周五了，一周的收官之戰(zhàn)，我們繼續(xù)分享單細(xì)胞空間聯(lián)合分析的內(nèi)容阶冈，這一篇我們參考的文章在Multi-regional characterisation of renal cell carcinoma and microenvironment at single cell resolution闷尿，單細(xì)胞空間的聯(lián)合分析已經(jīng)運用到各種疾病腫瘤的研究。

圖片.png

收集一下細(xì)胞marker

• CD3D, CD3G, and CD3E（T細(xì)胞）
• CD68 and CD14（myeloid cells ）
• NCR1 and KLRC1（natural killer (NK) cells）
• CD79A and MS4A1（B 細(xì)胞）
• IGKC and IGHG1（漿細(xì)胞）
• TPSAB1 and TPSB2（肥大細(xì)胞）
• IRF7 and LILRA4（漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞）
• PLVAP and TIMP3（endothelial cells）
• ACTA2 and TAGLN（fibroblasts）
• SLC22A8 and GPX3（proximal tubular (PT) cells）
• DEFB1 and UMOD（non-PT epithelial cells）
• RCC tumour cells were identified within clusters that specifically expressed CA9 and harboured extensive copy number variations (CNVs) across their genomes, as inferred from scRNA-seq data（CNV推斷腫瘤細(xì)胞）

重點關(guān)注

• scRNA數(shù)據(jù)calling突變的方法和運用
• CellphoneDB與NicheNet聯(lián)合推斷有效細(xì)胞通訊的方法女坑。
• NMF尋找腫瘤meta-programme填具。

Abstract

腫瘤行為取決于癌細(xì)胞的致癌特性及其多細(xì)胞相互作用。 通過從 12 名腎腫瘤患者獲得的 270,000 個單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組和 100 個微解剖的完整外顯子組檢查這些依賴性匆骗。 從腫瘤核心劳景、腫瘤-正常界面、正常周圍組織和外周血的多個區(qū)域取樣組織碉就。 發(fā)現(xiàn) CD8⁺ T 細(xì)胞克隆型的主要空間位置在很大程度上定義了耗竭狀態(tài)盟广，體細(xì)胞瘤內(nèi)異質(zhì)性無法解釋克隆型異質(zhì)性。 從單細(xì)胞 RNA 測序數(shù)據(jù)中調(diào)用 mutation calling能夠譜系追蹤和推斷細(xì)胞的克隆性瓮钥。 分析發(fā)現(xiàn)了六個區(qū)分腫瘤細(xì)胞功能的meta-programme筋量。 在腫瘤-正常界面富集的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化meta-programme似乎通過巨噬細(xì)胞表達(dá)的 IL1B 進(jìn)行調(diào)節(jié)，可能形成治療靶點碉熄。

Main

Clear cell renal cell carcinoma (ccRCC) 是腎細(xì)胞癌 (RCC) 最常見的亞型桨武，約占 RCC 病例的 75% and the majority of deaths from kidney cancer。許多分析已經(jīng)表征了 ccRCC 的基因組landscope具被，揭示了重要的驅(qū)動事件玻募，例如 VHL 的雙等位基因失活（最常見的是伴隨染色體 3p 的丟失和 VHL 中的突變/表觀遺傳沉默），隨后是染色質(zhì)重塑和組蛋白修飾相關(guān)的突變基因 PBRM1一姿、BAP1 和 SETD2七咧。已經(jīng)系統(tǒng)地研究了 ccRCC 演變過程中啟動事件的時間。正如之前的多區(qū)域外顯子組測序研究所揭示的那樣叮叹，隨后突變事件的腫瘤內(nèi)異質(zhì)性 (ITH) 似乎是 ccRCC 的一個顯著特征艾栋。相比之下，ccRCC 在轉(zhuǎn)錄水平上的 ITH 了解較少蛉顽，部分原因是包含腫瘤微環(huán)境 (TME) 的多細(xì)胞生態(tài)系統(tǒng)的復(fù)雜性蝗砾。特別是，ccRCC TME 中惡性和非惡性細(xì)胞的表型異質(zhì)性及其與地理定位的關(guān)系仍然難以捉摸携冤。

ccRCC 是一種免疫細(xì)胞大量浸潤的癌癥類型悼粮。免疫檢查點阻斷 (ICB) 治療已被證明可有效提高患者的生存率，突出了探索 ccRCC 免疫微環(huán)境的重要性曾棕。先前的研究使用bulk測序來描述 ccRCC 的免疫landscope扣猫，這限制了它們剖析不同免疫細(xì)胞群的能力。使用質(zhì)譜流式細(xì)胞術(shù)的 ccRCC 綜合免疫圖譜揭示了 ccRCC 腫瘤生態(tài)系統(tǒng)中的免疫細(xì)胞多樣性翘地。單細(xì)胞 RNA 測序 (scRNA-seq) 的最新進(jìn)展及其在癌癥研究中的應(yīng)用徹底改變了我們對腫瘤細(xì)胞表型異質(zhì)性申尤、腫瘤免疫landscope癌幕、TME 的復(fù)雜性和可塑性以及 TME 中細(xì)胞間通訊的理解。具體而言昧穿，在 ccRCC 中勺远，最近的一項 scRNA-seq 研究提供了支持其起源于近端腎小管細(xì)胞的證據(jù)。其他研究利用 scRNA-seq 研究 ccRCC 的免疫狀況时鸵，主要關(guān)注 ICB 治療相關(guān)隊列和不同疾病階段胶逢，揭示與治療效果或疾病進(jìn)展相關(guān)的關(guān)鍵特征。

在考慮 TME 的異質(zhì)性時寥枝，感興趣的geographic regions 擴展了與突變 ITH 相關(guān)的區(qū)域宪塔。更廣泛的感興趣區(qū)域包括循環(huán)血液、腫瘤-正常界面或腫瘤假包膜（代表腫瘤與相鄰正常腎臟之間的邊界）囊拜、相鄰正常腎臟和腎周脂肪組織某筐。假包膜的纖維結(jié)締組織似乎在空間上限制了生長，侵襲與腫瘤分期和分級相關(guān)冠跷。由于 RCC 中的肥胖悖論南誊，腎周肥胖引起了人們的興趣，其中肥胖是診斷腎癌的最強風(fēng)險因素之一蜜托，但也與改善的腫瘤學(xué)結(jié)果有關(guān)抄囚。了解 ccRCC 在腫瘤細(xì)胞、各種免疫/基質(zhì)細(xì)胞方面的空間異質(zhì)性和進(jìn)化橄务，以及它們在更廣泛的 TME 中的相互作用仍然缺乏幔托。為了解決這個問題，對 12 名患者進(jìn)行了基于多區(qū)域的 scRNA-seq，對外周血、正常腎臟鲜棠、腫瘤核心的四個不同空間區(qū)域和腫瘤-正常界面進(jìn)行了采樣厢拭，同時對激光捕獲顯微切割進(jìn)行了局部詳盡的外顯子組測序(LCM) 衍生的腫瘤樣本吉执。

