Gene signature of circulatingplatelet-bound neutrophils is associated with poor prognosis in cancer patients
循環(huán)血小板結(jié)合的中性粒細胞的基因特征與癌癥患者的預(yù)后不良有關(guān)
發(fā)表期刊：Int J Cancer
發(fā)表日期：2022 Mar 7
DOI：10.1002/ijc.33991
一豹悬、背景
????????除了在止血中的關(guān)鍵作用外玄括，血小板還與中性粒細胞發(fā)生物理相互作用卒茬，形成中性粒細胞-血小板聚集體（NPA）岔乔，在炎癥期間增強中性粒細胞效應(yīng)器的功能。NPA還可能促進各種炎癥性疾病的病情惡化滚躯。然而雏门，癌癥中NPA的特征仍然完全未被探索。????
????????循環(huán)中性粒細胞的一個亞群——低密度中性粒細胞（LDN）在癌癥患者的血液中擴散與預(yù)后較差相關(guān)掸掏，尤其是在非小細胞肺癌（NSCLC）和頭頸癌（HNC）中茁影。此外，發(fā)現(xiàn)相比于正常密度中性粒細胞（NDN）丧凤，LDN顯示出腫瘤中性粒細胞增強T細胞抑制功能募闲。
二、數(shù)據(jù)來源和實驗方法
1.數(shù)據(jù)來源
1）六名轉(zhuǎn)移性NSCLC患者的全血愿待；以年齡和性別匹配的對照組來自健康獻血者（HD）的全血浩螺。
2）六名非小細胞肺癌(NSCLC)患者全血白細胞的ScRNA-seq數(shù)據(jù)（GSE127465）的CPM基因表達矩陣；健康獻血者（HDs）全血白細胞的ScRNA-seq數(shù)據(jù)(GSE145230)的CPM基因表達矩陣仍侥。
2.實驗方法
1）全血要出、NDNs和LDNs富集部分的制備，用于多光譜成像流式細胞儀农渊；May Grünwald Giemsa染色
2）非小細胞肺癌患者（NSCLC）和健康獻血者（HDs）全血白細胞的ScRNAseq數(shù)據(jù)預(yù)處理
3）差異性基因表達分析：從GSE127465 CPM基因表達矩陣生成的Seurat對象中患蹂，使用Seurat R軟件包中的FindAllMarkers功能對兩個不同集群之間進行差異基因表達分析
4）批量轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的單樣本基因集富集分析（ssGSEA）：GSVA R包中的SsGSEA對體外刺激和非刺激中性粒細胞（GSE15139和GSE49757）的公共微陣列數(shù)據(jù)進行分析
5）基于scRNAseq數(shù)據(jù)的單樣本基因集富集分析（ssGSEA）并繪制barplot：escape包中的ssGSEA用于計算所有單個細胞的血小板特征“Raghavachari”和中性粒細胞特征“in house 11 genes”的富集分數(shù)。
6）MCP count on scRNAseq data
7）生存分析
三砸紊、實驗結(jié)果
1.癌癥患者和健康獻血者（HDs）外周血中NPA的鑒定
????????使用ImageStreamX（ISX）成像流式細胞儀传于，NPAs從NSCLC患者和HDs的全血中被鑒定為CD15+ CD14-中性粒細胞，其血小板糖蛋白4（CD36）和整合素α-IIb（ITGA2B醉顽，也稱為CD41a）雙重陽性（圖1A沼溜，B）。此外徽鼎，發(fā)現(xiàn)來自NPAs的CD36+和ITGA2B+血小板也表達P-選擇素（CD62P）（圖1B）盛末。還可以通過May-Grünwald-Giemsa染色在未處理的NSCLC患者的全血涂片中輕松識別NPAs（圖1C）。由于NPAs的頻率被證明在各種病癥患者的血液中比HDs要高否淤，作者接下來通過ISX量化了NSCLC患者和HDs之間中性粒細胞中NPAs的頻率悄但。雖然NSCLC患者和HDs之間的NPA頻率大致相同沒有統(tǒng)計學(xué)意義上的差異，但與NSCLC患者和HDs的NPA平均頻率相比石抡，一名NSCLC患者顯示出超過3倍的NPA比例（圖1D）檐嚣。有趣的是，在分析的所有六名NSCLC患者中，這名NPA比例高的患者也顯示出迄今為止最高的NLR值嚎京，主要是由較高的中性粒細胞絕對數(shù)和最高的腫瘤負擔(dān)嗡贺。
