前面給大家簡單介紹過m6A甲基化的概念,也給大家介紹了
?corrplot展示m6a甲基化基因表達(dá)相關(guān)性
?m6a甲基化相關(guān)基因根據(jù)臨床信息分組繪制boxplot并顯示p值
m6A檢測方法
最近幾年來m6A研究迅速發(fā)展钾虐,正是得益于meRIP-seq技術(shù)的開發(fā)及應(yīng)用噪窘。meRIP-seq高通量測序技術(shù)的出現(xiàn),能夠高效精確檢測全轉(zhuǎn)錄組不同的RNA 甲基化效扫,是成功發(fā)現(xiàn)RNA 甲基化機(jī)理及功能的關(guān)鍵技術(shù)效览。MeRIP-seq 技術(shù)將甲基化DNA 免疫共沉淀(methylated DNA immunoprecipitation, MeDIP) 技術(shù)荡短、RNA 結(jié)合蛋白免疫共沉淀(RNA immunoprecipitation丐枉,RIP)技術(shù)和RNA 測序(RNA sequencing,RNA-seq) 技術(shù)組合起來掘托,高精度地檢測全基因組(或全轉(zhuǎn)錄組)范圍內(nèi)的RNA 甲基化瘦锹。MeRIP-seq 技術(shù)采用免疫共沉淀方法,即甲基化RNA 特異性抗體與被隨機(jī)打斷的RNA 片段進(jìn)行孵育,抓取有甲基化修飾的片段進(jìn)行測序(IP),同時需要平行測序一個對照(Input)樣本弯院,對照樣本用于消除抓取帶有甲基化片段過程中的背景辱士。然后將免疫共沉淀(IP)樣本和對照樣本中的序列片段對比(或定位)到參考基因組/ 轉(zhuǎn)錄組上,檢測RNA 甲基化位點(diǎn)听绳。對照樣本測量對應(yīng)RNA 的表達(dá)量颂碘,本質(zhì)上是RNA-seq 數(shù)據(jù)。
MeRIP-seq 技術(shù)檢測m6A 技術(shù)流程
當(dāng)然做完IP我們也可以直接做qPCR椅挣,稱為MeRIP-qPCR头岔,大體流程如下
第一步,先對RNA進(jìn)行特異性富集和打斷鼠证。即在打斷之前峡竣,我們需要搞清楚研究對象只是mRNA還是lncRNA。若只研究mRNA 可以先用oligodT磁珠進(jìn)行富集后再進(jìn)行打斷量九。如果是lncRNA和mRNA都要研究适掰,則需要先用試劑盒將total RNA的rRNA先去除干凈,再進(jìn)行打斷荠列。如果是進(jìn)行高通量測序打斷長度約為100nt左右类浪,而qPCR 則需要長度至少在200nt以上,部分論文甚至打斷長度在300-500nt左右肌似。一般根據(jù)文獻(xiàn)中的資料顯示费就,IP下來的片段用引物擴(kuò)增出來的長度在130-150左右,所以100nt不到的長度要設(shè)計出合適的引物會非常困難锈嫩。除非是用5’RACE擴(kuò)增受楼,否則還是建議大于200nt垦搬。當(dāng)然了呼寸,如果不打斷的話設(shè)計引物就會比較方便。當(dāng)然如果 total RNA 本身量比較少猴贰,建議直接用 m6A 抗體對 total RNA 進(jìn)行富集对雪。
第二步,對 RNA 進(jìn)行抗體孵育和特異性富集米绕。打斷完了 RNA 我們會得到長度約為 200-300 的 RNA 片段瑟捣。如果是不打斷則是較為完整的 RNA 全長。這時候我們可以分出約占 m6A-IP 部分 RNA 只有 10%的 RNA 作為 input栅干。當(dāng)然如果是細(xì)胞樣本比較充足迈套,Input 和 IP 的比例可以直接是 1:1。如果按照 1:1:1碱鳞,簡單來說用于 m6A IP 的 RNA 有,3μg桑李,那么 Input、
IP 和 IgG 的 RNA 都在 1μg 左右(無論是 total RNA 還是 mRNA)。
第三步贵白,洗脫和逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增率拒。接下來我們需要對m6A抗體和IgG抗體上洗脫下來的RNA,以及input的RNA禁荒,按照常規(guī)試劑盒要求進(jìn)行洗脫猬膨,并用隨機(jī)引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。
第四步呛伴,設(shè)計m6A-IP–qPCR 的特異性引物勃痴。由于m6A甲基化基本富集在UTR區(qū)和轉(zhuǎn)錄終止區(qū),所以如上圖所示在這些區(qū)域附近我們可以從測序結(jié)果里有明顯的peak峰磷蜀。那么我們設(shè)計引物可以考慮在基因高甲基化區(qū)域來進(jìn)行召耘。如果某幾個常見的基因在不同文獻(xiàn)里頻繁出現(xiàn),那么文獻(xiàn)里列出來的引物可以被我們直接拿來引用褐隆。通常最后PCR產(chǎn)物長度會在130-150bp左右污它。這里需要注意的是,IP下來的RNA需要用隨機(jī)引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄庶弃,而第四步中設(shè)計的引物用的是特異性引物衫贬,這個大家要注意區(qū)分和甄別。
第五步歇攻,使用上一步設(shè)計好的引物固惯,對input、m6A-IP和IgG-IP中的RNA進(jìn)行qPCR反應(yīng)并計算相應(yīng)的CT值缴守。
MeRIP-qPCR結(jié)果的計算
MeRIP-qPCR結(jié)果計算如下表:
其中DF和IF分別是稀釋倍數(shù)葬毫。是說一個樣品,由于其中IP到的RNA量一定會比不IP直接保留的Input的RNA量少很多屡穗,IP和Input實際取來做逆轉(zhuǎn)錄+qPCR的模板稀釋倍數(shù)不同贴捡,因此要把這個倍數(shù)考慮進(jìn)去。比如15μg的片段化RNA經(jīng)過IP后的RNA全部拿去做IP樣品的qPCR實驗得到Ct值A(chǔ)1, 另3μg的片段化RNA用來作為Input樣品qPCR得到Ct值B1村砂,則%(IP/Input)=2(B1-A1)(3/15)*100烂斋。IgG/Input的計算也是同理。