好了淑廊，這一篇我們繼續(xù)分享單細胞空間聯(lián)合分析的文章细溅，大業(yè)未完成，我們?nèi)孕枰ξ庠澹瑓⒖嘉恼略?a target="_blank">Spatiotemporal transcriptomics reveals pathogenesis of viral myocarditis,雖然是圣誕節(jié)贯吓，奈何單身狗懈凹，還是好好學(xué)習(xí)吧。
ABSTRACT
兒童和年輕人猝死的很大一部分是由于病毒性心肌炎宣决，一種心臟炎癥性疾病蘸劈。在這里昏苏，使用集成的單細胞和空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)來研究與呼腸孤病毒誘導(dǎo)的新生小鼠心臟心肌炎相關(guān)的宿主病毒相互作用的時間尊沸、空間和細胞異質(zhì)性。進一步分析了呼腸孤病毒感染的主要部位腸道贤惯，以確定病毒的細胞靶點和最終導(dǎo)致心肌炎的分子事件的時間順序洼专。數(shù)據(jù)深入了解先天免疫反應(yīng)的細胞類型特異性，以及招募循環(huán)免疫細胞的發(fā)炎心臟細胞的轉(zhuǎn)錄狀態(tài)孵构，包括誘導(dǎo)細胞焦亡的細胞毒性 T 細胞屁商。心肌區(qū)域和邊界區(qū)空間受限基因表達的分析確定了免疫介導(dǎo)的細胞類型特異性損傷和應(yīng)激反應(yīng)【笔總體而言蜡镶，觀察到與病毒性心肌炎相關(guān)的復(fù)雜的細胞表型和細胞相互作用網(wǎng)絡(luò)。
INTRODUCTION
病毒感染是心肌炎的最常見原因恤筛。由此產(chǎn)生的炎性心肌病可導(dǎo)致心律失常官还、擴張型心肌病和死亡。在人類中毒坛，病毒性心肌炎的研究具有挑戰(zhàn)性望伦，因為可用診斷測試的敏感性低林说、疾病的急性發(fā)作、疾病的局灶性以及復(fù)雜心臟組織中免疫-病毒相互作用的極端異質(zhì)性屯伞。在小鼠中腿箩，哺乳動物正腸病毒提供了靈活的模型系統(tǒng)×右。口服接種后珠移，1 型朗 (T1L) 呼腸孤病毒株最初感染胃腸道。幾天之內(nèi)末融，感染會擴散到身體的繼發(fā)部位剑梳，包括心臟，導(dǎo)致多達 50% 的感染發(fā)生心肌炎滑潘。然而垢乙，即使在這種小鼠模型中，病毒性心肌炎的分子發(fā)病機制也很難研究语卤，因為所涉及的心臟和免疫細胞類型的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)以及疾病的細胞追逮、空間和時間異質(zhì)性。因此粹舵，既沒有確定負(fù)責(zé)先天免疫反應(yīng)的細胞類型钮孵，也沒有確定體內(nèi)感染的細胞類型。同樣眼滤，心臟內(nèi)受感染和未受感染的旁觀者細胞的反應(yīng)尚未得到表征巴席。此外，適應(yīng)性免疫反應(yīng)的保護性與破壞性影響尚未量化诅需。在患有嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷 (SCID) 的小鼠身上進行的實驗表明漾唉，心肌損傷和心力衰竭不需要適應(yīng)性免疫反應(yīng)，但這些觀察結(jié)果并不排除免疫細胞介導(dǎo)的損傷在免疫活性小鼠中很重要的可能性堰塌。需要根據(jù)受感染心臟組織內(nèi)的時間和位置對所有細胞表型進行無偏見的表征赵刑，以解決這些知識空白。
在這里场刑，使用集成的單細胞和空間分辨 RNA 測序 (RNA-seq) 來研究感染后多個時間點呼腸孤病毒感染的新生小鼠心臟心肌過程的細胞和空間異質(zhì)性般此。還應(yīng)用這些技術(shù)來研究腸道內(nèi)呼腸孤病毒感染的先天反應(yīng)。此外牵现，對感染不引起心肌炎的呼腸孤病毒點突變體的小鼠心臟組織進行了時間序列單細胞 RNA-seq (scRNA-seq)铐懊。為了建立病毒嗜性，對非聚腺苷酸化病毒轉(zhuǎn)錄本進行了分子富集瞎疼。測量可以深入了解先天免疫反應(yīng)的細胞類型特異性科乎、腸道和心臟中病毒的趨向性以及參與炎癥細胞因子產(chǎn)生和循環(huán)免疫細胞募集的細胞類型的轉(zhuǎn)錄狀態(tài).對心肌區(qū)域和這些區(qū)域周圍邊界區(qū)的空間受限基因表達的分析確定了不同細胞類型（包括心肌細胞）的損傷和應(yīng)激反應(yīng)〕笊鳎總體而言喜喂，數(shù)據(jù)確定了呼腸孤病毒誘導(dǎo)的心肌炎期間空間受限的細胞相互作用和細胞類型特異性宿主反應(yīng)瓤摧。
RESULTS
Single-cell and spatial transcriptomics of reovirus T1L-infected neonatal mice hearts
為了闡明呼腸孤病毒誘導(dǎo)的心肌炎的發(fā)病機制，分析了從被呼腸孤病毒 T1L 株或模擬對照口服感染的新生小鼠收集的心臟組織玉吁。在感染后 (dpi) 4照弥、7 和 10 天生成了來自受感染心臟和模擬對照的 31,684 個細胞的 scRNA-seq 數(shù)據(jù)，以及來自受感染心臟的四個組織切片的 8,243 個空間轉(zhuǎn)錄組和來自同一窩的 4 dpi 和 7 dpi 模擬對照进副。單細胞轉(zhuǎn)錄組代表 18 種不同的細胞類型这揣，包括心肌細胞、心內(nèi)膜細胞影斑、心臟成纖維細胞给赞、內(nèi)皮細胞、壁細胞矫户、巨噬細胞片迅、中性粒細胞、NK 細胞皆辽、樹突細胞柑蛇、T 細胞和 B 細胞∏疲空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的聚類揭示了 7 dpi 呼腸孤病毒感染心臟中心肌區(qū)域和心肌區(qū)域周圍的邊界區(qū)域的不同轉(zhuǎn)錄程序耻台，這些區(qū)域?qū)?yīng)于通過 H&E 染色確定的組織損傷區(qū)域。 scRNA-seq 和空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)的結(jié)合能夠在空間環(huán)境中解析和可視化細胞類型和基因表達空另。由于病毒在傳播到包括心臟在內(nèi)的其他身體部位之前首先感染胃腸道盆耽，因此還在回腸上進行了 scRNA-seq 和空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)。在 1 dpi 和 4 dpi 從模擬和感染樣本中獲得了回腸的 7,695 個單細胞轉(zhuǎn)錄組和 8,027 個空間點轉(zhuǎn)錄組扼菠。