Results

Multi-region based genomic and single-cell transcriptomic profiling of RCC

對 12 名接受放射學(xué)診斷腎腫瘤手術(shù)切除的患者進(jìn)行了多區(qū)域基因組和單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析。在組織病理學(xué)檢查后，12 名患者中有 10 名的腫瘤被評估為 ccRCC，1 名（PD47172）為嗜酸細(xì)胞瘤史煎，1 名（PD44714）為大的良性厚壁囊腫。在每位患者中驳糯，從外周血篇梭、正常腎臟、腫瘤核心的四個不同空間區(qū)域以及腫瘤-正常界面采集組織酝枢。此外很洋，如果有的話，從腎周脂肪隧枫、正常腎上腺喉磁、腎上腺轉(zhuǎn)移和腫瘤血栓中取樣組織。在可以從這些樣本中檢索到足夠數(shù)量的活單細(xì)胞時官脓，我們使用 10x 平臺進(jìn)行了基于液滴的 5' scRNA-seq 和 T 細(xì)胞受體 (TCR) 富集协怒。同時，在執(zhí)行全外顯子組測序 (WES) 之前卑笨，使用 LCM 從每個含有腫瘤組織的區(qū)域解剖每個患者的微活檢樣本孕暇。 LCM 方法能夠通過詢問亞毫米大小的活檢來探索 ITH 的極限。根據(jù) WES 數(shù)據(jù)赤兴，確定了在 ccRCC 中報告為復(fù)發(fā)/驅(qū)動事件的基因組改變妖滔。九名 ccRCC 患者中有七名（一名 ccRCC 患者沒有數(shù)據(jù)）攜帶 VHL 突變，四名攜帶 PBRM1 突變桶良，三名攜帶 BAP1 突變座舍。在所有九名患者中都檢測到染色體 3p 的拷貝數(shù)丟失。嗜酸細(xì)胞瘤攜帶整個 1 號染色體的特征性拷貝數(shù)丟失（單細(xì)胞 + VDJ + 外顯子）陨帆。

Using scRNA-seq, we captured transcriptomes from approximately 270,000 cells after stringent quality control, which can be broadly categorised into 12 major cell types based on the expression of canonical marker genes（細(xì)胞定義的marker一定要收集一下）. As a result of our single cell isolation protocol,T cells (expressing CD3D, CD3G, and CD3E（T細(xì)胞）) were most abundant in our data, followed by myeloid cells (expressing CD68 and CD14（myeloid cells ）) and natural killer (NK) cells (expressing NCR1 and KLRC1（natural killer (NK) cells）) . We also captured significant numbers of other immune cell populations: B cells (expressing CD79A and MS4A1（B 細(xì)胞）), plasma cells (expressing IGKC and IGHG1（漿細(xì)胞）), mast cells (expressing TPSAB1 and TPSB2（肥大細(xì)胞）), and plasmacytoid dendritic cells (pDC; expressing IRF7 and LILRA4（漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞）). Apart from the immune compartment, four stromal cell types were identified in our data: endothelial cells (EC) (expressing PLVAP and TIMP3（endothelial cells）), fibroblasts (expressing ACTA2 and TAGLN（fibroblasts）), proximal tubular (PT) cells (expressing SLC22A8 and GPX3（proximal tubular (PT) cells）), and non-PT epithelial cells (expressing DEFB1 and UMOD（non-PT epithelial cells）). RCC tumour cells were identified within clusters that specifically expressed CA9 and harboured extensive copy number variations (CNVs) across their genomes, as inferred from scRNA-seq data（CNV推斷腫瘤細(xì)胞）. Next, we investigated the tissue of origin of the 12 major cell types and observed different tissue distributions of these cell types (four regions were combined in the analysis) 曲秉。

圖片.png

圖片.png

圖片.png

圖片.png

進(jìn)一步對研究中涵蓋的主要細(xì)胞compartments進(jìn)行了子聚類分析。 NK 細(xì)胞的subcluster產(chǎn)生了 14 個具有差異表達(dá)基因 (DEG) 和異質(zhì)組織來源的cluster疲牵。在這些cluster中承二，確定了眾所周知的 CD56 (NCAM1) 和 CD16 (FCGR3A) 表達(dá)populations。先天淋巴細(xì)胞 (ILC) cluster的特征在于 IL7R 和 FXYD7 的表達(dá)纲爸。兩個 NK cluster（cluster 2 和 6）顯示干擾素γ（IFNG）的高表達(dá)亥鸠，cluster 6 也高表達(dá)細(xì)胞因子 CCL4L2，并可能在正常腎上腺中富集识啦。確定了一些特征較少的 NK cluster负蚊，例如cluster 4，它特異性表達(dá) KRT81 和 KRT86袁滥。先前在肝細(xì)胞癌中報道了這種 NK 細(xì)胞亞群盖桥，但其功能尚不清楚。 B/漿細(xì)胞compartments被分為 13 個clusters题翻，其中確定了眾所周知的主要 B 細(xì)胞群揩徊，如na?ve, switched memory, and non-switched memory B cells∏对活化的 B 細(xì)胞（AREG^high 和 RHOB^high cluster）可能在腫瘤中富集塑荒，而 AREG^high cluster在腎周脂肪中更富集。與外周血相比姜挺，血漿 IgA齿税、IgG 和循環(huán)細(xì)胞（分別表達(dá) IGHA1、IGHG1 和 MKI67）被發(fā)現(xiàn)在組織中富集炊豪。

圖片.png

圖片.png

CD8⁺ T cell lineages reveal evolutionary trajectories and the influence of spatial location on exhaustion

