(zhuǎn)換為cDNA并擴(kuò)增谱净。

每個小滴都帶有一個獨一無二的DNA “barcode”窑邦， 標(biāo)記了它來自哪一個單個細(xì)胞擅威。除此之外， 也有protocols會采用唯一的分子標(biāo)識符(umi)冈钦，對捕獲的mRNA在擴(kuò)增測序之前進(jìn)行標(biāo)記郊丛。一旦逆轉(zhuǎn)錄完成，就可以將來自許多細(xì)胞的cDNA混合在一起進(jìn)行測序。

單細(xì)胞測序技術(shù)噪音

從流程中可以看到厉熟，實驗操作還是很復(fù)雜的导盅，這些實驗技術(shù)帶來的noise也使得下游的數(shù)據(jù)分析過程面臨更多的挑戰(zhàn)。在數(shù)據(jù)分析之前揍瑟， 我們需要考慮一些常見的Technical noise?包括：

1）?細(xì)胞的完整性：在細(xì)胞分離和建庫的過程中白翻，可能會摻入死細(xì)胞，或者多個細(xì)胞被捕獲在同一個液滴中（doublets or multiplets）绢片。

2）?批次效應(yīng)（batch effect）：類似于bulk?RNA-seq,?細(xì)胞在被分組處理時滤馍，外在環(huán)境差異可能導(dǎo)致實驗數(shù)據(jù)產(chǎn)生批次差異。

3）?對于droplet-based?scRNA-seq底循，并不是所有的mRNA分子都能被捕獲到巢株， 并且由于測序深度比較淺， 一般來說每個細(xì)胞僅能檢測到10～50%的轉(zhuǎn)錄本熙涤，這導(dǎo)致細(xì)胞中許多基因計數(shù)為0阁苞， 給之后分析工作增加了很大的計算負(fù)擔(dān)。

小編總結(jié)

隨著單細(xì)胞測序技術(shù)的不斷成熟祠挫，此類數(shù)據(jù)會越來多那槽，在高分期刊的發(fā)表也越來越常見。然而與傳統(tǒng)的測序數(shù)據(jù)相比等舔，單細(xì)胞數(shù)據(jù)分析則更加的復(fù)雜倦炒。之后我們會帶大家了解典型的scRNA-seq?數(shù)據(jù)分析步驟，并進(jìn)一步說明如何靈活的運用這些步驟软瞎，也可在V信"作圖丫"獲取同樣精彩內(nèi)容逢唤。

參考資料/文獻(xiàn)

1.?Tang, Fuchou, Catalin Barbacioru, Yangzhou Wang, Ellen Nordman, Clarence Lee, Nanlan Xu, Xiaohui Wang, et al. 2009. “mRNA-Seq Whole-Transcriptome Analysis of a Single Cell.” Nat Meth 6 (5): 377–82.?https://doi.org/10.1038/nmeth.1315.

2.?Svensson, V., Vento-Tormo, R. & Teichmann, S. Exponential scaling of single-cell RNA-seq in the past decade. Nat Protoc 13, 599–604 (2018)

3.?https://github.com/hbctraining/scRNA-seq

4.?https://www.10xgenomics.com/blog/single-cell-rna-seq-an-introductory-overview-and-tools-for-getting-started

5.?Liu S and Trapnell C. Single-cell transcriptome sequencing: recent advances and remaining challenges [version 1; peer review: 2 approved]. F1000Research 2016, 5(F1000 Faculty Rev):182 (https://doi.org/10.12688/f1000research.7223.1)

6.?https://en.wikipedia.org/wiki/Single_cell_sequencing