- 注：Supplementary Figure 1: Single-cell and spatial transcriptomics of cardiac tissue from reovirus-infected neonatal mice. A) Number of unique genes detected per cell (left), number of unique transcripts per cell (center), and percentage of mitochondrial transcripts (right) in cardiac scRNA-seq datasets from three stages after infection. B) Number of unique genes detected per cell (left), number of unique transcripts per cell (center), and percentage of mitochondrial transcripts (right) in cardiac spatial transcriptomics datasets from two stages after infection. C) UMAP plot of 31,684 single-cell transcriptomes from mock-infected and reovirus-infected hearts at 4, 7, and 10 days post-infection (dpi), clustered by gene expression and colored by cardiac cell type. Dotted lines show the cardiac cell types being grouped as broad endothelial cells and fibroblast cells. D) scRNA-seq UMAP plots showing expression of endothelial, and mural cell-specific markers used to define the Cdh5+ Kcnj8+ mesenchymal endothelial cells. E) Top 3 differentially expressed genes for cell types in heart scRNA-seq data. F) Spatial cell type proportions for myocarditic heart at 7 dpi derived by integrating scRNA-seq and spatial transcriptomics data using the Stereoscope method from scvi-tools.
為了準(zhǔn)確地識別回腸和心臟中未聚腺苷酸化的呼腸孤病毒轉(zhuǎn)錄本摄杂，對 scRNA-seq 文庫中捕獲的病毒片段進行了基于雜交的富集。在回腸中娇豫，總共捕獲了 13,100 個獨特的病毒轉(zhuǎn)錄本匙姜，病毒載量從 1 dpi 降低到 4 dpi畅厢。在 1 dpi 時冯痢，腸內(nèi)分泌細胞的感染細胞比例最高，其次是腸上皮細胞和杯狀細胞框杜，所有這些細胞都存在于腸道上皮中浦楣。淋巴內(nèi)皮細胞在 4 dpi 時被感染，這表明病毒通過淋巴引流到達血液咪辱，從而使病毒能夠傳播到身體的二級部位振劳，包括心臟。從 T1L 感染的心臟中的 392 個細胞中捕獲了 2,762 個獨特的病毒轉(zhuǎn)錄本油狂。病毒載量首先從 4 dpi 增加到 7 dpi历恐，然后從 7 dpi 減少到 10 dpi寸癌，與對整個心臟進行的病毒滴度測定一致。心內(nèi)膜細胞和內(nèi)皮細胞是 4 dpi 時最常感染的細胞類型弱贼，這表明心室腔內(nèi)壁的心內(nèi)膜細胞和心臟脈管系統(tǒng)內(nèi)的內(nèi)皮細胞是心臟中最先被感染的細胞之一蒸苇。在 7 dpi 心臟中檢測到中性粒細胞、樹突細胞和 T 細胞中的病毒轉(zhuǎn)錄物吮旅。這一觀察結(jié)果表明溪烤，抗原呈遞細胞和免疫細胞可能有助于感染擴散到身體的其他器官。之前已經(jīng)討論了受感染的樹突狀細胞在全身感染期間將更多呼腸孤病毒帶到心臟組織中的作用庇勃。
- 注：Supplementary Figure 2: Single-cell and spatial transcriptomics of ileum tissue from reovirus-infected neonatal mice. A) Number of unique genes detected per cell (left), number of unique transcripts per cell (center), and percentage of mitochondrial transcripts (right) in ileum scRNA-seq datasets (top row) and ileum spatial transcriptomics datasets (bottom row) from two stages after infection. B) Top 3 differentially expressed genes for cell types in ileum scRNA-seq data. C) Spatial transcriptomes of ileum tissue sections from mock-infected and reovirus-infected mice at 1 and 4 dpi. D) Knee plot showing host gene specific UMI counts (left) and viral UMI counts in the scRNA-seq droplets classified as either empty droplets or with viable/dead cells across ileum scRNA-seq samples. E) scRNA-seq UMAP plots showing total viral UMI counts per cell before and after xGen-based viral transcript enrichment on ileum samples. F) Knee plot showing host UMI counts (left) and viral UMI counts in the scRNA-seq droplets classified as either empty droplets or with viable/dead cells across heart scRNA-seq samples. G) scRNA-seq UMAP plots showing total viral UMI counts per cell before and after xGen-based viral transcript enrichment on heart samples.