T 細(xì)胞是數(shù)據(jù)中最豐富的細(xì)胞類型凌箕，大致分為兩個主要部分：CD4⁺ 和 CD8⁺ T 細(xì)胞（包括 gamma delta T 細(xì)胞）拧篮。 CD8⁺ T 細(xì)胞室的亞聚類導(dǎo)致鑒定出 18 個具有不同 DEG 和異質(zhì)組織位置的cluster∏２眨總的來說串绩，根據(jù)典型標(biāo)記基因的表達(dá)確定了典型的 CD8⁺ T 細(xì)胞clusters，它們代表了不同的 T 細(xì)胞功能狀態(tài)芜壁，包括幼稚礁凡、效應(yīng)、記憶慧妄、前功能障礙和功能障礙顷牌。發(fā)現(xiàn)高表達(dá) LEF1 和 CCR7 等基因的幼稚/中樞記憶 (CM) CD8⁺ T 細(xì)胞主要在外周血中富集。還鑒定了常駐記憶 (RM) T 細(xì)胞塞淹，因為它們表達(dá)組織駐留標(biāo)志物（即 ITGAE 和 CD69）窟蓝，并且主要在正常腎臟中富集。特別是窖铡，cluster 10 還高表達(dá) CXCL13疗锐，它可能在 B 細(xì)胞募集和三級淋巴結(jié)構(gòu)的形成中發(fā)揮潛在作用。發(fā)現(xiàn)cluster 6 高度表達(dá) FGFBP2 和 CX3CR1费彼，并且在外周血中大量富集滑臊，因此該cluster可能代表最近激活的效應(yīng)記憶 T 細(xì)胞（CD8⁺ T_EMRA）。根據(jù)包括 LAG3箍铲、TIGIT雇卷、PDCD1、HAVCR2 和 CTLA4 在內(nèi)的基因表達(dá)升高颠猴，確定了兩個耗盡的 T 細(xì)胞cluster（cluster 7 和 8）关划。有趣的是，發(fā)現(xiàn)第 8 cluster具有最高的 LAG3 表達(dá)翘瓮，并特異性表達(dá)免疫抑制細(xì)胞因子 IL10贮折。該cluster可能代表具有極高效應(yīng)子和功能障礙水平的 CD8⁺ T 細(xì)胞，它們通過產(chǎn)生 IL-10 發(fā)揮調(diào)節(jié)功能资盅。發(fā)現(xiàn)粘膜相關(guān)不變性 T (MAIT) 細(xì)胞高度表達(dá) TRAV1-2 和 IL7R调榄。鑒定出兩個循環(huán)細(xì)胞cluster：一個（表達(dá)MCM5和PCNA）代表細(xì)胞周期G1/S期的細(xì)胞，另一個（表達(dá)TOP2A和MKI67）代表G2/M期的細(xì)胞呵扛。除了傳統(tǒng)的 CD8⁺ T 細(xì)胞cluster每庆，還鑒定了兩個 gamma delta T 細(xì)胞cluster：gdT_Vd1（表達(dá) TRDV1）和 gdT_Vd2（表達(dá) TRDV2）。還對 CD4⁺ T 細(xì)胞群進(jìn)行了子聚類分析今穿，揭示了各種亞型缤灵，例如 CD4⁺ na?ve/CM 和 CD4⁺ 調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞 (Tregs) 及其不同的組織分布（細(xì)胞定義的marker真的要好好搜集一下）。

接下來，使用 Monocle 3 和 RNA velocyto分析對 CD8⁺ T 細(xì)胞進(jìn)行了偽時間軌跡分析腮出，不包括 gamma delta T 和循環(huán)cluster帖鸦。沿著假時間軌跡，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞毒性相關(guān)基因（即 KLRG1利诺、GNLY 和 GZMH）逐漸下調(diào)富蓄，而功能障礙相關(guān)基因（即 CTLA4、HAVCR2 和 LAG3）逐漸上調(diào)慢逾。典型的 T 細(xì)胞功能障礙前相關(guān)基因（即 CXCR4、GZMK 和 GZMA）最初被上調(diào)灭红，然后沿著假時間軌跡下降侣滩。因此，這個偽時間軌跡概括了 CD8⁺ T 細(xì)胞從細(xì)胞毒性狀態(tài)經(jīng)過功能障礙前狀態(tài)到功能障礙狀態(tài)的進(jìn)展变擒，同時耗竭程度逐漸升高君珠。假時間和疲勞評分之間的正相關(guān)也支持這種進(jìn)展。此外娇斑，將前 10 個擴展的 TCR 克隆型投影到軌跡上導(dǎo)致觀察到單個 TCR 譜系通常僅限于類似的表型狀態(tài)策添，而不是分布在整個軌跡上。在所有腫瘤中毫缆，發(fā)現(xiàn) 90% 的具有 23 個或更多細(xì)胞的克隆型被限制在假時間值范圍內(nèi)（Wilcoxon 檢驗唯竹，p < 0.05）。在多位患者中觀察到每個克隆超過 100 個細(xì)胞的高度擴增的 TCR 克隆苦丁，其中顯著高達(dá) 30% 的 CD8⁺ T 細(xì)胞可以源自單個克隆型浸颓。相比之下，與 CD8⁺ 群體中的 TCR 克隆型相比旺拉，CD4⁺ 群體中的 TCR 克隆型擴展較少产上。許多擴增最多的 CD8⁺ TCR 克隆具有相當(dāng)比例的循環(huán)細(xì)胞，但在較少消耗的克隆型中觀察到的情況除外蛾狗。這一發(fā)現(xiàn)表明 RCC 中高度耗竭的 T 細(xì)胞的增殖并未完全停止晋涣，類似于先前在黑色素瘤中的發(fā)現(xiàn).

圖片.png

圖片.png

檢查了血液中檢測到的 TCR 克隆型是否反映了在其他區(qū)域檢測到的那些。分析發(fā)現(xiàn)沉桌，無論克隆大小如何谢鹊，平均耗竭程度（推斷的假時間）和在外周血中檢測到 CD8⁺ TCR 克隆的概率都具有很強的反相關(guān)性，以至于在血液中很少檢測到耗竭的克隆型蒲牧。這一發(fā)現(xiàn)出乎意料撇贺，表明組織駐留的耗竭 CD8⁺ T 細(xì)胞克隆似乎不會在外周血中再循環(huán)。為了進(jìn)一步說明 T 細(xì)胞耗竭冰抢、克隆擴增及其組織分布之間的關(guān)系松嘶，根據(jù) CD8⁺ T 細(xì)胞是單細(xì)胞還是擴增以及它們的主要組織位置（血液、正常組織或腫瘤）對它們進(jìn)行分類挎扰。腫瘤中擴增的 T 細(xì)胞進(jìn)一步細(xì)分為出現(xiàn)在所有腫瘤區(qū)域的那些和不出現(xiàn)的（腫瘤同質(zhì)和異質(zhì)）翠订。值得注意的是巢音，CD8⁺ T 細(xì)胞的表型狀態(tài)，就耗竭程度而言尽超，顯示出對克隆擴增和組織位置的強烈依賴（所有 p < 0.05官撼，Tukey 檢驗）。同時似谁，一個腫瘤區(qū)域私有的克隆并不比不同區(qū)域之間共享的克隆更耗盡（p > 0.05傲绣，Tukey檢驗）。

圖片.png

圖片.png

Spatial localisation rather than intra-tumoural heterogeneity primarily influences CD8⁺ clonotypic heterogeneity

