為什么選擇空間轉(zhuǎn)錄組
1. 單細胞轉(zhuǎn)錄組分析局限性
實驗組織要求分離完整且存活虫碉，導致一些研究對象被該技術(shù)拒之門外。
細胞分離過程中的應激龄章，死亡做裙，聚集等現(xiàn)象致使其結(jié)果產(chǎn)生偏差锚贱。
對組織的細胞分離惋鸥，破壞其空間結(jié)構(gòu)耐量，一定程度上影響了細胞類型和功能的分析廊蜒。
2. 空間轉(zhuǎn)錄組的技術(shù)優(yōu)勢
- 任何給定細胞相對于其鄰居和非細胞結(jié)構(gòu)的位置山叮，都可以為定義細胞表型屁倔、細胞狀態(tài)，以及最終的細胞和組織功能提供有用的信息往衷。雖然內(nèi)分泌信號在宏觀尺度上起作用，但許多其他類型的信號通過細胞-細胞相互作用或通過附近的可溶性信號作用于鄰近細胞来颤。這些信號的一種形式是細胞表面結(jié)合蛋白受體和配體對脚曾，其mRNA可通過轉(zhuǎn)錄組學進行檢測本讥。
- mRNA的亞細胞定位決定基因功能，例如調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)產(chǎn)物在細胞中產(chǎn)生和運輸?shù)奈恢枚撸绊懥斯烙?0%的轉(zhuǎn)錄物種序无。這些推斷是通過靶向篩選特定的mRNAs得出的帝嗡，但超出了scRNA-seq的當前能力。新興的空間轉(zhuǎn)錄組學技術(shù)有望以亞細胞分辨率同時分析數(shù)百至數(shù)千個基因巢寡。
空間轉(zhuǎn)錄組分析平臺
空間轉(zhuǎn)錄組學旨在統(tǒng)計組織中不同空間位置的基因轉(zhuǎn)錄數(shù)抑月。不同的技術(shù)具有不同的技術(shù)參數(shù)舆蝴。模型生物的組織大小可從邪じ濉（<1mm2）切片到完整器官切片不等奶甘；計數(shù)的基因數(shù)量可以從幾十到幾千臭家，甚至整個基因組蹄殃；空間位置可以從整個組織域诅岩，到大的500μm×500μm感興趣區(qū)域，再到單個細胞甚至更精細式廷。在當前技術(shù)中，基因數(shù)量和技術(shù)效率之間往往存在權(quán)衡蠕趁，即成功計數(shù)的感興趣轉(zhuǎn)錄物的比例逛绵，從接近100%到低至1%瓢对。
1. 基于成像的空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)
通過顯微鏡原位成像mRNA，是基于成像的空間轉(zhuǎn)錄組學技術(shù)的基礎(chǔ)秧荆。
-
當對mRNA進行原位成像時乙濒，還必須有一種方法來區(qū)分不同的mRNA種類，其中有兩種甘有。
mRNA的雜交熒光的基因特異性標簽，被稱為原位雜交（ISH）幌氮。
擴增mRNA的原位測序（ISS），其中轉(zhuǎn)錄物通過連接測序（SBL）技術(shù)在組織塊或切片內(nèi)直接測序。
ISH方法
原位雜交平臺通過顯微鏡檢測以定量轉(zhuǎn)錄随橘。該技術(shù)的早期步驟始于20世紀60年代，
1969年通過互補探針標記核酸，1973年標記特定序列牙言，70年代末熒光標記卑硫。這種原位雜交（ISH）于1989年首次用于整個生物體（果蠅）。
ISH可用于分析組織切片和整個生物體中的基因表達模式颜懊，但主要是定性的桐款。1998年出現(xiàn)了一種對探針標記轉(zhuǎn)錄物成像的定量方法媳维，即單分子熒光原位雜交（smFISH），其中每個標記轉(zhuǎn)錄物通過顯微鏡顯示為單個點。這種變體已經(jīng)在商業(yè)上使用了一段時間，例如RNAscope团秽。基于現(xiàn)代成像的空間轉(zhuǎn)錄組學建立在smFISH上间螟。
當前的ISH方法包括seqFISH荣瑟、seqFISH+和MERFISH治拿。所有這三種都通過采用多輪雜交在smFISH上延伸。