2.血小板優(yōu)先與癌癥患者血液中的低密度中性粒細胞（LDN）結(jié)合鞍帝，而不是正常密度中性粒細胞（NDN）
????????分析LDN和NPA之間的潛在聯(lián)系后發(fā)現(xiàn)：與HDs相比LDN在癌癥患者血液中的含量更高（圖2A）诫睬。對NSCLC和頭頸癌（HNC）患者血液中大量LDN和NDN的公開轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（GSE79404）進行了單樣本基因集富集分析（ssGSEA）發(fā)現(xiàn)：已發(fā)表的血小板特異性基因標記“Raghavachari”在LDN中的富集程度顯著高于NDN（圖2B）。接下來分離LDN和NDN帕涌，使用ISX流式細胞儀發(fā)現(xiàn)CD15+CD14-CD36+ITGA2B+CD62P+NPAs來自LDN而非NDN（圖2C,D）摄凡。NPA約占LDN的2%，但在NDN人群中可忽略不計（圖2C-E）蚓曼。
綜上所述亲澡，表明血小板優(yōu)先與LDN結(jié)合，而不是NDN纫版。
3.公共scRNA-seq數(shù)據(jù)集中NSCLC患者和HDs的全血白細胞NPA的鑒定
（1）NSCLC患者數(shù)據(jù)集【GSE127465】：在分析中使用了標準化計數(shù)表床绪，并保留了原有的主要細胞類型注釋，以確定血細胞群其弊。重新分類所有白細胞（圖3A）并區(qū)分六個中性粒細胞簇（命名為Neu 1癞己、Neu 2、Neu 3梭伐、Neu 4末秃、Neu 5和Neu 6），Neu 5簇與其他中性粒細胞簇不同籽御，與血小板簇非常接近 （圖3B）练慕。發(fā)現(xiàn)通過MCP的方法計算的關(guān)于‘house 11 genes’評分，中性粒細胞顯著高于血小板技掏、單核細胞铃将、B細胞/pDC，T細胞和NK細胞（圖3C）哑梳；然后評估了已發(fā)表的血小板特異性基因標記“Raghavachari”在所有已識別聚類中的ssGSEA富集分數(shù)劲阎，與中性粒細胞、單核細胞鸠真、B細胞/pDC悯仙、T細胞和NK細胞相比，血小板簇是血小板特異性基因特征最豐富的細胞類型（圖3D）吠卷，兩步實驗都驗證了標記的特異性锡垄。中性粒細胞特異性基因（CSF3R、CXCR2和FCGR3B）在所有六個中性粒細胞簇中的表達水平最高祭隔，包括Neu 5簇（圖3E）货岭。從基因水平來看，PF4、PPBP和NRGN這三個血小板基因是差異較大的上調(diào)基因千贯，能夠區(qū)分Neu 5簇與其他中性粒細胞簇和免疫細胞簇（圖3F）屯仗。總之，表達血小板基因的中性粒細胞Neu 5簇似乎與NPA相對應(yīng)搔谴。
????????為了驗證這個含有NPA的表達血小板基因的中性粒細胞Neu 5簇不是這個特定的scRNAseq數(shù)據(jù)集所獨有的，作者研究了HDs全血白細胞（GSE145230）的公共scRNAseq數(shù)據(jù)集中是否存在表達血小板基因的中性粒細胞敦第。