使用從 WES 數(shù)據(jù)中調(diào)用的體細(xì)胞突變巩踏，構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹來闡明我們研究中腫瘤中的克隆進(jìn)化和 ITH秃诵。總體而言塞琼，發(fā)現(xiàn)所有腫瘤克隆共享一個長主干但具有短分支菠净。這表明大多數(shù)體細(xì)胞突變在個體腫瘤中普遍存在，只有少數(shù)個體突變被檢測到彪杉。大多數(shù)檢測到的驅(qū)動突變和關(guān)鍵 CNV（即 VHL 突變和染色體 3p 的雜合性丟失 (LOH)）由單個腫瘤內(nèi)的所有腫瘤克隆共享毅往，因此位于系統(tǒng)發(fā)育樹的樹干上。此外派近，根據(jù)變異等位基因頻率分布攀唯，測序的絕大多數(shù) LCM 樣本都出現(xiàn)了克隆性。綜上所述构哺，WES 顯示數(shù)據(jù)隊列中腫瘤的 ITH 范圍是有限的革答。先前的研究通過比較在來自腫瘤不同空間定位的樣本中檢測到的體細(xì)胞突變，廣泛研究了各種癌癥的腫瘤內(nèi)遺傳異質(zhì)性曙强。然而残拐，體細(xì)胞異質(zhì)性對不同空間定位的局部腫瘤微環(huán)境的影響，尤其是抗腫瘤免疫反應(yīng)碟嘴，在很大程度上仍未得到表征溪食。在這里，系統(tǒng)地比較了個體腫瘤中 CD8⁺ T 細(xì)胞的體細(xì)胞突變娜扇、空間定位和 TCR 克隆型之間的關(guān)系错沃。出乎意料的是，發(fā)現(xiàn) T 細(xì)胞克隆型在不同的空間定位中具有高度異質(zhì)性和差異性雀瓢，即使在僅觀察到體細(xì)胞突變異質(zhì)性可忽略不計的腫瘤區(qū)域也是如此枢析。在腫瘤細(xì)胞上產(chǎn)生新抗原的體細(xì)胞突變被認(rèn)為是抗原呈遞時 T 細(xì)胞克隆擴增的驅(qū)動因素。分析表明 TCR 克隆擴增的異質(zhì)性更多地與 T 細(xì)胞在組織中的不同空間定位相關(guān)刃麸，而不是與體細(xì)胞突變的 ITH 相關(guān)醒叁。為了正式檢驗這一點，我們計算了 T 細(xì)胞克隆型距離與 1) 突變距離之間的相關(guān)性； 2）空間定位距離把沼。通過比較這兩種相關(guān)性啊易，我們發(fā)現(xiàn) CD8⁺ T 細(xì)胞中的 TCR 異質(zhì)性與空間定位而非體細(xì)胞異質(zhì)性的相關(guān)性更強（配對 Wilcoxon 檢驗，p < 0.05）饮睬。

Precise somatic mutation calling from scRNA-seq data

從轉(zhuǎn)錄組序列檢測單個細(xì)胞內(nèi)的體細(xì)胞突變可能有助于推斷它們的克隆關(guān)系租谈。盡管理論上可以從 scRNAseq 數(shù)據(jù)中調(diào)用突變，但目前沒有高精度的方法可用捆愁。在這里割去，開發(fā)了一種算法/pipeline來從 scRNA-seq 數(shù)據(jù)執(zhí)行從頭體細(xì)胞突變調(diào)用。簡而言之昼丑，在初始過濾步驟之前使用 bcftools 從單細(xì)胞 BAM 文件中調(diào)用突變劫拗，以去除單個細(xì)胞中存在的突變和不同細(xì)胞譜系之間共享的突變。在應(yīng)用二項式過濾器之前矾克，檢查了初始步驟中調(diào)用的所有位點的參考和變異等位基因計數(shù)。然后憔足，在對變體進(jìn)行注釋后應(yīng)用了一組最終的過濾指標(biāo)胁附。為了對突變調(diào)用方法進(jìn)行基準(zhǔn)測試，首先比較了從腫瘤細(xì)胞的 scRNA-seq 數(shù)據(jù)調(diào)用的體細(xì)胞突變與從腫瘤 WES 數(shù)據(jù)調(diào)用的那些突變滓彰。所有檢測到的突變都被歸類為真陽性（由突變調(diào)用者檢測到控妻，或未被突變調(diào)用者調(diào)用但在原始數(shù)據(jù)中有足夠的支持證據(jù)）、假陽性揭绑、假陰性或不確定（其中突變在沒有足夠的 WES 覆蓋來驗證呼叫）弓候。總體而言他匪，方法取得了良好的性能菇存，精度為 0.64（僅考慮外顯子突變時為 0.70），靈敏度為 0.53邦蜜。還能夠在 CD8⁺ T 細(xì)胞中對該方法進(jìn)行基準(zhǔn)測試依鸥，結(jié)果表明 84% 的被調(diào)用突變僅限于單個 TCR 克隆。這證實了預(yù)期的發(fā)現(xiàn)悼沈，即在 CD8⁺ T 細(xì)胞中調(diào)用的大多數(shù)突變僅限于克隆型贱迟，因為在胸腺成熟前 T 細(xì)胞克隆之間可以共享的突變數(shù)量非常有限。

使用這些突變調(diào)用絮供，研究了不同細(xì)胞類型表達(dá)的突變數(shù)量衣吠，這可能有助于揭示它們的克隆擴增程度。計算了具有一個壤靶、兩個缚俏、三個或三個以上突變的細(xì)胞比例。需要來自每個細(xì)胞譜系和患者的至少 100 個細(xì)胞來解釋稀有細(xì)胞群中缺乏辨別力的問題。正如預(yù)期的那樣袍榆，表達(dá)所謂突變的細(xì)胞數(shù)量最多的譜系是腫瘤細(xì)胞胀屿，這主要由譜系的已知克隆結(jié)構(gòu)來解釋，但也由于與正常細(xì)胞類型相比突變負(fù)擔(dān)增加的可能性包雀。出于類似的原因宿崭，基質(zhì)細(xì)胞通常沒有可辨別數(shù)量的細(xì)胞具有不止一種稱為突變的細(xì)胞。然而才写，我們觀察到大量表達(dá)突變的骨髓細(xì)胞葡兑，表明這些細(xì)胞中有相當(dāng)大的比例是無性系相關(guān)的。隨后是成纖維細(xì)胞和 CD8⁺ T 細(xì)胞（我們知道這些細(xì)胞是根據(jù) TCR 測序結(jié)果進(jìn)行克隆擴增的）赞草。極少比例的 CD4⁺ T 細(xì)胞表達(dá)突變讹堤，與基于 TCR 分析的低克隆度一致。

1.png

GX9DNGTFJ120J81WEYRSIMC.png

NQ%0(D7J)IGV4K2OL~RUTB3.png

K3H@~N@E8RJGHIB0FH0%X~B.png

2.png

2.png

Regional characterisation and evolution of myeloid populations

總體而言厨疙，從數(shù)據(jù)集中的 50,603 個骨髓細(xì)胞中捕獲了轉(zhuǎn)錄組洲守，在子聚類分析中將其分為 19 個clusters。首先根據(jù)marker的表達(dá)和細(xì)胞的組織來源對這些cluster進(jìn)行了注釋沾凄。cluster 1梗醇、2、3 和 4 主要存在于血液中撒蟀，CD14 高表達(dá)但缺乏 FCGR3A 表達(dá)叙谨，因此代表循環(huán)經(jīng)典單核細(xì)胞。cluster 5 代表循環(huán)非經(jīng)典單核細(xì)胞保屯，具有 FCGR3A 高表達(dá)但缺乏 CD14 表達(dá)手负。確定了三個樹突狀細(xì)胞 (DC) cluster：pDC、1 型和 2 型常規(guī) DC（cDC1 和 cDC2）姑尺，分別以 JCHAIN竟终、CLEC9A 和 CD1C 的特異性表達(dá)為特征。與其他區(qū)域相比股缸，cDC1 在三個 DC cluster中顯示出在腫瘤核心中的富集衡楞。發(fā)現(xiàn)以 TPSAB1 特異表達(dá)為特征的肥大細(xì)胞可能在腫瘤核心中富集，這與之前的報道一致敦姻。值得注意的是瘾境，根據(jù) CD163 和 C1QC 的高表達(dá)確定了 9 個巨噬細(xì)胞cluster（cluster 6-8、11-16）镰惦，反映了 RCC 中巨噬細(xì)胞群的顯著異質(zhì)性（細(xì)胞marker真的需要好好搜集一下）迷守。