Endothelial cells are primed with basal interferon response and play an important role in initiating host innate immune response
為了檢測感染后心臟組織中的早期轉(zhuǎn)錄差異檬嘀，進行了差異基因表達分析（DGEA，4 dpi 模擬與感染心臟责嚷，方法該分析揭示了感染心臟中 226 個基因的顯著上調(diào)（雙側(cè)威爾科克森檢驗鸳兽， log fold-change > 1.0 and p-value < 0.01)，包括與干擾素-β途徑罕拂、干擾素信號傳導(dǎo)和先天免疫反應(yīng)相關(guān)的基因贸铜。
為了量化和比較不同細胞類型的早期感染反應(yīng)的總體幅度，計算了一個基因模塊評分（感染反應(yīng)評分聂受，IR蒿秦，上面選擇的 226 個基因的模塊）。不同細胞類型在沒有感染的情況下的 IR 比較顯示蛋济，與其他心臟細胞類型相比棍鳖，內(nèi)皮細胞中的 IR 較小，但較高碗旅。作為對感染的反應(yīng)渡处，觀察到所有心臟細胞類型的 IR 增加，但觀察到內(nèi)皮細胞的 IR 增加最大祟辟。這些數(shù)據(jù)表明医瘫，心臟脈管系統(tǒng)內(nèi)襯的內(nèi)皮細胞是宿主抵御病毒感染的重要發(fā)起者。使用空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)比較 IR 分?jǐn)?shù)顯示旧困，感染心臟在 4 dpi 和 7 dpi 中的 IR 分?jǐn)?shù)增加醇份，心肌區(qū)域的分?jǐn)?shù)最高。鑒于觀察到心臟內(nèi)的內(nèi)皮細胞在沒有感染的情況下具有最高的 IR 評分吼具，我們query這種觀察是心臟組織獨有的還是更普遍的現(xiàn)象僚纷。為此，使用了 Tabula Muris scRNA-seq 小鼠圖譜并估計了 10 個不同器官的約 16,000 個細胞的 IR拗盒，包括五種主要細胞類型（上皮細胞怖竭、成纖維細胞、內(nèi)皮細胞陡蝇、平滑肌細胞和間充質(zhì)細胞）和組織痊臭。該分析表明哮肚，內(nèi)皮細胞在小鼠的所有組織中始終具有最高的 IR 評分。這些結(jié)果表明广匙，血管內(nèi)皮細胞在大多數(shù)組織內(nèi)具有更高的先天反應(yīng)基因的基礎(chǔ)表達绽左，這可能使這些細胞對血液和淋巴管內(nèi)的病毒傳播做出反應(yīng)。
為了研究呼腸孤病毒感染的主要部位回腸中的細胞類型特異性 IR艇潭，與模擬感染的回腸細胞相比拼窥，在 1 dpi 時對呼腸孤病毒感染進行了 DGEA，發(fā)現(xiàn) 438 個基因顯著上調(diào)（雙側(cè) Wilcoxon測試蹋凝，對數(shù)倍數(shù)變化 > 1.0 和 p 值 < 0.01)鲁纠，與干擾素-β 通路、干擾素信號傳導(dǎo)和先天免疫反應(yīng)有關(guān)鳍寂。使用這個由 438 個基因組成的模塊計算了 IR 評分改含，并觀察到與其他回腸細胞類型相比，腸細胞和腸內(nèi)分泌細胞的基礎(chǔ) IR 評分更高迄汛。腸上皮細胞在感染后進一步表現(xiàn)出最高的 IR 評分增加捍壤，其次是腸內(nèi)分泌細胞、內(nèi)皮細胞和淋巴細胞鞍爱【榫酰空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的 IR 分?jǐn)?shù)的比較進一步支持了對 scRNA-seq 數(shù)據(jù)的分析，顯示感染回腸在 1 dpi 和 4 dpi 中的 IR 分?jǐn)?shù)增加睹逃，其中腸黏膜和絨毛中的分?jǐn)?shù)最高盗扇。腸上皮細胞必須耐受腸腔中存在的共生微生物，但仍對侵入性病原體有反應(yīng)沉填。數(shù)據(jù)分析表明疗隶，為了實現(xiàn)這一目標(biāo)，腸道上皮細胞中的腸上皮細胞和腸內(nèi)分泌細胞以基礎(chǔ)干擾素反應(yīng)為基礎(chǔ)翼闹，并在病毒感染早期階段的先天免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用斑鼻。
- 注：Supplementary Figure 3: Innate immune response across cell types in heart and ileum and transcriptional signatures for Cxcl9-high endothelial cells and cytotoxic T cells. A) Volcano plot showing differentially expressed genes (two-sided Wilcoxon Rank-Sum test, -log2 fold change > 2.0 and p-value < 10-4) for reovirus-infected cardiac cells as compared to mock at 4 dpi. Dotted lines show the thresholds for significantly enriched genes (red). B) Top GO terms for genes enriched in reovirus-infected cardiac cells as compared to mock at 4 dpi. C) Heatmap