早先的研究通過scRNA-seq分析了GBM內的不同細胞成分，定義了三種主要的惡性細胞狀態(tài)隘截，以及不同GBM亞型的GBM免疫細胞的情況扎阶。但缺乏在GBM生態(tài)系統(tǒng)中對這些已定義的細胞成分進行原位空間映射。
空間多組學的發(fā)展使研究人員能夠對細胞類型和細胞狀態(tài)進行精細的原位空間映射婶芭。2024年4月22號东臀，來自以色列魏茨曼科學研究所的Itay Tirosh教授團隊通過空轉 10x Visium （19個GBM樣本）和空間蛋白組CODEX（12個GBM樣本）對GBM開展了全面和深度的空間原位分析，揭示了GBM由結構化區(qū)域和無序區(qū)域組成犀农；結構化區(qū)域包含了與缺氧相關的五個層次的組織結構惰赋；發(fā)現(xiàn)了經典組織病理學無法識別的區(qū)域特征。
01?膠質瘤的空間轉錄組學
研究人員分析了13個GBM切片和6個IDH突變的膠質瘤切片赁濒。將這些樣本與public的Visium數(shù)據(jù)集的13個GBM切片整合在一起。首先孟害，通過平均每個染色體區(qū)域的基因表達來進行拷貝數(shù)偏差(CNA)推斷拒炎，將spot歸類為主要惡性、大部分非惡性或混合挨务。推測CNA包括GBM和少突膠質瘤的特征击你，并與癌癥豐富的區(qū)域顯著相關。
其次耘子，在有多個切片的病例中果漾，通過每個樣本和每個腫瘤聯(lián)合的Leiden聚類來聚類spot，并通過基因集濃縮分析來注釋聚類谷誓。
02?GBM表達異質性的重復模式
為了定義反映表達異質性核心模式的表達程序，比較了通過Leiden聚類或 NMF在單個GBM樣本中識別的492個基因表達程序吨凑。研究人員發(fā)現(xiàn)了顯著的相似性捍歪，隨后根據(jù)基因重疊定義了14個MP户辱，每50個基因稱為元程序（metaprogram，MP）糙臼，8?個惡性MP和6個非惡性MP庐镐。
非惡性MP包括Mac（巨噬細胞/小膠質細胞）和Inflammatory-Mac（炎性巨噬細胞/中性粒細胞）、Oligo（少突膠質細胞）变逃、Vasc（內皮細胞和周細胞）必逆、Neuron和Reactive-Ast（反應性星形膠質細胞）。
在八種惡性MP中揽乱，五種直接映射到單細胞GBM狀態(tài)：MES缺氧(MES2)名眉、MES (MES1)、NPC樣凰棉、OPC樣和AC樣损拢。神經發(fā)育相關的惡性MP（NPC樣、OPC樣和AC樣）與相應非惡性細胞類型特征的特征具有高度基因重疊撒犀。另外三種惡性空間 MP 包括：（1）星形細胞樣間充質MP（MES-Ast）福压，富含與神經膠質瘤腫瘤微管相關的基因；（2）增殖和代謝(Prolif-Metab)或舞，富含增殖相關基因和代謝基因荆姆；（3）染色質調節(jié)(Chromatin-Reg)，富含染色質和轉錄調節(jié)因子以及NPC相關基因映凳。?