為了進(jìn)一步表征數(shù)據(jù)集中的異質(zhì)巨噬細(xì)胞群，探索了 DEG 和九個巨噬細(xì)胞cluster的組織富集旺入。發(fā)現(xiàn)與其他正常組織相比兑凿，六個巨噬細(xì)胞cluster（cluster 11-16）優(yōu)先富集在腫瘤核心/界面中凯力，因此被定義為腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAM）。其余三個cluster（cluster 6礼华、7咐鹤、8）在正常組織中富集，被認(rèn)為是組織駐留巨噬細(xì)胞 (TR Mac)圣絮。在六個 TAM cluster中祈惶，MHC-II TAM（cluster 14）高表達(dá) HLA-DRB5、APOE 和 APOC1扮匠，與腫瘤-正常界面相比捧请，腫瘤核心更富集。相比之下棒搜，其他五個 TAM 簇在腫瘤核心和界面中顯示出相當(dāng)程度的富集疹蛉。促炎性 TAM（cluster 11）高度表達(dá)趨化因子 CXCL9/10 和 NLRP3 炎癥小體組裝激活劑 GBP1/5，表現(xiàn)出 M1 極化的主要特征力麸。 FN1⁺ TAM（cluster 15）高表達(dá)纖連蛋白 1 (FN1) 和scavenger receptor MARCO可款，此前曾報道其為腎癌中的特定巨噬細(xì)胞亞群。發(fā)現(xiàn) FN1⁺ TAM 可能在 ccRCC 中促腫瘤克蚂，這反映在髓源性抑制細(xì)胞 (MDSC) 特征和 M2 極化基因的高表達(dá)上筑舅。數(shù)據(jù)集中發(fā)現(xiàn)了一個 SPP1⁺ TAM cluster（cluster 16），該簇已在各種癌癥類型中有所報道陨舱，但在腎癌中不存在。有趣的是版仔，分析發(fā)現(xiàn) ccRCC 中的 SPP1⁺ TAM 表達(dá)了 GPNMB游盲，并顯示出與之前研究確定的 GPNMB+ TAM 高度相似÷福考慮到還確定了一個 GPNMB⁺ TAM cluster（cluster 15）并且可以在多個 TAM 簇中檢測到 GPNMB 的表達(dá)益缎，這一發(fā)現(xiàn)表明 SPP1⁺ TAM 可能代表 GPNMB⁺ TAM 的一個subset。除了表達(dá) SPP1然想，發(fā)現(xiàn) SPP1⁺ TAM 還表達(dá) TREM2 并具有高血管生成評分莺奔。 TREM2⁺ 巨噬細(xì)胞與各種生物學(xué)和病理過程有關(guān)，例如肥胖和癌癥（分析的很到位）变泄。

在三個 TR Mac cluster中令哟，TR Mac.2 高表達(dá)白細(xì)胞介素 IL1B 和表皮生長因子受體配體 AREG，這可能反映了其在體內(nèi)平衡組織修復(fù)中的可能作用妨蛹。 TR Mac.3屏富，顯示出SEPP1和MRC1的高表達(dá)并且在正常腎上腺中極其富集。 有趣的是蛙卤，TR Mac.3 表現(xiàn)出極高的 M2 表達(dá)和吞噬特征狠半，并顯示出與促腫瘤 TAM cluster（即 FN1⁺ TAM）相似的通路激活噩死。 在該數(shù)據(jù)集中，無法清楚地區(qū)分胚胎接種的組織巨噬細(xì)胞與單核細(xì)胞衍生的組織巨噬細(xì)胞.

接下來神年，探索了在研究中確定的不同 TR Mac 和 TAM cluster的潛在起源已维。使用 RNA 速度分析，發(fā)現(xiàn)從循環(huán)單核細(xì)胞到組織中的巨噬細(xì)胞有兩個明顯的定向流動：（1）經(jīng)典 mono.3 到 TR Mac.2 和（2）非經(jīng)典單核細(xì)胞到 TR Mac.1已日。 TR Mac.1 和 TR Mac.2 然后可能會在組織中產(chǎn)生其他巨噬細(xì)胞垛耳。為了確定巨噬細(xì)胞亞群與循環(huán)單核細(xì)胞的關(guān)系，利用體細(xì)胞突變進(jìn)行譜系追蹤捂敌，其方式類似于通過共享 TCR 克隆型確定 T 細(xì)胞表型狀態(tài)的關(guān)系艾扮。在這里，構(gòu)建了一個neighbour-joining tree來描述不同單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞簇之間的關(guān)系占婉，利用從 scRNA-seq 數(shù)據(jù)調(diào)用的體細(xì)胞突變泡嘴。分析發(fā)現(xiàn)循環(huán)單核細(xì)胞與組織中的巨噬細(xì)胞分離，與其他經(jīng)典單核細(xì)胞相比逆济，非經(jīng)典單核細(xì)胞（cluster 5）與組織中的巨噬細(xì)胞顯示出更密切的關(guān)系酌予。數(shù)據(jù)支持代表循環(huán)單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞之間中間狀態(tài)的非經(jīng)典單核細(xì)胞，大多數(shù)巨噬細(xì)胞似乎來自單核細(xì)胞祖細(xì)胞而不是卵黃囊起源奖慌。