showing the expression of the 25 most upregulated genes in the reovirus-infected ileum as compared to mock at 1 dpi. D) Top GO terms for genes enriched in reovirus infected cells ileum as compared to mock-infected ileum at 1 dpi. E) Volcano plot showing differentially expressed genes (two-sided Wilcoxon Rank-Sum test, -log2 fold change > 2.0 and p-value < 10-4) upregulated in Cxcl9-high inflamed endothelial cells from heart at 7 dpi. Dotted lines show the thresholds for significantly enriched genes (red). F) Top GO terms of interest enriched for genes upregulated in Cxcl9-high endothelial cells in myocarditic heart at 7 dpi. G) Volcano plot showing differentially expressed genes (two-sided Wilcoxon Rank-Sum test, -log2 fold change > 2.0 and p-value < 10-4) upregulated in cytotoxic T cells at 7 and 10 dpi. Dotted lines show thresholds for significantly enriched genes (red). H) Top GO terms of interest enriched for genes upregulated in cytotoxic T cells in myocarditic hearts at 7 and 10 dpi. I-L) Spatial transcriptomics maps of cardiac tissue sections from reovirus-infected mice pups at 7 dpi showing I) The expression of genes enriched in Cxcl9-high inflamed endothelial cells. J) Gene module scores for four GO terms of interest enriched in Cxcl9-high inflamed endothelial cells. K) The expression of genes enriched in cytotoxic T cells from myocarditic heart. L) Gene module scores calculated for four GO terms of interest enriched in cytotoxic T cells from myocarditic heart.
Cytotoxic T cells recruited by inflamed endothelial cells induce pyroptosis
為了更詳細地探索內(nèi)皮細胞表型的異質(zhì)性，在 scRNA-seq 數(shù)據(jù)中重新聚集了 9,786 個心臟內(nèi)皮細胞猎荠。觀察到四種不同的表型 i) 表達 Nr2f2 和 Aplnr 的未發(fā)炎的靜脈內(nèi)皮細胞主要來源于模擬對照坚弱，ii) 表達 Gja4、Gja5 和 Cxcl12 的動脈內(nèi)皮細胞來源于模擬和感染的心臟法牲，iii) 發(fā)炎的內(nèi)皮細胞來源于感染4 dpi 和 10 dpi 時的心臟史汗，以及 iv) 7 dpi 時來自心臟的發(fā)炎內(nèi)皮細胞，b 發(fā)炎的內(nèi)皮細胞簇表達 Isg15拒垃、Iigp1 和 Ly6a。 DGEA acro 內(nèi)皮亞群顯示瓷蛙，發(fā)炎的 7 dpi 內(nèi)皮細胞過度表達趨化因子 Cxcl9 和 Cxcl10悼瓮，它們通常參與免疫調(diào)節(jié)和炎癥過程戈毒，但更具體地參與 T 細胞的募集。與這一觀察結(jié)果一致横堡，7 dpi 心臟中的 T 細胞表達 Cxcr3 受體埋市。 Cxcl9 高發(fā)炎的內(nèi)皮細胞還表達高水平的細胞粘附標(biāo)記基因 Vcam1 和 Icam1，這有助于血液中的免疫細胞附著在內(nèi)皮細胞上命贴。內(nèi)皮細胞還過表達 MHC 1 類（H2-D1 和 H2-K1）和 MHC 2 類（Cd74）分子道宅，表明它們參與抗原呈遞給適應(yīng)性免疫細胞。內(nèi)皮細胞已被證明參與抗原呈遞和塑造感染性心肌炎中的細胞免疫反應(yīng)胸蛛。GO富集分析確定了進一步支持 Cxcl9 高內(nèi)皮細胞參與白細胞細胞粘附污茵、T 細胞活化、白細胞介素 8 產(chǎn)生的調(diào)節(jié)以及對細胞因子葬项、腫瘤壞死因子泞当、干擾素-γ、白細胞介素-1 的反應(yīng)的途徑民珍。
