文章信息
文章題目：GWAS揭示酸性磷酸酶ACP2在缺磷條件下通過絲氨酸代謝調節(jié)水稻光合作用
影響因子：9.4
組學技術：GWAS＆轉錄組＆代謝組
技術路線
研究背景
光合作用被認為是地球上最重要的過程丁溅，在自然界中侨歉，植物的生產(chǎn)力依賴于光合作用。而無機磷缺乏會顯著影響植物的生長棉浸、發(fā)育和光合效率。目前缭裆，有一項連鎖圖譜研究表明pi效率和光合作用相關性狀（如凈光合速率和蒸騰速率）之間存在顯著的遺傳關系丝蹭。然而汉操，Pi效率和光合作用相關性狀都是復雜的數(shù)量性狀愁铺，且都是基因型特異性和環(huán)境敏感性的鹰霍，因此對這兩個性狀的QTL多效性報道很少。也很少有研究者利用GWAS研究水稻光合磷利用效率（PPUE）的調控機制茵乱。
PPUE與Pi利用效率之間的相關性
作者通測量了20個水稻品種在磷充足(Pi+)和缺磷（Pi-）條件下的光合效率茂洒，確定了磷利用效率與光合速率之間的關系，并以PPUE(Asat Pi-/Asat Pi+)表示光合Pi的利用效率瓶竭。結果表明督勺，PPUE在這些水稻品種中表現(xiàn)出與生物量相似的模式。PPUE與生物量比值的相關性系數(shù)（r2）為0.6斤贰，表明PPUE與磷利用效率之間可能存在密切關系智哀。如圖1所示。
通過GWAS確定PPUE性狀的候選基因ACP2
作者研究了整個水稻MiniCore群體（206個品種）中Asat Pi-荧恍、Asat Pi+和PPUE的遺傳和表型自然變異瓷叫。結果表明，這三個參數(shù)在整個MiniCore種群中都表現(xiàn)出顯著的自然變化（圖2A-C）块饺。對PPUE和Asat Pi-進行GWAS分析赞辩，結果顯示在2號染色體上發(fā)現(xiàn)了與這兩種性狀相關的重疊的SNP峰（圖2D和2E）∈诩瑁混合線性模型(MLM)分析證實了PPUE和Asat Pi-觀測值和預期值之間存在很強的相關性（圖2F和2G）。然而世落，Asat Pi+的GWAS結果顯示淮腾，沒有顯著的SNP峰與這兩種性狀相關。連鎖不平衡(LD)分析結果顯示屉佳，在以SNP(2m7084278)為中心的50kb基因組區(qū)域內(nèi)谷朝，存在兩個不同的區(qū)塊，P=2.3×10-5（圖3A）武花。在這個基因組區(qū)域內(nèi)（block2）圆凰，作者確定了9個候選基因。隨后對20個種質（10個低PPUE和10個高PPUE）中這些基因的相對表達水平進行評估体箕，結果顯示专钉，只有ACP2基因表達在Pi+和Pi-條件下都發(fā)生了顯著改變。在高PPUE的種質中ACP2表達水平最高累铅，表明磷酸鹽響應性顯著提高跃须。這表明ACP2可能是控制水稻PPUE的候選基因（圖3C）。
ACP2基因的單倍型分析
在ACP2基因中觀察到10個多態(tài)性SNP娃兽，其中7個位于啟動子區(qū)內(nèi)菇民，1個位于第二個外顯子內(nèi)，2個位于終止子區(qū)內(nèi)，表明其對基因表達具有潛在的影響（圖4A）第练。這10個SNP被分為兩種不同的單倍型阔馋，即HapI和HapII。與HapII（包含75個種質的）相比娇掏，HapI（包含131個種質）的Asat Pi-和PPUE均顯著降低垦缅。這表明這些單倍型在ACP2基因對這些性狀中的作用具有潛在的功能影響。比較分析顯示驹碍，與HapII相比壁涎，HapI組的Asat Pi-和PPUE水平顯著降低，表明在這些性狀受單倍型影響志秃。