3.png

U6635DP39HMBSKI(S`P@36F.png

1.png

2.png

Regional heterogeneity of endothelial cells, fibroblasts and epithelial cells

數(shù)據(jù)集中觀察到異質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞群抛虫。內(nèi)皮細(xì)胞 (EC) compartment的亞聚類顯示 11 個具有不同 DEG 和組織位置偏好的cluster。周細(xì)胞（cluster 11）简僧，以 RGS5 和 TAGLN 的表達(dá)為特征建椰，優(yōu)先富集在腫瘤核心中。發(fā)現(xiàn)一個cluster（cluster 9）在腎周脂肪中極度富集岛马，并高度表達(dá) TFF3 和 PDPN棉姐，因此代表淋巴 EC。其余 9 個cluster代表血管 ECs啦逆，其中cluster 10 代表循環(huán) EC伞矩，高表達(dá) TOP2A 和 MKI67。確定了三個潛在的腫瘤相關(guān) EC cluster：膠原蛋白 EC夏志、IGFBP3⁺ EC 和 ACKR1⁺ EC乃坤，因為它們在腫瘤組織中顯示出顯著富集。在這三個cluster中沟蔑，發(fā)現(xiàn)膠原蛋白 EC（表達(dá) COL4A1 和 COL15A1）在界面中更加豐富湿诊，這可能通過細(xì)胞外基質(zhì) (ECM) 產(chǎn)生與其他細(xì)胞相互作用。 ACKR1⁺ EC 特異性表達(dá)非典型趨化因子受體 ACKR1瘦材，其支持免疫細(xì)胞的粘附和組織遷移枫吧。發(fā)現(xiàn) IGFBP3⁺ EC 也表達(dá)高水平的免疫抑制酶 IDO1，暗示其在 TME 中的免疫調(diào)節(jié)作用宇色。發(fā)現(xiàn) CRHBP⁺ EC 和 IGF2⁺ EC 優(yōu)先富集在正常腎組織中九杂，而 DNASEL3⁺ EC 顯示在正常腎上腺中富集颁湖。

在sub-cluster分析中確定了九個成纖維細(xì)胞 (Fibro) cluster。 與 EC 類似例隆，發(fā)現(xiàn)一組成纖維細(xì)胞（cluster 8）高表達(dá)膠原相關(guān)基因（COL1A1 和 COL6A2）甥捺，并優(yōu)先富集在界面中。 這表明不同的產(chǎn)生 ECM 的基質(zhì)細(xì)胞傾向于在界面中富集和共定位镀层，發(fā)揮不同的功能镰禾，包括細(xì)胞外環(huán)境重塑和細(xì)胞間相互作用。 MMP 纖維的特征是基質(zhì)金屬蛋白酶 MMP2唱逢、補體因子 CFD 和 lumican LUM 的高表達(dá)吴侦。 發(fā)現(xiàn) MMP 纖維富含腎周脂肪和腎上腺。 Cluster 7 高度表達(dá) MYH11坞古、SNCG 和 RERGL备韧，因此被認(rèn)為是平滑肌細(xì)胞 (SMC)，如成纖維細(xì)胞痪枫。 發(fā)現(xiàn) SMC 樣纖維在正常腎組織中富集织堂。

數(shù)據(jù)集中的正常上皮細(xì)胞群表現(xiàn)出預(yù)期的多樣性，并在sub-clustering分析中分為 13 個clusters奶陈。鑒定了兩個近端腎小管 (PT) 細(xì)胞cluster（均表達(dá) NAT8 和 PDZK1IP1）：cluster 1 具有更高的金屬硫蛋白 MT1H 和 MT1G 表達(dá)易阳，因此可能代表 PT3 細(xì)胞，而cluster 2 可能代表 PT1/2 細(xì)胞吃粒，因為它表現(xiàn)出更高的PT2 標(biāo)記 SLC22A6潦俺，以及 PT1 標(biāo)記 SLC5A12 和 SLC5A2。兩個 Henle 環(huán) (LoH) cluster：cluster 3 代表升細(xì)肢 (ATL) 細(xì)胞徐勃，表達(dá) CLDN3 和 TACSTD2黑竞；cluster 8 代表厚升肢 (TAL) 細(xì)胞，其特征在于 SLC12A1 和 UMOD 的表達(dá)疏旨。確定了三個集合管 (CD) 上皮細(xì)胞cluster：A 型插入細(xì)胞（表達(dá) SLC4A1）、B 型插入細(xì)胞（表達(dá) SLC4A9）和 CD 主細(xì)胞（表達(dá) AQP2 和 FXYD4）扎酷。鑒定了特異性表達(dá) SLC12A3 的遠(yuǎn)曲小管 (DCT) 細(xì)胞（7 cluster）檐涝、高表達(dá) SLC8A1 和 CALB1 的連接小管細(xì)胞（10 cluster）、顯示 PSCA 和 KRT17 特異性表達(dá)的盆腔尿路上皮細(xì)胞（13 cluster）和足細(xì)胞（11 cluster） ) 專門表達(dá) PTGDS 和 PTPRO法挨。

1.png

2.png

RCC expression meta-programmes show differential abundance at the tumour-normal interface and affects prognosis

為了探索腫瘤細(xì)胞群中的腫瘤內(nèi)表達(dá)異質(zhì)性谁榜，首先使用非負(fù)矩陣分解 (NMF) 定義了由每個腫瘤中的共表達(dá)基因組成的腫瘤內(nèi)表達(dá)程序（關(guān)于NMF，我分分享了很多了凡纳，大家可以參考我的文章10X單細(xì)胞（10X空間轉(zhuǎn)錄組）分析之尋找目標(biāo)bases基因集（factors）（PNMF））窃植。這些表達(dá)程序代表了每個腫瘤中僅由腫瘤細(xì)胞亞群高度表達(dá)的基因模塊原朝，如代表性腫瘤 PD45816 中的 NMF 結(jié)果所示挖函。分析總共解剖了 10 個 ccRCC 腫瘤中的 45 個腫瘤內(nèi)表達(dá)程序。其中一些程序雖然是個體腫瘤中的亞群事件瓢姻，但被發(fā)現(xiàn)由不同的腫瘤共享，因此被定義為 ccRCC 中腫瘤細(xì)胞表達(dá)的meta-programme延塑。通過聚類分析確定了六個meta-programme绣张。第一個meta-programme (MP1) 的特征是 FOS 和 JUN 等基因的表達(dá)，因此代表了腫瘤細(xì)胞中與應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)的特征关带。 MP2 由近端腎小管 (PT) 細(xì)胞特異性表達(dá)的基因 (即 NAT8 和 ACSM2B) 組成侥涵。腫瘤細(xì)胞中 PT 特征的存在證實了先前的發(fā)現(xiàn)，即 PT 細(xì)胞是 ccRCC 的細(xì)胞類型宋雏。有趣的是芜飘，發(fā)現(xiàn)第三個meta-programme (MP3) 富含 TGFBI 和 MT2A 等與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化 (EMT) 相關(guān)的基因。這表明 MP3 可以概括 ccRCC 中的 EMT 過程磨总，這在之前的 RCC scRNA-seq 研究中尚未報道嗦明。 MP4 由 NEAT1 和 HCG18 等非編碼 RNA 基因組成，可能反映了一些壓力或細(xì)胞死亡 (CD) 相關(guān)的細(xì)胞狀態(tài)舍败。 MP5 的特點是表達(dá) MHC-II 相關(guān)基因招狸，如 CD74 和 HLA-DRA。 MP6中發(fā)現(xiàn)TOP2A邻薯、MKI67等基因裙戏，說明該meta-programme與腫瘤細(xì)胞增殖有關(guān)。