觀察到內(nèi)皮細胞參與 T 細胞的募集襟士，促使更詳細地探索受感染心臟中 T 細胞的異質(zhì)性。為此嚷量，重新聚集了 2,205 個 T 細胞單細胞轉(zhuǎn)錄組陋桂，產(chǎn)生了代表三種 T 細胞亞型的四個subclusters，i) Cd8+ 細胞毒性 T 細胞蝶溶，ii) Cd4+ 輔助 T 細胞章喉，和 iii) 幼稚 T 細胞航夺。在受感染心臟內(nèi)鑒定的細胞毒性和輔助 T 細胞均表達 Cxcr3 受體告唆、干擾素-γ (Ifng) 和趨化因子 Ccl3、Ccl4焊傅、Ccl5部蛇、S100A4 和 S100A6摊唇，表明它們參與了中性粒細胞的募集和激活。 Cxcr3 受體選擇性結(jié)合趨化因子 Cxcl9 和 Cxcl10涯鲁，促進趨化性巷查。細胞毒性 T 細胞代表大多數(shù)浸潤性 T 細胞，并表達 Prf1抹腿、Gzma岛请、Gzmb 和 Gzmk，編碼與顆粒酶依賴性胞吐作用途徑相關(guān)的裂解分子警绩。這些細胞還表達腫瘤壞死因子超家族基因 Fasl 和 Tradd崇败，它們參與 Fas 誘導(dǎo)的細胞死亡途徑。 Fasl 與靶細胞表面的 Fas 結(jié)合并介導(dǎo)程序性細胞死亡信號傳導(dǎo)和 NF-κB 激活。 Fasl-Fas 凋亡通路在調(diào)節(jié) T 細胞后室、促進對自身抗原的耐受性方面很重要缩膝，并且是細胞毒性 T 細胞殺死靶細胞的一種機制。 GO 富集分析確定了涉及中性粒細胞活化和脫粒岸霹、外源肽抗原的加工和呈遞疾层、白細胞介素 1 介導(dǎo)的信號通路、腫瘤壞死因子介導(dǎo)的信號通路贡避、NIK/NF-κB 信號通路痛黎、對凝集素的細胞反應(yīng)和細胞凋亡過程的通路。
細胞死亡相關(guān)通路的下游基因標(biāo)記 Pycard刮吧、Acer2湖饱、Zbp1 和 Caspases Casp1、Casp4 和 Casp12 在 Cxcl9 高內(nèi)皮細胞中富集皇筛。這增加了細胞毒性淋巴細胞導(dǎo)致炎癥內(nèi)皮細胞死亡的可能性琉历。內(nèi)皮細胞的 GO 富集證實了細胞死亡途徑的上調(diào)，包括參與凋亡過程的半胱氨酸型內(nèi)肽酶活性的激活水醋、外源性凋亡信號通路的正調(diào)節(jié)和細胞焦亡途徑旗笔。我們評估了空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)以驗證 Cxcl9 高炎癥內(nèi)皮細胞和 T 細胞之間的直接相互作用，并且它們確實在心肌區(qū)域和邊界 zo 中在空間上共定位拄踪。計算了與本體相關(guān)基因的基因模塊評分蝇恶，這些基因富含 Cxcl9 高內(nèi)皮細胞和細胞毒性 T 細胞，用于空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)惶桐，發(fā)現(xiàn)這些途徑在心肌區(qū)域富集撮弧。總的來說姚糊，這些結(jié)果表明心臟血管內(nèi)皮細胞充當(dāng)血心屏障贿衍，并在宿主適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的募集和激活中發(fā)揮重要作用。這些細胞可能是呼腸孤病毒誘導(dǎo)的心肌炎期間直接病毒損傷和免疫介導(dǎo)損傷的目標(biāo)救恨。心臟內(nèi)微脈管系統(tǒng)的損傷可能會導(dǎo)致血液供應(yīng)減少贸辈，并成為隨后與病毒直接復(fù)制無關(guān)的心肌細胞死亡的一個因素。
Spatially restricted gene expression in myocarditic tissue
心肌炎的空間受限性質(zhì)促使探索呼腸孤病毒感染心臟中基因表達的空間異質(zhì)性肠槽。對空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的初始聚類揭示了心肌區(qū)域擎淤、與這些心肌區(qū)域相鄰的組織以及心室組織的其余部分的不同轉(zhuǎn)錄程序。這些區(qū)域的差異空間基因表達分析揭示了浸潤免疫細胞的細胞類型標(biāo)志物（T細胞的 Cd8a 和 Gzma秸仙，NK 細胞的 Nkg7嘴拢，中性粒細胞的 S100a8）、炎癥標(biāo)志物（Cd52 和 Lyc62）的心肌區(qū)域的上調(diào)寂纪，以及趨化因子和細胞因子（Ccl5席吴、Ccl2、Cxcl9 和 Cxcl10）。對相應(yīng) scRNA-seq 數(shù)據(jù)的分析表明抢腐，Ccl5 由樹突細胞表達姑曙，Ccl2 由成纖維細胞表達襟交，Cxcl9 和 Cxcl10 由內(nèi)皮細胞表達迈倍。 Ccl2 的受體 Ccr2 在巨噬細胞中表達，表明成纖維細胞在心肌炎癥期間使用 Ccl2-Ccr2 軸進行巨噬細胞募集捣域，如最近所述啼染。這些分析表明產(chǎn)生趨化因子的內(nèi)皮細胞和產(chǎn)生細胞因子的成纖維細胞將免疫細胞募集到心肌組織。