（2）HDs數(shù)據(jù)集【GSE145230】：通過進行與NSCLC患者scRNAseq數(shù)據(jù)集（GSE127465）相同的分析慌核，能夠識別位于血小板簇和其他中性粒細胞簇之間的一個中性粒細胞簇（Neu 17）（圖S1A，B）申尼。與血小板、單核細胞垫桂、B 細胞/pDC师幕、T細胞和NK細胞相比，中性粒細胞特異性基因特征“in house 11 genes”再次被證明對中性粒細胞具有特異性（圖S1C）诬滩。血小板特異性基因標記“Raghavachari”也是如此霹粥，其在血小板簇中的平均ssGSEA得分顯著高于中性粒細胞、單核細胞疼鸟、B細胞/pDC后控、T細胞和NK細胞（圖S1D）。與之前在NSCLC患者的scRNAseq數(shù)據(jù)集中發(fā)現(xiàn)的一致空镜，部分Neu 17細胞表達高水平的中性粒細胞特異性基因（圖S1E）和血小板特異性基因（圖S1F）浩淘，這表明表達血小板基因的中性粒細胞的鑒定可推廣到任何人類的全血scRNAseq數(shù)據(jù)集。
? ? ? 為了排除中性粒細胞中血小板基因的上調(diào)不是中性粒細胞活化的結(jié)果张抄，作者測試了血小板特異性基因特征“Raghavachari”的富集是否在中性粒細胞活化時增加。使用了來自膿毒癥患者的 GM-CSF 或血漿體外激活的中性粒細胞的公共轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（GSE15139和GSE49757）洼怔。與對照相比署惯，中性粒細胞中血小板特征的富集評分在激活時沒有顯著差異。
????????因此镣隶，Neu 5 (GSE127465) 或 Neu 17 (GSE145230) 簇中血小板基因的表達似乎不是由中性粒細胞活化引起的极谊。 總的來說，這些結(jié)果強烈表明：Neu 5 和/或 Neu 17 中性粒細胞簇展現(xiàn)出血小板基因的高表達安岂，很可能含有NPAs轻猖。
4.NPA中性粒細胞基因特征顯示脫顆粒、趨化性和跨內(nèi)皮遷移能力增強
? ? ? ? 為了在mRNA水平上更深入地研究非小細胞肺癌患者全血白細胞NPAs的特征域那，作者重點分析了非小細胞肺癌患者的scRNAseq數(shù)據(jù)集（GSE127465）蜕依。Neu 5簇中只有一小部分細胞表達血小板特異性基因（PF4、PPBP和NRGN）（圖3F）⊙撸基于視覺細胞離散度友瘤，Neu 5簇比其他中性粒細胞簇更不均勻（圖4A）。從整個Neu 5簇的437個細胞中選擇了48個共表達三種血小板特異性基因（PF4檐束、PPBP和NRGN）的細胞辫秧，命名為“Neu 5 PPBPhigh PF4high NRGNhigh”（圖4A）。為了進一步確定NPA群中的中性粒細胞是否不同于任何其他中性粒細胞亞群被丧，首先將NPA群（Neu 5 PPBPhigh PF4high NRGNhigh細胞）與每個中性粒細胞簇分別進行差異基因表達分析（圖4B）盟戏。然后從每個成對的比較中獲得NPA簇中上調(diào)基因的集合，共有191個基因甥桂。然后去除血小板基因（圖4C）柿究，并確定了120個非血小板基因，這些非血小板基因可將NPA相關(guān)中性粒細胞與任何其他中性粒細胞亞群區(qū)分開來黄选。
????????接下來進行GO和KEGG分析蝇摸，發(fā)現(xiàn)中性粒細胞脫顆粒/趨化相關(guān)生物過程、分泌顆粒相關(guān)細胞成分和跨內(nèi)皮遷移相關(guān)KEGG基因集顯著富集（圖4D）办陷∶蚕Γ總的來說，這些數(shù)據(jù)表明NPAs相關(guān)的中性粒細胞顯示出增強的脫顆粒民镜、趨化性和跨內(nèi)皮遷移功能啡专。
5.在胰腺癌和肝細胞癌患者中，特異性NPAs相關(guān)的中性粒細胞特征與較差的預(yù)后相關(guān)