接下來厕诡，整合了來自十個腫瘤的腫瘤細(xì)胞累榜，通過去除批次效應(yīng)來減輕患者間的異質(zhì)性。通過sub-clustering和 DEG 分析灵嫌，驗證了腫瘤細(xì)胞中六個meta-programme的存在壹罚。計算了使用 NMF 破譯的六個meta-programme的基因評分，并將它們映射到腫瘤細(xì)胞的 UMAP 上寿羞。這再次反映了在腫瘤細(xì)胞中亞群的meta-programme的表達(dá)猖凛。有趣的是，發(fā)現(xiàn) PT 和 EMT 程序的表達(dá)顯示出反轉(zhuǎn)模式绪穆，這通過在 TCGA 樣本的bulk RNA-seq 數(shù)據(jù)中計算的 PT 和 EMT 分?jǐn)?shù)之間的反相關(guān)性得到進(jìn)一步證實辨泳。此外，我們發(fā)現(xiàn)與腫瘤核心相比玖院，EMT^high 腫瘤細(xì)胞在腫瘤-正常界面（腫瘤的前沿）更豐富菠红，這反映了 EMT 狀態(tài)代表腫瘤細(xì)胞更具侵襲性和遷移性的事實。 PT/EMT 程序的異質(zhì)表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的空間位置偏好相結(jié)合难菌，以個體腫瘤為例试溯。例如，在腫瘤 PD45815 中郊酒，發(fā)現(xiàn)當(dāng)通過 EMT 評分對腫瘤細(xì)胞進(jìn)行排序時遇绞，PT 程序是反向表達(dá)的键袱。同時，EMT^high腫瘤細(xì)胞傾向于定位在界面试读，而PT^high細(xì)胞相對更富集在腫瘤核心的R1和R2區(qū)域杠纵。最后，通過對 TCGA 樣本的bulk RNAseq 數(shù)據(jù)進(jìn)行評分钩骇，我現(xiàn)根據(jù) TCGA 研究顯示出最差預(yù)后的 TCGA 分子亞型 m3比藻，與其他亞型相比，顯示出顯著更高的 EMT 評分但較低的 PT 評分倘屹。這一發(fā)現(xiàn)表明我們的meta-programme可以成為患者生存的潛在指標(biāo).

1.png

2.png

5UF$__WRG6D@M18W1~VKR2L.png

Cellular interactions associated with spatial location reveal biological insights and promising therapeutic targets

為了表征 RCC 微環(huán)境中不同空間位置的細(xì)胞間通訊银亲，使用 CellPhoneDB 評估了正常腎臟、腫瘤-正常界面和腫瘤核心中主要細(xì)胞類型之間的細(xì)胞間相互作用纽匙。有趣的是务蝠，界面和腫瘤核心中 12 種主要細(xì)胞類型之間發(fā)生的細(xì)胞間相互作用的數(shù)量相對具有可比性，即使排除了那些涉及腫瘤細(xì)胞的相互作用烛缔，其數(shù)量也比正常腎組織中的數(shù)量高出約兩倍馏段。接下來，比較了在正常腎臟践瓷、腫瘤-正常界面和腫瘤核心的不同細(xì)胞類型上表達(dá)的特定配體-受體對介導(dǎo)的細(xì)胞-細(xì)胞相互作用院喜。首先，該分析揭示了腫瘤與正常微環(huán)境之間相互作用的顯著差異晕翠。例如喷舀，在 CD8⁺ T 細(xì)胞和 ECs 之間，發(fā)現(xiàn) EC 募集（CCL5-ACKR1）和免疫抑制（LGALS9-HAVCR2）信號在界面和腫瘤核心中更加活躍淋肾，反映了腫瘤中血管生成和免疫抑制水平的升高硫麻。到正常組織。其次樊卓，始終觀察到腫瘤邊緣和核心之間的差異拿愧。例如，ECs 和 CD8⁺ T 細(xì)胞之間分別由 PVR-TIGIT 介導(dǎo)的潛在免疫抑制相互作用在腫瘤核心中更活躍碌尔，而細(xì)胞生長/遷移相關(guān)的相互作用 IGF-IGF2R 在界面中更活躍浇辜。第三，界面處的腫瘤細(xì)胞表達(dá)轉(zhuǎn)錄物七扰，預(yù)測其介導(dǎo)獨特的細(xì)胞間相互作用，可能促進(jìn)腫瘤發(fā)生陪白。例如颈走，在交界中，骨髓細(xì)胞表達(dá)增強的細(xì)胞遷移相關(guān)信號咱士，可以與腫瘤細(xì)胞相互作用（THBS1-整合素α3β1）與腫瘤核心相比.

分析的結(jié)果表明立由，具有高 EMT 特征表達(dá)的腫瘤細(xì)胞（EMT^high 腫瘤細(xì)胞）優(yōu)先定位于腫瘤的前緣轧钓。這促使我們探索交界處是否存在任何可能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞 EMT 的活躍細(xì)胞間相互作用。使用 NicheNet（大家可以參考我的文章10X單細(xì)胞（10X空間轉(zhuǎn)錄組）通訊分析之NicheNet） 分析將來自 TME 中細(xì)胞的配體與腫瘤細(xì)胞中的 EMT 程序聯(lián)系起來锐膜。從該分析中毕箍，發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞表達(dá)的配體可能調(diào)節(jié)在腫瘤細(xì)胞上表達(dá)的大量 EMT 基因。特別是道盏，巨噬細(xì)胞來源的 IL1B 對這些 EMT 基因顯示出高度和廣泛的調(diào)節(jié)潛力而柑，可能是通過腫瘤細(xì)胞中表達(dá)的受體 IL1R1。有趣的是荷逞，發(fā)現(xiàn) IL1B 由 TR Mac.2 特異性表達(dá)媒咳，其再次在腫瘤正常界面優(yōu)先富集≈衷叮總之涩澡，研究結(jié)果表明，表達(dá) IL1B 的巨噬細(xì)胞 (TR Mac.2) 優(yōu)先存在于腫瘤-正常界面坠敷，通過產(chǎn)生 IL1B 上調(diào)腫瘤前沿腫瘤細(xì)胞中的 EMT 程序妙同。這種致癌途徑可能最終促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。

2.png

1.png

DISCUSSION

使用基于多區(qū)域的基因組和單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序來表征 ccRCC 的表型異質(zhì)性和多細(xì)胞生態(tài)系統(tǒng)膝迎。 總體而言粥帚，.研究解析了 ccRCC 的 TME 的綜合圖譜以及 ccRCC 中已建立的 ITH，包括腫瘤細(xì)胞和免疫/基質(zhì)細(xì)胞的表型分類弄抬，以及它們在 TME 中的細(xì)胞間通訊茎辐，主要與它們的空間定位有關(guān)。

