前言：
挑選到滿意的sgRNA之后，就要開始正式實(shí)驗(yàn)，而正式實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞轉(zhuǎn)染部分我則不會(huì)再講泞莉，直接到最關(guān)鍵的部分：挑取單克隆。
實(shí)驗(yàn)正文
1. 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
常規(guī)試劑船殉、儀器：轉(zhuǎn)染試劑鲫趁，流式分選，雙抗利虫，Incucyte
2. 實(shí)驗(yàn)步驟--將sgRNA插入pSpCas9質(zhì)粒中
（1）Day 0: 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染
還是同之前一樣挨厚，將sgRNA-pSpCas9質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到目的細(xì)胞中，此時(shí)根據(jù)可根據(jù)細(xì)胞不同糠惫，選用不同的轉(zhuǎn)染試劑或轉(zhuǎn)染方法疫剃。
（2）Day 2/3: 篩選
根據(jù)使用的Cas9骨架質(zhì)粒的不同，篩選的方式也不同：
（1）帶抗生素抗性基因的使用抗生素進(jìn)行篩選硼讽；
（2）帶熒光標(biāo)簽的細(xì)胞則可使用流式篩選：
在這里我選擇方法（2）
（1）事先告知流式分選工作人員細(xì)胞類型巢价、細(xì)胞大小、熒光類型等信息固阁，以便提前調(diào)試儀器壤躲；
（2）首先將細(xì)胞消化為單細(xì)胞狀態(tài)；
（3）使用帶雙抗的培養(yǎng)基吹打混勻您炉，過了40/70 μm篩后立刻放置于冰上；以相同的手法役电，準(zhǔn)備一管未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞為陰性對照赚爵；
（4）篩選后的細(xì)胞立刻置于冰上運(yùn)輸回細(xì)胞房；
（5）根據(jù)細(xì)胞的活力不同法瑟，對于皮實(shí)的細(xì)胞冀膝，可直接跳到下一步操作；對于人胚胎干細(xì)胞之類的較弱細(xì)胞霎挟，則需要種在24窝剖，12或者6孔板中擴(kuò)增后，再進(jìn)行下一步酥夭，用這種方法赐纱，在篩選后第二天仍可觀察到熒光脊奋。
（3）挑取單克隆
篩選過后的細(xì)胞則按照1個(gè)/孔的密度種到96孔板中，放在Incucyte之類活細(xì)胞工作站監(jiān)控疙描，每天拍2-3張全孔掃描照片诚隙，7天后查看96孔板單克隆生長狀況，反查第1天時(shí)的照片起胰，確認(rèn)是單細(xì)胞即可久又。以下是Incucyte的結(jié)果示例（因?yàn)檫B續(xù)視頻有點(diǎn)大，因此放上day1和day10的圖）：
（4）Day 10（根據(jù)不同的細(xì)胞效五，選擇不同培養(yǎng)時(shí)間）
將挑中的單克隆消化后接種到24孔板中擴(kuò)大培養(yǎng)等待后續(xù)驗(yàn)證地消。
（5）沒有可全孔掃描拍照的儀器怎么辦
Incucyte是挑單克隆的利器，可全孔掃描的儀器也可使用畏妖，由于可以追蹤到最早期的細(xì)胞個(gè)數(shù)脉执，因此能確認(rèn)細(xì)胞克隆是來自于單細(xì)胞。但I(xiàn)ncucyte之類的儀器并不是所有平臺(tái)都有瓜客，此時(shí)只能用老方法進(jìn)行單克隆細(xì)胞挑仁释摺：
（1）找一個(gè)細(xì)菌接種環(huán)，將熒光細(xì)胞圈住谱仪，只消化這一顆細(xì)胞玻熙，之后種到96孔板中（難度很大）；
（2）將細(xì)胞消化后，經(jīng)由流式篩選腕巡，使用無限稀釋法概页，稀釋獲取單細(xì)胞（很費(fèi)96孔板，工作量很大）枚尼；
（3）將細(xì)胞消化后，在熒光顯微鏡下砂吞，使用槍頭吸取熒光細(xì)胞署恍，種到96孔板中（難度仍然大，但是可操作性強(qiáng)）蜻直；這個(gè)方法需要實(shí)驗(yàn)室擁有在超凈臺(tái)中的熒光顯微鏡盯质。
試過之后，覺得方法（3）容易實(shí)現(xiàn)一些概而，可如下圖所示：
（1）將顯微鏡滅菌呼巷；
（2）挑取綠色熒光細(xì)胞一個(gè)，挪到旁邊的空白孔種放出赎瑰，確認(rèn)為單個(gè)后再吸起放入96孔板中王悍；
對于轉(zhuǎn)染難度低且皮實(shí)的細(xì)胞來說，挑取單克隆可以說是在我這個(gè)CRISPR-Cas9敲除方案中最難的一個(gè)實(shí)驗(yàn)餐曼，非常之關(guān)鍵压储。
