前文提到Tangram在基于mapping的步驟，有兩種方式:

• mode = "cluster"：速度快古徒，占用內(nèi)存少，適用于空轉和單細胞數(shù)據(jù)來自不同樣本情況下。
• mode = "cell": 占用內(nèi)存大撑刺，每個cell進行匹配，可以mapping到空轉沒有抓到的轉錄本握玛。

由于受限于空間轉錄組（包括 Visium 和 Slide-seq技術）的分辨度够傍，每個voxel(spot)通常包含多個單細胞，針對這一情況挠铲，采用去卷積的方法去推斷細胞組成顯得尤為重要冕屯。

去卷積是分析中亟需的技術，但很難獲取到確切的結果拂苹。如果你只是想推斷兩種細胞的空間分布共定位關系安聘，建議用Mapping的方法即可。如果你是想推斷細胞間的通訊連接乃至機制瓢棒，建議使用project_cell_annotations來在空間上可視化相應的模塊(program usage)浴韭。以下是細胞去卷積的步驟：
tangram首先需要知道voxel中包含多少細胞，這可以從對應的組織學圖片上通過分割得到脯宿，squidpy通過兩句代碼完成：squidpy.im.process進行平滑處理念颈，squidpy.im.segment使用watershed算法進行分割。需要關注的是有些空轉技術连霉，比如Slide-seq舍肠，不能在對應的經(jīng)測序的切片上進行染色。針對這些數(shù)據(jù)窘面，我們用粗略的方式估計細胞密度翠语，傳入uniform 到density_prior。最后需要注意的是财边，我們很難去驗證去卷積的結果肌括，因為我們得不到真實的單細胞空間分布情況。

sq.im.process(img=img, layer="image", method="smooth")
sq.im.segment(
    img=img,
    layer="image_smooth",
    method="watershed",
    channel=0,
)

顯示框選小圖的細胞分割情況
比較DAPI染色和Mask的結果確認分割的質量酣难。

inset_y = 1500
inset_x = 1700
inset_sy = 400
inset_sx = 500

fig, axs = plt.subplots(1, 3, figsize=(30, 10))
sc.pl.spatial(
    adata_st, color="cluster", alpha=0.7, frameon=False, show=False, ax=axs[0], title=""
)
axs[0].set_title("Clusters", fontdict={"fontsize": 20})
sf = adata_st.uns["spatial"]["V1_Adult_Mouse_Brain_Coronal_Section_2"]["scalefactors"][
    "tissue_hires_scalef"
]
rect = mpl.patches.Rectangle(
    (inset_y * sf, inset_x * sf),
    width=inset_sx * sf,
    height=inset_sy * sf,
    ec="yellow",
    lw=4,
    fill=False,
)
axs[0].add_patch(rect)

axs[0].axes.xaxis.label.set_visible(False)
axs[0].axes.yaxis.label.set_visible(False)

axs[1].imshow(
    img["image"][inset_y : inset_y + inset_sy, inset_x : inset_x + inset_sx, 0, 0]
    / 65536,
    interpolation="none",
)
axs[1].grid(False)
axs[1].set_xticks([])
axs[1].set_yticks([])
axs[1].set_title("DAPI", fontdict={"fontsize": 20})

crop = img["segmented_watershed"][
    inset_y : inset_y + inset_sy, inset_x : inset_x + inset_sx
].values.squeeze(-1)
crop = skimage.segmentation.relabel_sequential(crop)[0]
cmap = plt.cm.plasma
cmap.set_under(color="black")
axs[2].imshow(crop, interpolation="none", cmap=cmap, vmin=0.001)
axs[2].grid(False)
axs[2].set_xticks([])
axs[2].set_yticks([])
axs[2].set_title("Nucleous segmentation", fontdict={"fontsize": 20});

接著我們需要去提前圖片中分割成的細胞核單元的特征：每個spot下的分割單元(segmentation object)以及分割單元質心對應的坐標谍夭。

# define image layer to use for segmentation
features_kwargs = {
    "segmentation": {
        "label_layer": "segmented_watershed",
        "props": ["label", "centroid"],
        "channels": [1, 2],
    }
}
# calculate segmentation features
sq.im.calculate_image_features(
    adata_st,
    img,
    layer="image",
    key_added="image_features",
    features_kwargs=features_kwargs,
    features="segmentation",
    mask_circle=True,
)

計算及顯示每個spot下segmentation object的數(shù)量

adata_st.obs["cell_count"] = adata_st.obsm["image_features"]["segmentation_label"]
sc.pl.spatial(adata_st, color=["cluster", "cell_count"], frameon=False)

Deconvolution via alignment

tangram進行去卷積的核心原理是限制每個voxel中mapped單細胞表達譜的數(shù)量，這是與其他去卷積方法的不同之處憨募。
實現(xiàn)方式是在map_cells_to_space函數(shù)中傳入map_cells_to_space紧索，這將在損失函數(shù)中加入過濾步驟，并進行布爾正則化處理菜谣，接著在``target_count中傳入所有細胞核(segmentation object)的數(shù)量珠漂，density_prior```來傳入每個voxel中的segmentation object晚缩。

ad_map = tg.map_cells_to_space(
    adata_sc,
    adata_st,
    mode="constrained",
    target_count=adata_st.obs.cell_count.sum(),
    density_prior=np.array(adata_st.obs.cell_count) / adata_st.obs.cell_count.sum(),
    num_epochs=1000,
#     device="cuda:0",
    device='cpu',
)

同前面一樣，可以顯示不同細胞類型的空間分布媳危。

tg.project_cell_annotations(ad_map, adata_st, annotation="cell_subclass")
annotation_list = list(pd.unique(adata_sc.obs['cell_subclass']))
tg.plot_cell_annotation_sc(adata_st, annotation_list, perc=0.02)

同樣可以通過檢測test基因判斷mapping的情況

ad_ge = tg.project_genes(adata_map=ad_map, adata_sc=adata_sc)
df_all_genes = tg.compare_spatial_geneexp(ad_ge, adata_st, adata_sc)
tg.plot_auc(df_all_genes);

##################################################
接著是核心部分:
在前面去卷積部分中我們的都每個spot中獨特segmentation object的數(shù)目以及質心坐標荞彼。我們在數(shù)據(jù)框中顯示這些關鍵信息，每一行代表segmentation object (a cell)待笑，表格顯示每個細胞的unique centroid ID鸣皂，包含spot ID和數(shù)字index。

tg.create_segment_cell_df(adata_st)
adata_st.uns["tangram_cell_segmentation"].head()

使用tangram.count_cell_annotation()暮蹂，其利用去卷積的結果來對每個segmentation ID映射相應的細胞類型寞缝。

tg.count_cell_annotations(
    ad_map,
    adata_sc,
    adata_st,
    annotation="cell_subclass",
)
adata_st.obsm["tangram_ct_count"].head()

將結果提取成新的AnnData對象

adata_segment = tg.deconvolve_cell_annotations(adata_st)
adata_segment.obs.head()

該AnnData對象不包含細胞數(shù)量，只包含細胞類型的注釋仰泻，即tangram映射的結果荆陆，這更方便進行可視化。在下圖中你會發(fā)現(xiàn)我纪，每個點并不代表spot慎宾，而是代表每個segmentation object丐吓。

fig, ax = plt.subplots(1, 1, figsize=(20, 20))
sc.pl.spatial(
    adata_segment,
    color="cluster",
    size=0.4,
    show=False,
    frameon=False,
    alpha_img=0.2,
    legend_fontsize=20,
    ax=ax,
)