然而怔球，兩組之間Asat Pi+水平?jīng)]有顯著差異（圖4B-3D）。單倍型的地理分布顯示浮还，大多數(shù)HapI種質（34.1%）來自IND竟坛，而HapII主要來自AUS種質（48.6%），這表明可能有潛在的區(qū)域適應性或選擇壓力（圖4E）钧舌。進一步分析將這10個SNP歸入單個LD區(qū)塊担汤，發(fā)現(xiàn)它們之間存在很強的遺傳連鎖。這種緊密的聯(lián)系表明洼冻，這些SNP可能共同影響ACP2基因功能崭歧，從而影響相關性狀。
ACP基因特性分析
作者證實撞牢，僅在Pi+條件下率碾，ACP2在葉片中高表達，在花屋彪、根和芽中的表達量大大降低所宰，而ACP2在種子中呈弱表達。此外畜挥，HapI型和HapII型分別對應水稻MiniCore群體中的L4108和Q4147水稻品種仔粥。在這兩個水稻品種中，ACP2的表達都受到Pi-的刺激蟹但，與L4108相比躯泰，Q4147在Pi-條件下20小時后葉片和根組織中的ACP2表達量更高。ACP2蛋白的序列非常保守矮湘，存在于多種C3和C4物種中斟冕。對類似同源基因的調查表明，ACP2及其同源基因含有三個保守的motifs缅阳，這是典型的鹵酸脫鹵酶(HAD)結構域特征磕蛇。
在內(nèi)質網(wǎng)(ER)和高爾基體(GA)中均觀察到ACP2蛋白的定位(圖5A)景描。我們使用各種有機Pi化合物來測試ACP2的底物特異性。還純化了重組ACP2蛋白以確定其生化特性秀撇。生化測定結果表明超棺，ACP2對磷酸乙醇胺(PE)表現(xiàn)出最高的磷酸酶活性。此外呵燕，ACP2對其他所有測試的有機Pi化合物都表現(xiàn)出高活性棠绘，這表明ACP2有廣泛的底物選擇性(圖5B)。在包含不同CDS區(qū)域的兩種ACP2單倍型之間未檢測到對PE的底物活性的顯著變化(圖5C)再扭。
ACP2對PPUE的促進作用以及ACP2啟動子區(qū)SNP的等位基因效應
為了確定ACP2的功能氧苍，作者基于CRISPR-Cas9構建了五個ACP2過表達水稻品系（包括兩個單倍型）和一個ACP2突變體。選用具有相似基因和蛋白質表達水平的兩種單倍型的兩個OE品系泛范，比較v8 SNP變異時單倍型對PPUE的影響（圖6A-6C）让虐。從L4108（HapI）和Q4147（HapII）擴增了兩種單倍型的序列，分別命名為ACP2v8A和ACP2v8G罢荡。結果表明赡突，ACP2v8A和ACP2v8G中的Asat Pi-和PPUE值均呈相似的增加趨勢（圖6D），而ACP2v8A和ACP2v8G之間的Asat Pi+沒有顯著改變区赵。這表明ACP2可以促進PPUE惭缰，但是CDS區(qū)域中SNP的等位基因變異不能改變其催化特性。因此笼才，ACP2兩種單倍型對PPUE的生物學效應很可能是由其啟動子區(qū)的7個SNP介導的漱受。
為了確定磷酸鹽響應，作者從處于Pi+和Pi-條件下的水稻植株中分離出原生質體患整，并通過熒光素酶活性檢測攜帶SNP變體的ACP2啟動子的活性拜效。結果表明，在Pi-條件下各谚，HapII中的熒光素酶活性明顯高于HapI，但在Pi+條件下則沒有這種變化到千，這表明高磷酸鹽響應主要與HapII有關（圖6E）昌渤。僅當v5的SNP突變?yōu)镠apII時，ACP2對磷酸鹽可用性變化的響應才顯著增加（圖6E）憔四。為了進一步證明v5變異對PPUE的影響膀息，將v5 SNP上從攜帶G等位基因的中華11號（ZH11）逆轉為攜帶A等位基因的CRISPR編輯水稻株系，并將其命名為ACP2v5A了赵。在Pi-條件下潜支，ACP2v5A的表現(xiàn)略好于CP2v5G（圖6F）。且ACP2v5A中的ACP2基因表達柿汛、PPUE冗酿、Asat Pi-、分蘗數(shù)和生物量均顯著高于ZH11（圖6G和6H）。