seqFISH（順序熒光原位雜交）使用熒光團的時間條形碼笆焰，其中相同的探針在不同的雜交輪中雜交劫谅，但每次都使用一個不同的熒光，而不是使用gene與熒光團1:1這樣的對應方式嚷掠，因為這樣對數(shù)千個基因來說不可能實現(xiàn)的捏检。熒光團的組合和順序是基因特有的。
seqFISH+使用一級基因特異性雜交探針不皆，每個探針具有多個結(jié)合位點贯城，以雜交二級熒光團標記的探針。在每一輪連續(xù)雜交中霹娄，將下一個結(jié)合位點與熒光探針雜交能犯，并對整個樣品進行成像，熒光團序列定義了mRNA種類犬耻。seqFISH使用4個熒光團踩晶，條形碼長度n取決于靶基因的數(shù)量，以在體外描繪整個基因組枕磁。然而渡蜻，如果描述了太多的轉(zhuǎn)錄本，則在實踐中受到光學擁擠的限制计济。seqFISH+可以使用60個“偽色”（而不是4-5個熒光團）在單個細胞中描繪10000個基因晴楔，并在每個雜交輪僅用熒光團標記一部分轉(zhuǎn)錄物，避免了光學擁擠峭咒。每個偽色由20個單獨雜交輪的組合得到税弃。
MERFISH（多重誤差魯棒熒光原位雜交）也使用順序雜交，但不是熒光團序列凑队，而是使用二元編碼二級探針的位點序列：熒光團標記或未標記则果。任何成像技術(shù)中的每一輪雜交都有出錯的風險；任何轉(zhuǎn)錄本出錯的風險都會隨著每一輪呈指數(shù)增長漩氨。MERFISH的二進制方法對錯誤具有魯棒性西壮，因為它減少了一輪不可調(diào)和錯誤的機會，從而阻止了轉(zhuǎn)錄物的識別叫惊，因為如果確定了一個意外的序列款青，則與使用4個熒光團相比，可以更容易地將其糾正為預期的序列霍狰。
除了誤差之外抡草，一些ISH方法的兩個限制是組織輪廓尺寸小饰及，seqFISH+約1mm2，以及重復成像所需的時間康震。最近的一項技術(shù)燎含，增強型電FISH（EEL FISH），在FISH之前腿短，電泳將mRNA從組織轉(zhuǎn)移到玻璃蓋玻片上屏箍，這濃縮了組織深度（z軸），允許在x/y平面中捕獲的圖像具有更大的信號強度橘忱，并減少了成像時間赴魁。這正作為Rebus Biosystems的Esper儀器進行商業(yè)化。
最后钝诚，EASI-FISH或擴展輔助迭代熒光原位雜交尚粘，其使用清除組織的水凝膠擴展來清除厚組織，在使用直接探針雜交到靶mRNA和成像的seqFISH樣編碼策略之前敲长，可阻斷高達300微米厚的組織郎嫁。因此，該技術(shù)提供了組織中基因表達的3D分辨率祈噪。最近用于組織中基因表達的3D分辨率的商業(yè)技術(shù)包括Nanostring的基于CosMx ISH的儀器泽铛。
- ISS方法
代替使用的基因特異性探針，而是使用探針在組織中啟動和擴增轉(zhuǎn)錄物的同時定位1-2個堿基辑鲤。每個堿基或2個堿基序列連接到不同的熒光團盔腔，從而實現(xiàn)可視化和記錄，最終導致每個轉(zhuǎn)錄物的識別月褥。引物可以是靶向的或非靶向的弛随，通常通過滾圈擴增（RCA）進行擴增，這保留了空間定位宁赤。
空間轉(zhuǎn)錄組學的第一個例子于2013年發(fā)布舀透，之后被商業(yè)化為Cartana，隨后被10X Genomics收購决左。Cartana是一種靶向方法愕够，每輪使用一個查詢堿基，隨后使用非靶向技術(shù)佛猛，例如熒光原位測序（FISSEQ）和ExSeq（FISEQ與擴增顯微鏡的組合）惑芭，每輪兩個堿基。最后继找，STARmap將方法擴展到3D組織塊遂跟，并通過動態(tài)退火和連接（SEDAL）結(jié)合1個和2個查詢堿基探針，采用誤差魯棒測序和減少誤差。然而幻锁，z軸上的成像可能需要較長的顯微鏡時間凯亮，特別是如果執(zhí)行多輪STARmap以描繪同一區(qū)塊中不同基因的面板。
- 技術(shù)限制