對心肌區(qū)域和邊界區(qū)的仔細檢查顯示其他感興趣的基因上調(diào)焕梅，包括 Timp1迹鹅、AW112010、Clu贞言、Ankrd1斜棚、Gm4841 和 Ctss。 Timp1 在 scRNA-seq 數(shù)據(jù)中主要由發(fā)炎的成纖維細胞表達该窗。 Timp1 是基質(zhì)金屬蛋白酶 (MMP) 的天然抑制劑弟蚀，這是一組參與細胞外基質(zhì)降解的肽酶。先前報道了在心力衰竭惡化的患者中 Timp1 的上調(diào)酗失。 AW112010 在 scRNA-seq 數(shù)據(jù)中由發(fā)炎的內(nèi)皮細胞和成纖維細胞表達义钉，之前被發(fā)現(xiàn)編碼干擾素誘導(dǎo)的小分泌蛋白，在對感染和炎癥的先天免疫反應(yīng)中起關(guān)鍵作用规肴。在數(shù)據(jù)中捶闸，Clu 在來自所有心臟細胞類型的發(fā)炎細胞的一個子集中表達，并且先前顯示在嚴(yán)重心肌炎期間上調(diào)拖刃。 Ctss 主要在單核細胞中表達删壮，編碼一種蛋白酶，用于將抗原蛋白降解為肽兑牡，以在 MHC II 類分子上呈遞央碟。已證明易感小鼠中免疫蛋白酶體的形成增加會影響病毒性心肌炎中抗原肽的產(chǎn)生和隨后的 T 細胞活性。對邊界區(qū)上調(diào)基因的 GO 分析揭示了與對腫瘤壞死因子的反應(yīng)发绢、對白細胞介素-1 的反應(yīng)和 NIK/NF-κB 信號傳導(dǎo)相關(guān)通路的富集硬耍。
為了進一步了解免疫細胞浸潤對心肌區(qū)域周圍細胞類型組成的影響，評估了細胞類型比例作為與組織中心肌區(qū)域距離的函數(shù)边酒。 我們量化了心肌區(qū)域经柴、邊界區(qū)和心室組織其余部分的細胞類型比例，發(fā)現(xiàn) Cxcl9 高內(nèi)皮細胞墩朦、Ccl2+ 成纖維細胞坯认、T 細胞、樹突細胞和 NK 細胞的比例在 心肌區(qū)，心肌區(qū)心肌細胞比例減少牛哺。
為了了解在心肌區(qū)和邊界區(qū)富集的 Ccl2+ 成纖維細胞的表型陋气，從 scRNA-seq 數(shù)據(jù)集中重新聚集了 9,192 個成纖維細胞，并在 7 dpi 時從受感染的心臟中鑒定了一組不同的發(fā)炎 Ccl2+ 成纖維細胞引润。 這
287 個 Ccl2+ 成纖維細胞表達高水平的 MHC 1 類（H2-D1 和 H2-K1）巩趁、粘附標(biāo)記基因 Vcam1 和 Icam1，以及其他基因淳附，如 Serpina3g议慰、C3 和 Ms4a4d。 此外奴曙，這些成纖維細胞還表達 Casp1 和 Casp4别凹，表明響應(yīng)細胞毒性 T 細胞的細胞pyroptosis activity。
為了研究炎癥對心肌細胞中心肌細胞的影響洽糟，從 scRNA-seq 數(shù)據(jù)集中重新聚集了 502 個心肌細胞炉菲，并確定了三種不同的表型：i) 表達 Myl2、Myl3 和 Mb 的心室肌細胞來自模擬和感染的心臟在 4 和 10 dpi坤溃，ii) 表達標(biāo)記物 Myl4拍霜、Myl7 和 Nppa 的心房肌細胞在 4 dpi 和 10 dpi 時源自模擬和受感染的心臟，以及 iii) 在 7 dpi 時來自感染心臟的發(fā)炎肌細胞表達先天免疫基因 Isg15浇雹、Igtp 和 Iigp1沉御。與來自感染心臟的 4 dpi 和 10 dpi 的心肌細胞相比，7 dpi 感染心臟的發(fā)炎肌細胞具有不同的表型昭灵，后者與來自模擬 299 感染心臟的心肌細胞聚集在一起吠裆。為了找到存在于邊界區(qū)的肌細胞的轉(zhuǎn)錄特征，我們選擇了在 scRNA-seq 數(shù)據(jù)中富含心肌細胞并在邊界區(qū)上調(diào)的基因烂完。該分析顯示邊界區(qū)的心肌細胞表達 Gm4841试疙、Gm12185、Mt1抠蚣、Mt2祝旷、Ankrd1 和 Nppb。 Gm4841 和 Gm12185 是響應(yīng)干擾素 304 γ 產(chǎn)生的干擾素誘導(dǎo)基因嘶窄。 Mt1 和 Mt2 基因調(diào)節(jié)炎癥并支持小鼠缺血性心肌病的重塑怀跛。 Ankrd1 是一種肌細胞存活因子，發(fā)生在特發(fā)性擴張型心肌病患者的晚期心臟病期間柄冲。最近的一項研究表明吻谋，在心肌梗塞后第 1 天，表達 Ankrd1 的心肌細胞位于邊界區(qū)现横±焓埃總之阁最，我們的分析表明，組織損傷定位于心肌區(qū)域骇两，在邊界區(qū)進行重塑程序活躍速种，并證明了空間分辨分子測量對研究病毒性心肌炎的重要性。
- 注：Supplementary Figure 4: Cell-type-specific gene expression in myocarditic tissue and differences in viral tropism between reovirus wildtype (WT) and mutant (K287T) infection. A) Volcano plot showing differentially expressed genes (two-sided Wilcoxon Rank-Sum test, -log2 fold change > 0.5 and p-value < 10-2) upregulated in myocarditic regions in heart at 7 dpi as defined by unsupervised clustering on spatial transcriptomes. Dotted lines show the thresholds for significantly enriched genes (red). B) UMAP plot for heart scRNA-seq cells and spatial transcriptomic maps for reovirus-infected heart at 7 dpi showing the expression of Ccl2 ligand and Ccr2 receptor. C) Volcano