ACP2與磷酸反應基因PHR2的協(xié)同作用
在田間Pi-和Pi+條件下项玛，作者比較了具有不同ACP2表達水平的ACP2和PHR2轉基因株系的表現(xiàn)。結果表明弱判，在Pi-條件下的ACP2v8G-OE株系植物的表現(xiàn)優(yōu)于acp2或PHR2突變體襟沮，phr2（圖7A）。在暴露于Pi-不同時間后昌腰，葉片Pi含量逐漸降低（圖7B）开伏。轉錄組分析揭示，在ACP2v8G-OE中與光呼吸途徑相關的9個基因的表達降低遭商，而在acp2中表達增加（圖7C）固灵。通過RT-qPCR分析進一步證實了該結果。另外株婴，ACP2v8G中芽的總P含量怎虫、Asat Pi-和PPUE增加，在acp2中減少（圖7D）困介。ACP2的兩種產(chǎn)物乙醇胺和絲氨酸在ACP2v8G-OE中積累大审，而與暴露于Pi-下的ZH11相比，acp2中的這兩種產(chǎn)物減少（圖7E和7F）座哩。與ZH11相比徒扶，ACP2v8G-OE中的苗重和產(chǎn)量都顯著增加（圖7G）。相反根穷，ACP2v8G中的乙醛酸和乙醇酸減少姜骡，而在acp2中有所增加，同時光呼吸速率(PR)也增加屿良，甘氨酸除外（圖7G-7K）圈澈。有趣的是，在Pi-條件下尘惧，PPUE康栈、乙醇胺、絲氨酸喷橙、芽生物量啥么、甘氨酸、乙醛酸贰逾、乙醇酸和PR在phr2和ZH11之間沒有顯著差異（圖7D-7K）悬荣。
ACP2 通過絲氨酸效應間接調節(jié)光呼吸途徑
作者推測PHR2會與位于ACP2啟動子上距起始密碼子284bp片段處的motif-GNATATNC結合。因此疙剑，作者通過EMSA進一步研究了PHR2和ACP2之間的結合親和力（圖8A）氯迂。LUC實驗表明PHR2轉錄可誘導ACP2的表達（圖8B）践叠。作者構建了一個PHR2-OE的水稻品系，在Pi-條件下囚戚，PHR2-OE2中的ACP2基因表達比ZH11增加了3.5倍（圖8C）酵熙。作者又通過ChIP-PCR實驗，證實了PHR2可刺激ACP2基因的表達（圖8D）驰坊。
絲氨酸是光呼吸途徑中的重要代謝物匾二。為了確定絲氨酸對PR和PPUE的影響，作者進行了絲氨酸噴霧實驗拳芙。與對照相比察藐，經(jīng)絲氨酸處理的ACP2突變體在Pi-條件下的Asat Pi-和PPUE值均提高了約10%。PPUE的變化導致用2mM絲氨酸處理的ACP2突變體的地上部生物量比對照組增加了4%舟扎。因此分飞，作者得出結論，ACP2的表達與水稻中的PPUE相關睹限。ACP2還可以促進絲氨酸的積累譬猫，間接調節(jié)光呼吸（圖8E）。
研究結論
在本研究中羡疗，作者研究了由206個水稻品種組成的水稻群體在Pi充足(Pi+)和Pi饑餓(Pi-)處理下PPUE和凈光合速率(Asat)的自然變化染服。基于GWAS叨恨，確定了PPUE和AsatPi之間重疊的主效SNP柳刮，并通過遺傳、分子和生化技術驗證了候選基因ACP2的功能痒钝。這項研究為ACP2在缺磷期間通過改變絲氨酸代謝和細胞Pi循環(huán)來調節(jié)PPUE和Asat的遺傳機制提供了重要的見解秉颗。這些發(fā)現(xiàn)可以指導分子選擇性育種策略，以提高作物的磷酸鹽利用效率并提高糧食產(chǎn)量送矩。