ISH和ISS方法是有用的越败，因為它們具有高的空間分辨率触幼，能夠在亞細胞水平上分析mRNA硼瓣。ISH方法比ISS方法更有效地檢測mRNA究飞，因為滾圈擴增可以是選擇性的。然而堂鲤，ISS方法可以檢查更大的組織區(qū)域亿傅，因為RCA增加了信噪比，允許更低的放大率瘟栖。ISH和ISS方法都受到一些類似的技術(shù)限制葵擎，特別是需要在顯微鏡上花費數(shù)小時至數(shù)天的成像時間，從而生成數(shù)TB的數(shù)據(jù)半哟。最后酬滤，這些方法需要在捕獲效率與基因數(shù)量之間進行一些權(quán)衡。ISH方法寓涨，如seqFISH盯串，可以計數(shù)樣本中幾乎所有的靶轉(zhuǎn)錄物，但分析的基因越多戒良，需要的雜交輪次就越多体捏，復合錯誤的可能性就越大。相反糯崎，ISS方法（如Cartana）需要較低的放大率設(shè)置几缭，但RCA效率低下，未擴增的轉(zhuǎn)錄物不被計算在內(nèi)沃呢，這意味著捕獲效率與下面討論的測序方法相當年栓。
2. 基于序列的空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)
從組織中提取mRNA，同時保留空間信息薄霜，然后通過下一代測序（NGS）技術(shù)分析mRNA種類韵洋，這是基于測序的空間轉(zhuǎn)錄組學技術(shù)的基礎(chǔ)。
保存空間信息的常見方法是（1）基于顯微切割的方法黄锤，通過顯微切割和微流體搪缨，直接捕獲和記錄位置（2）基于陣列的方法，通過將mRNA連接到微陣列中的空間條形碼探針來進行空間定位鸵熟。
Microdissection方法
早期的先驅(qū)技術(shù)是激光捕獲顯微切割（LCM）副编，其中通過微陣列對特定組織區(qū)域進行處理以進行轉(zhuǎn)錄組分析。2000年代流强，Tomo-seq對組織進行了冷凍切片痹届，每個切片都進行了RNAseq分析呻待。Geo-seq是相似的，但組織切片要經(jīng)過scRNA-seq《痈現(xiàn)代顯微切割技術(shù)包括Nanostring的GeoMx DSP蚕捉，其可變空間分辨率低至接近單個細胞，其中用基因特異性可見光切割探針對基因進行條形碼閱讀柴淘。當紫外線照射在組織上時迫淹，一次照射一個感興趣的區(qū)域，探針就會被釋放并測序为严。由于LCM過程中激光誘導的mRNA降解敛熬，以及獨立文庫制備物的數(shù)量等實際考慮因素，STRP-seq被開發(fā)用于在連續(xù)的薄切片上以2D方式描述基因表達第股，然后以不同角度進行橫截面并測序以揭示基因表達模式应民。總的來說夕吻，這些基于微切割的技術(shù)為分析無偏诲锹、空間分辨的轉(zhuǎn)錄組提供了有用的第一套技術(shù)，但它們受到其空間分辨率涉馅、LCM用于微切割時mRNA的降解以及處理許多樣本進行測序的需要的限制归园。
- Arrays方法
相比之下，2016年的空間轉(zhuǎn)錄組學（ST）是一個位置條形碼控漠、“基于陣列”捕獲mRNA的早期例子蔓倍。將組織安裝在陣列上，通過空間條形碼探針局部捕獲釋放的mRNA盐捷，轉(zhuǎn)化為cDNA偶翅，然后測序。與ISH和一些ISS方法一樣碉渡，探針不是基因特異性的聚谁，而是以非靶向的方式捕獲聚腺苷酸化的mRNA。陣列方法的空間分辨率由包含任何給定的唯一位置條形碼的捕獲區(qū)域的大小來定義滞诺，這可能類似于攝影中的像素大小形导。ST具有100μm（中心到中心）的捕獲區(qū)域或像素。10X Genomics將其商業(yè)化习霹，稱為Visium朵耕，將其分辨率提高到六邊形55μm，并計劃在2022年實現(xiàn)2μm的捕獲區(qū)域淋叶。其他發(fā)展包括Slide-seq阎曹，它使用由直徑10μm的條形碼珠組成的陣列，在組織安裝之前確定每個位置的條形碼。Slide-seqV2是一種改進了條形碼和酶文庫制備的版本处嫌，其每個捕獲珠的轉(zhuǎn)錄組信息恢復量是10X基因組學中基于水滴的單細胞轉(zhuǎn)錄組信息的30-50%栅贴，這意味著每10μm像素可以檢測到數(shù)百或數(shù)千個基因。