plot showing differentially expressed genes (two-sided Wilcoxon Rank-Sum test, -log2 fold change > 0.5 and p-value < 10-2) upregulated in the border zone of the infected heart at 7 dpi, as defined by unsupervised clustering on spatial transcriptomes. Dotted lines represent thresholds for significantly enriched genes (red). D) scRNA-seq UMAP plots showing the expression of six genes of interest enriched in myocarditic regions and the border zone. E) Top GO terms of interest for genes upregulated in Cxcl9-high endothelial cells in myocarditic heart at 7 dpi. F) Spatial transcriptomic maps for myocarditic heart at 7 dpi showing the expression of six myocyte-specific genes upregulated in the border zone. G) UMAP plot of 9,192 fibroblast cell transcriptomes from mock-infected and reovirus-infected hearts at 4, 7, and 10 dpi colored by fibroblast cell subtypes (phenotypes) (top) and condition (bottom). H) Heatmap showing top-five differentially expressed genes (Wilcoxon test, log2 fold-change > 1.0 and p-value < 0.01) for fibroblast cell subtypes. I) UMAP plot showing the expression of genes upregulated in Ccl2+ fibroblast cells. J) UMAP plots showing the gaussian kernel density of scRNA-seq cells across mock-infected, reovirus-WT infected, and reovirus-K287T infected hearts. K) Bar plot showing mean viral transcript count (UMIs) across stages for mock-infected, reovirus-WT infected, and reovirus-K287T infected hearts. L) Dot plot showing the percentage of cells with non-zero viral transcripts and the mean viral transcript counts (UMIs) across cell types.
Reduced adaptive immune cell infiltration associated with reovirus K287T mutant
最近報道了一種呼腸孤病毒突變體 T1L S4-K287T (K287T)低千，它對編碼外衣殼蛋白 sigma-3 (σ3) 的 S4 基因進行了點突變配阵，這是一種雙鏈 (ds) RNA 結(jié)合多功能蛋白，可促進病毒蛋白合成和促進病毒進入
部件栋操。 K287T 成功感染心臟闸餐，但產(chǎn)生的病毒滴度相對于呼腸孤病毒野生型 (WT) 而言較低饱亮，并且不會引起心肌炎矾芙。為了驗證發(fā)現(xiàn)，在 4近上、7 和 10 dpi 時對 K287T 感染的心臟進行了額外的 scRNA-seq剔宪。總共生成了 16,771 個單細胞轉(zhuǎn)錄組壹无，并將這些數(shù)據(jù)與來自 w 型 (WT) 病毒的數(shù)據(jù)進行了整合葱绒。對于幾乎所有細胞類型，K287T 感染的細胞與 WT 感染的細胞聚集在一起斗锭。進行了病毒轉(zhuǎn)錄本富集地淀，并比較了 WT 和突變體感染細胞中的病毒轉(zhuǎn)錄本。在 4 dpi 時發(fā)現(xiàn)病毒轉(zhuǎn)錄本 WT 和 K287T 病毒的水平相似岖是，但在 7 dpi 時 K287T 的病毒載量降低了 60 倍帮毁，與病毒滴度測定一致。然后比較了由于 K287T 和 WT 感染引起的卡片細胞類型之間的早期宿主反應(yīng)豺撑。 K287T 誘導(dǎo)了與 WT 呼腸孤病毒相似水平的先天免疫反應(yīng)烈疚，內(nèi)皮細胞在 4 dpi 時心臟評分的增幅最高。分析了 K287T 和 WT 感染的心臟之間 Cxc 高內(nèi)皮細胞和免疫細胞的細胞類型組成聪轿，發(fā)現(xiàn) 7 dpi K287T 感染的心臟在 7 dpi 中浸潤心臟的 Cxcl9 高內(nèi)皮細胞和免疫細胞顯著減少WT 感染的心臟爷肝。這些差異與與 K287T 突變體相關(guān)的炎癥和組織損傷水平降低一致。結(jié)果表明陆错，即使感染了 K287T 突變病毒灯抛，大多數(shù)類型的復(fù)制減少，心臟內(nèi)皮細胞也會產(chǎn)生強大而強大的先天免疫反應(yīng)音瓷。病毒從感染細胞中清除 7 dpi 和較弱的適應(yīng)性宿主反應(yīng)然后導(dǎo)致突變 K287T 感染心臟的非心肌表型对嚼。