擴增的 CD8⁺ TCR 克隆型內(nèi)的細(xì)胞在很大程度上受到耗竭評分的限制掂恕。最近在黑色素瘤中報道了類似的觀察結(jié)果拖陆。克隆型的表型限制可能主要與給定克隆的時間成熟有關(guān)，而不是環(huán)境因素懊亡，因為個體腫瘤在完全不同的狀態(tài)下都具有克隆型依啰。除了表型限制之外，還發(fā)現(xiàn)擴增的 TCR 克隆型在一個或多個宏觀腫瘤活檢中也經(jīng)常受到空間限制店枣。由于研究中觀察到的體細(xì)胞突變的 ITH 有限速警，因此無法通過暴露于不同的突變相關(guān)新抗原來完全解釋 TCR 克隆擴增的這種空間限制。我們無法在 TME 中定義任何其他可以預(yù)測這種克隆型空間異質(zhì)性的因素鸯两。感知到的 T 細(xì)胞克隆型的隨機定位可能是物理和環(huán)境因素驅(qū)動細(xì)胞從外周循環(huán)到腫瘤駐留的初始遷移的結(jié)果闷旧。可以采用縱向取樣策略或方法來確定準(zhǔn)確的 T 細(xì)胞系統(tǒng)發(fā)育钧唐，以詢問 T 細(xì)胞擴增和遷移的精確時間忙灼。對擴增 TCR 克隆區(qū)域限制的觀察是否在其他癌癥類型中更廣泛地被發(fā)現(xiàn)，可能需要部署類似采樣和測序策略的額外研究。

外周 TCR 用于非侵入性癌癥檢測和監(jiān)測的效用顯示出前景该园，尤其是在循環(huán)腫瘤 DNA 片段稀缺的 RCC 中酸舍。 雖然發(fā)現(xiàn)在血液和腫瘤區(qū)域都存在許多擴增的克隆型，但我們觀察到衰竭程度與在外周血中檢測到 TCR 克隆的概率呈負(fù)相關(guān)里初，以至于在血液中很少檢測到衰竭克隆型啃勉。 這一發(fā)現(xiàn)表明，一旦 T 細(xì)胞克隆浸潤到腫瘤中并經(jīng)歷從激活到功能障礙的表型轉(zhuǎn)變双妨，它們就很少再循環(huán)淮阐，這可能是由于 CD69 所證明的組織駐留表型。 因此斥难，對腫瘤反應(yīng)性 TCR 的外周采樣更有可能檢測到耗盡的腫瘤駐留克隆的前身枝嘶，而不是那些目前在腫瘤中活躍的克隆。

開發(fā)了一種策略 (deSCeRNAMut)哑诊，可以根據(jù)基于液滴的 scRNA-seq 數(shù)據(jù)準(zhǔn)確檢測不同細(xì)胞群中的體細(xì)胞突變群扶。使用許多過濾指標(biāo)（包括不同細(xì)胞類型譜系之間共享胚胎后突變的不可信性）消除了缺乏一致覆蓋、低讀取深度和容易出錯的測序讀取的主要挑戰(zhàn)镀裤。檢測到數(shù)據(jù)集中不同細(xì)胞譜系的體細(xì)胞突變竞阐，并確定了骨髓細(xì)胞中的高度克隆擴增。使用從這種方法調(diào)用的體細(xì)胞突變來構(gòu)建巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞中的相鄰連接樹暑劝，以推斷非經(jīng)典單核細(xì)胞可能是腎癌中循環(huán)單核細(xì)胞和大多數(shù)組織駐留巨噬細(xì)胞之間的中間狀態(tài)骆莹。設(shè)想在未來，使用空間成像技術(shù)來可視化一系列細(xì)胞類型中表達(dá)基因的突變担猛，將有助于破譯多細(xì)胞 TME 的系統(tǒng)發(fā)育組織幕垦。

EMT meta-programme是通過每個患者的腫瘤細(xì)胞亞群的表達(dá)來定義的，并且在研究中由多個 ccRCC 腫瘤共享傅联。 更豐富的腫瘤細(xì)胞群和幫助規(guī)避具有挑戰(zhàn)性的批次變化的方法的使用能夠發(fā)現(xiàn)這個以前未報告的特征先改。 EMT 程序在 ccRCC 腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)與 PT 程序（一種上皮表達(dá)特征）的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。 同時蒸走，ccRCC中的EMT^high腫瘤細(xì)胞傾向于定位于腫瘤-正常界面仇奶，這是腫瘤的前沿和遷移邊緣。 這些發(fā)現(xiàn)與頭頸癌的 scRNA-seq 研究中報道的結(jié)果相似比驻，反映了 EMT 的定義特征：細(xì)胞中上皮特征的喪失有利于促進(jìn)其遷移和侵襲能力.

分析細(xì)胞間相互作用揭示了與 ccRCC 的 TME 中不同空間定位相關(guān)的預(yù)測細(xì)胞間通訊的異質(zhì)性该溯。特別是，通過使用 NicheNet 連接配體和目標(biāo)基因别惦，發(fā)現(xiàn) IL1B狈茉，由在腫瘤-正常界面 (TR Mac.2) 富集的組織駐留巨噬細(xì)胞亞群特異性表達(dá)，可能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行 EMT掸掸。據(jù)報道氯庆，IL1B 的表達(dá)與 RCC 的腫瘤分期呈正相關(guān)，并且與招募到癌癥基因組圖譜的患者中 RCC 患者的較差預(yù)后相關(guān)。此外点晴，在 RCC 中抑制 IL1B 已顯示在 RCC 的同系小鼠模型中誘導(dǎo)腫瘤消退。 IL1B 阻斷劑也被證明可以減少動脈粥樣硬化患者的肺癌發(fā)生率悯周，目前正在幾項臨床試驗中研究其使用粒督。在我們的數(shù)據(jù)中，我們表明導(dǎo)致 IL1B 在 RCC 中不利作用的潛在機制通過巨噬細(xì)胞衍生的 IL1B 信號傳導(dǎo)促進(jìn) EMT 起作用禽翼。利用這一途徑可能在治療上是有用的屠橄。

Method(關(guān)注一些重點的方法)

Pseudotime inference, TCR analysis

2.png

Mutation calling from whole-exome sequencing

1.png

2.png

DNA mutational clustering

3.png

Mutation Calling from scRNA-seq Data（重點）

1.png

3.png

4.png

Inferring copy number variations based on scRNA-seq data

To effectively distinguish malignant and non-malignant cells, we inferred the large-scale chromosomal CNVs of single cells based on scRNA-seq data using the tool InferCNV (https://github.com/broadinstitute/inferCNV) with default parameters. Briefly, InferCNV first orders genes according to their genomic positions (first from chromosome 1 to X and then by gene start position) and then uses a previously described sliding-average strategy to normalize gene expression levels in genomic windows with a fixed length. Multiple putative non-malignant cells are chosen as the reference to further denoise the CNV result. In our analysis, we chose epithelial cells (including both PT and non-PT cells), endothelial cells and fibroblasts as the reference cell types to define a baseline in inferring CNVs.

Integrating and analyzing tumour cells from different patients

1.png

Cell-cell interaction analysis

$O0[5G]L22Y(Q787LPNGTR5.png

生活很好，有你更好