03?CODEX構建GBM空間單細胞圖譜
雖然 Visium 通過覆蓋大多數(shù)基因提供全面的數(shù)據(jù)胞枕，但它的空間分辨率較低，不能捕獲稀有或空間分散的細胞類型和細胞狀態(tài)魏宽。比如研究人員并沒有發(fā)現(xiàn)細胞周期相關的MP腐泻，這就提出了一種可能性：即在大多數(shù)情況下，一個處在周期活躍的細胞被很多其他類型的細胞所包圍队询，從而稀釋了細胞周期信號派桩。同樣，T細胞和B細胞很少在一個spot中占主導地位蚌斩，它們的低mRNA含量進一步限制了它們的信號铆惑，因此研究人員無法通過無監(jiān)督分析識別T細胞或B細胞相關的MP。為更完整的構建GBM的空間結構送膳，研究人員通過CODEX（40個抗體panel）鑒定了所有主要分化的非惡性細胞類型和主要的惡性細胞狀態(tài)员魏，包括了占比較低的T細胞和B細胞。
04?Visium和CODEX的聯(lián)合分析
為了能夠直接比較CODEX和Visium數(shù)據(jù)叠聋，研究人員使用STalign對兩個數(shù)據(jù)集進行空間對齊撕阎，然后將CODEX數(shù)據(jù)從單個細胞轉換為與Visium相當?shù)膒seudospots，并將這些數(shù)據(jù)分配給MP碌补。使用單細胞CODEX數(shù)據(jù)能夠檢查 Visium大小的pseudospots內細胞的完整組成虏束，還能夠評估每個狀態(tài)的細胞密度棉饶，使研究人員獲得了高分辨率下的細胞類型關系以及對應的基因表達特征。
05?Visium和CODEX聯(lián)合構建完整的GBM空間圖譜
研究人員分析了Visium定義的MP的鄰近關系以及對應的CODEX定義的細胞類型的鄰近空間關系镇匀。通過分析同一個MP的鄰近的MP數(shù)量照藻，GBM組織空間可以分為結構化區(qū)域和無序區(qū)域。進一步發(fā)現(xiàn)了結構化區(qū)域中占比最多的是缺氧性的惡性細胞（MES-Hyp）汗侵，說明了缺氧是GBM有序結構組織的驅動因素幸缕。
接下來研究人員分析了不同區(qū)域大小和分辨率下的細胞類型的互作關系。發(fā)現(xiàn)了區(qū)域越大晰韵，結構化和無序兩類區(qū)域中細胞互作的頻率相似发乔，但是在更低分辨率下，結構化的區(qū)域中細胞互作的頻率顯著高于無序的區(qū)域宫屠。在結構化的惡性細胞區(qū)域列疗，巨噬細胞與MES-Hyp惡性細胞顯著互作，而T細胞與MES-Ast惡性細胞顯著互作浪蹂。說明了結構化區(qū)域和無序區(qū)域在空間高分辨率下存在顯著差異的細胞互作關系抵栈。
06?空間多組學揭示新的病理組織學特征
研究人員整合分析了每個樣本中上述的細胞互作關系，構建了結構化區(qū)域的樣本的空間組成層次坤次，發(fā)現(xiàn)了與缺氧相關的5個層次結構古劲，包括：
L1: core hypoxia/necrosis；L2: hypoxia-associated缰猴；L3: angiogenic response/immune hub产艾；L4: malignant neurodevelopmental states；L5: brain parenchyma
每個層中都含有特征性的細胞類型及互作關系網絡滑绒。特別是發(fā)現(xiàn)了其中的L1闷堡、L3、L4和L5可以對應到經典的組織病理學分類特征上疑故。但值得注意的是杠览，經典組織病理學或 IVY Gap 轉錄程序無法區(qū)分缺氧相鄰層 (L2) 和局部缺氧的小區(qū)域，L2 不直接映射到組織病理學特征纵势。因此空間單細胞分辨率上對細胞狀態(tài)的分析重新定義了經典的組織病理學特征踱阿。
總結討論
此項研究結合空間轉錄組學10x Visium、空間單細胞蛋白組CODEX定義了膠質瘤細胞狀態(tài)并揭示了它們的組織空間關系钦铁。由于Visium的分辨率有限软舌，以前的研究只能定義空間鄰域，通常代表細胞狀態(tài)和細胞類型的混合體牛曹，從空間轉錄組學中解析單個細胞狀態(tài)和細胞類型仍然具有挑戰(zhàn)性佛点。為了彌補這些局限性，研究人員對鄰近的組織切片進行了CODEX分析躏仇，使研究人員能夠檢測到低豐度的細胞類型恋脚，并以單細胞分辨率揭示Visium spot的組成腺办。總之焰手，這項研究對膠質瘤進行了深度的空間描述糟描，在多個尺度上刻畫了空間細胞組織，這為我們對膠質瘤微環(huán)境生態(tài)位的理解增加了一個空間維度书妻，并可能有助于未來治療方法的發(fā)展船响。
[參考文獻]Greenwald AC, Darnell NG, Hoefflin R, et al. Integrative spatial analysis reveals a multi-layered organization of glioblastoma. Cell. 2024 Apr 16:S0092-8674(24)00320-9.