高清空間轉(zhuǎn)錄組學（HDST）的工作原理與Slide-seqV2類似熏迹，珠子被限制在載玻片中蝕刻的孔中檐薯，空間分辨率為2μm。Stereo-seq等新興技術(shù)實現(xiàn)了更低的分辨率用放置在相距0.5μm的孔中的條形碼RCA產(chǎn)品進行標記注暗；Stereo-seq和其他非常高分辨率的測序技術(shù)坛缕，如PIXEL-seq，每單位面積的mRNA回收率與Visium相似友存。Stereo-seq目前正在由華大基因作為其STOmics平臺進行商業(yè)開發(fā)祷膳，目前處于早期訪問階段陶衅。最后屡立，雖然這些技術(shù)中的大多數(shù)是為儲存在低于信使核糖核酸降解溫度的新鮮冷凍組織而設(shè)計的，但一些方法搀军，如Visium FFPE膨俐，與用福爾馬林固定并包埋在石蠟中的組織兼容，盡管這需要額外的步驟來制備用于分析的組織罩句，基因特異性探針組（盡管基因組中的所有基因都有圖譜）焚刺。也有獨立開發(fā)的將Visium試劑用于FFPE保存組織的技術(shù)，但尚不清楚這些技術(shù)是否正在積極的商業(yè)開發(fā)中门烂。
將組織安裝到陣列上的另一種選擇是使用微流體通道將陣列“打印”到組織上乳愉，這是組織中用于空間組學測序（DBiT-seq）的確定性條形碼所使用的一種方法。條形碼沿著組織切片的一個軸沉積屯远，然后垂直于第一軸蔓姚。然后將條形碼相互連接，以在組織上的每個點產(chǎn)生唯一的條形碼慨丐。捕獲面積取決于所使用的微流體通道的直徑坡脐，其范圍從10μm到25μm或50μm不等。這種方法有利于避免mRNA從局部捕獲區(qū)域擴散房揭，并通過在處理前在微流體通道中給予寡核苷酸標記的抗體來進行蛋白質(zhì)評估备闲。
- 技術(shù)限制
這些方法的缺點是捕獲區(qū)域不遵循細胞形態(tài)的復雜輪廓。因此捅暴，細胞通常橫跨多個捕獲區(qū)域恬砂，為一個以上的像素貢獻信使核糖核酸。即使捕獲區(qū)域小于單個細胞（如HDST）蓬痒，它們?nèi)匀蝗狈渭毎直媛市褐瑁驗樗鼈儍H從單個細胞大小的區(qū)域捕獲mRNA。因此，最近的技術(shù)瞪讼，如XYZeq和sci-Space钧椰，采用了空間條形碼陣列，不是用于mRNA捕獲符欠，而是用于完整的細胞標記嫡霞。然后將完整的細胞解離，并用空間記錄的條形碼進行scRNA-seq希柿。這些方法中的mRNA回收得益于使用已建立的scRNA-seq技術(shù)诊沪，sci-Space平均檢測約1200個基因/細胞。然而曾撤，它們在相對較低的空間分辨率下工作端姚。sci Space使用半徑為80μm的光斑，XYZeq光斑的中心到中心距離為500μm挤悉。
與ISH和ISS方法相比渐裸，array方法具有各種優(yōu)點和缺點。它們通常描繪更大的組織切片装悲，例如Visium高達6.5毫米×6.5毫米昏鹃，而seqFISH只有0.5毫米。通過使用NGS而不是顯微鏡诀诊，他們避免了圖像處理管道洞渤。此外，它們是非靶向的属瓣，可以對任何使用聚腺苷酸信使核糖核酸的生物體的整個轉(zhuǎn)錄組進行分析载迄。然而，它們的空間分辨率和mRNA回收率低于ISH和ISS方法抡蛙。最后护昧，通過依賴固定陣列，可以在同一點捕獲來自不同細胞的轉(zhuǎn)錄物溜畅，這意味著需要復雜的分析來確定每個點存在哪些細胞類型捏卓。
結(jié)束語
本文的大多觀點來源于綜述：[An introduction to spatial transcriptomics
for biomedical research]（https://doi.org/10.1186/s13073-022-01075-1）。該文詳細介紹了空間轉(zhuǎn)錄組分析技術(shù)的前世今生慈格，以及對未來的期待怠晴，其中還包括空間轉(zhuǎn)錄組實驗設(shè)計和下游生信分析的指導建議，如果對其感興趣浴捆，請自行進行下載蒜田。同時歡迎大家微信搜索”豫見生信“一起學習。