????????接下來作者討論了NPA相關(guān)中性粒細胞在不同腫瘤類型中的預(yù)后意義鲸鹦。第一步是產(chǎn)生特定的NPA相關(guān)中性粒細胞特征病附，排除其他非中性粒血液免疫細胞類型和在血小板中表達的任何其他基因（圖5A），得到16個非血小板NPA相關(guān)中性粒細胞特異性基因（圖5B）亥鬓。使用人類NSCLC腫瘤樣本的scRNAseq數(shù)據(jù)與之前使用的患者全血相匹配完沪，隨后排除了被多種其他腫瘤相關(guān)細胞類型高度表達的RBPJ、IDH2嵌戈、HELLPAR和CCNI覆积，從而產(chǎn)生最終12個NPAs相關(guān)的中性粒細胞特征基因（圖5B）。接下來在發(fā)現(xiàn)集中驗證了這個新的NPAs相關(guān)中性粒細胞特征的特異性熟呛，顯示在12個基因的NPA相關(guān)中性粒細胞特征中至少有3個共同表達的細胞在腫瘤相關(guān)中性粒細胞中的富集程度明顯高于腫瘤微環(huán)境中存在的任何其他主要細胞類型（圖5C）宽档。
????????作者用TCGA數(shù)據(jù)庫中的泛癌方法評估了12個中性粒細胞特征相關(guān)基因的預(yù)后價值（圖5B）。為了進行比較還使用了中性粒細胞特征“in house 11 genes”來探究常規(guī)中性粒細胞的預(yù)后價值庵朝，在兩個獨立的scRNAseq數(shù)據(jù)集中證明了中性粒細胞的高度特異性（圖5C）吗冤。通過進行多變量Cox分析又厉，沒有發(fā)現(xiàn)NPAs相關(guān)中性粒細胞特征與各種類型的NSCLC癌癥患者、肺鱗狀細胞癌（LUSC）和肺腺癌（LUAD）的預(yù)后之間存在任何關(guān)聯(lián)（圖5D）椎瘟。然而覆致，該特征與胰腺癌患者(PAAD)以及肝細胞癌患者 (LIHC) 的更差的無進展間隔期（PFI）和總生存期（OS）具有統(tǒng)計學(xué)相關(guān)性（圖5D )。
????????典型的中性粒細胞特征“in house 11 genes”無法概括 PAAD 和 LIHC 中如此重要的預(yù)后價值，更強化了NPA 相關(guān)中性粒細胞是具有不同臨床結(jié)果的獨特中性粒細胞群體的觀點（圖5D）宣羊。Kaplan-Meier 單變量分析還顯示 PAAD（圖 5E）和 LIHC 癌癥患者（圖 5F）中 NPA 相關(guān)的中性粒細胞特征的12個基因 的預(yù)后價值較差璧诵。典型的中性粒細胞特征“in house 11 genes”在PAAD癌癥患者（圖5E）和LIHC癌癥患者（圖5F）中均未顯示與預(yù)后有任何統(tǒng)計學(xué)顯著關(guān)聯(lián)。這再次表明NPA相關(guān)中性粒細胞不同于典型的中性粒細胞仇冯。總而言之之宿，腫瘤中存在的與NPA相關(guān)中性粒細胞所對應(yīng)的中性粒細胞亞群可能對PAAD和LIHC癌癥患者有不利影響。
四苛坚、結(jié)論
? ? ? ? 作者的研究首次報告了基于人類全血白細胞scRNA序列數(shù)據(jù)在轉(zhuǎn)錄組水平上對NPA的鑒定和表征比被。基于轉(zhuǎn)錄組學(xué)特征炕婶，發(fā)現(xiàn)與NPA結(jié)合的中性粒細胞表現(xiàn)出增強的脫顆粒、趨化性和跨內(nèi)皮遷移特征莱预，它們將更有效地浸潤腫瘤柠掂，然后促進腫瘤生長和轉(zhuǎn)移。研究結(jié)果表明依沮，來自NPA的中性粒細胞代表與LDN相關(guān)的中性粒細胞的一個獨特子集涯贞。最后，利用TCGA數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)特異性NPA相關(guān)中性粒細胞特征與PAAD和LIHC患者的預(yù)后較差相關(guān)危喉。因此宋渔，NPAs作為一種新的非侵入性血液預(yù)后生物標志物，在實體瘤癌癥患者中具有臨床應(yīng)用價值辜限。