DISCUSSION
50 多年來，病毒性心肌炎一直被認(rèn)為是導(dǎo)致心力衰竭的原因外莲，但它仍然是一種研究猪半、診斷和治療的具有挑戰(zhàn)性的疾病兔朦。在這里，使用集成的 spa 和單細胞 RNA-seq 來剖析新生小鼠模型中 reovir 誘導(dǎo)的急性心肌炎的時間磨确、空間和細胞異質(zhì)性沽甥。在感染后的多個時間點檢測了回腸和心臟組織。我們研究了被感染的細胞類型乏奥，以及先天性和適應(yīng)性免疫反應(yīng)的細胞和空間異質(zhì)性摆舟。生成總共十三個 scRNA-seq 和八個空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集，跨越兩個有機體四個時間點和三個感染條件邓了。我們的數(shù)據(jù)提供了對導(dǎo)致呼腸孤病毒誘導(dǎo)的心肌炎的分子事件的年表的詳細見解恨诱。口服接種后骗炉，呼腸孤病毒 T1L 在 1 dpi 內(nèi)感染腸道上皮中的腸內(nèi)分泌和腸上皮細胞照宝。這些細胞會產(chǎn)生有效的先天免疫反應(yīng)來抑制病毒復(fù)制。然后病毒會在 4 dpi 內(nèi)感染腸道淋巴細胞句葵，并通過淋巴引流厕鹃，病毒通過血流傳播到身體的次要部位，包括心臟乍丈。大約 4 dpi剂碴，病毒會感染心臟血管系統(tǒng)的內(nèi)皮細胞。內(nèi)皮細胞在心臟中產(chǎn)生強大的先天免疫反應(yīng)轻专。在有癥狀的情況下忆矛，發(fā)炎的內(nèi)皮細胞會分泌趨化因子來招募循環(huán)免疫細胞，包括細胞毒性 T 細胞请垛。組織浸潤的細胞毒性 T 細胞然后在心肌組織中誘導(dǎo)細胞焦亡催训。總體而言叼屠，實驗揭示了與呼腸孤病毒誘導(dǎo)的心肌炎相關(guān)的細胞表型和細胞間相互作用的動態(tài)和空間異質(zhì)網(wǎng)絡(luò)瞳腌。
集成的高通量 scRNA-seq 和空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)最近被用于研究心臟發(fā)育和心臟病，但在工作之前镜雨，這些方法尚未用于研究病毒性心肌炎嫂侍。 Bulk RNA-seq 先前已被用于分析與病毒性心肌炎相關(guān)的感染、炎癥和組織損傷的轉(zhuǎn)錄組學(xué)特征荚坞。然而挑宠，這些整體水平的方法并沒有捕捉到宿主對感染反應(yīng)的細胞和空間異質(zhì)性。 scRNA-seq 最近已用于研究小鼠模型中柯薩奇病毒 B3 (CVB3) 誘導(dǎo)的心肌炎颓影。拉斯拉多等人各淀。報告骨髓細胞的炎癥表型、成纖維細胞在重塑和炎癥中的作用诡挂，以及細胞毒性 T 細胞在 CVB3 誘導(dǎo)的心肌炎中的作用碎浇。然而临谱，本研究未探討病毒靶向的心肌細胞類型、基礎(chǔ)干擾素反應(yīng)和先天免疫反應(yīng)的細胞類型異質(zhì)性以及轉(zhuǎn)錄程序的空間限制奴璃。
以前的研究聲稱病毒復(fù)制對心臟細胞的直接細胞病變作用是呼腸孤病毒誘導(dǎo)的心肌炎期間心臟損傷的主要原因悉默。值得注意的是，發(fā)現(xiàn)呼腸孤病毒感染可在缺乏 B 和/或 T 細胞的免疫缺陷小鼠中誘發(fā)心肌炎苟穆，表明呼腸孤病毒誘導(dǎo)的心肌炎并不嚴(yán)格需要適應(yīng)性免疫抄课。然而，這些先前的實驗并不排除宿主適應(yīng)性免疫反應(yīng)可以增強或限制免疫能力小鼠中宿主損傷的性質(zhì)和數(shù)量的可能性雳旅，正如我們的工作所建議的那樣跟磨。研究了先天免疫反應(yīng)在呼腸孤病毒誘導(dǎo)的心肌炎中的保護作用。然而攒盈，在我們的工作之前抵拘，基礎(chǔ) I 型 IFN 和先天免疫反應(yīng)的時間、空間和細胞類型異質(zhì)性尚未得到表征沦童。宮本等人仑濒。和斯圖爾特等人。在體外比較了心肌細胞和成纖維細胞之間 I 型 IFN 的基礎(chǔ)水平偷遗，但這些研究并未包括構(gòu)成復(fù)雜心臟組織的所有細胞類型。
病毒性心肌炎的時空特征對于了解對疾病病理學(xué)很重要的病毒和宿主因素至關(guān)重要驼壶。 這些知識最終可能會導(dǎo)致新的診斷方法和更好的治療方法氏豌。 幾種經(jīng)常感染人類的病毒可引起心肌炎，包括腺病毒热凹、腸道病毒泵喘、愛潑斯坦-巴爾病毒、人類皰疹病毒 6般妙、細小病毒 B19 和 SARS-CoV2纪铺。 我們在這里實施的方法可用于未來的研究，以研究這些病毒誘導(dǎo)的心肌炎的誘導(dǎo)碟渺、病理生理學(xué)和病程有何不同鲜锚。 希望我們在這里提供的數(shù)據(jù)和分析程序?qū)⒊蔀榇祟愇磥硌芯康膶氋F資源。
Method
Single-cell RNAseq data processing and visualization
Spatial transcriptomics data processing, integration, analysis, and visualization
生活很好苫拍，有你更好
