EMSA實驗原理
凝膠阻滯或電泳遷移率變動實驗（Electrophoretic mobility shift assay公壤，EMSA）
是一種研究DNA結(jié)合蛋白質(zhì)和相關(guān)的DNA結(jié)合序列相互作用的技術(shù)，可用于定性和定量分析届囚≡道牛基于DNA-蛋白質(zhì)或RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體在聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）中有不同遷移率的原理，當(dāng)轉(zhuǎn)錄因子與特異的DNA或RNA結(jié)合后，其在PAGE中的遷移率將小于未結(jié)合核蛋白轉(zhuǎn)錄因子的DNA安皱，從而檢測到活化的與DNA或RNA結(jié)合的蛋白轉(zhuǎn)錄或調(diào)節(jié)因子。
- Protein：細(xì)胞提取物中含有的目的轉(zhuǎn)錄因子核蛋白艇炎，因細(xì)胞會提前處理以使得這個核蛋白是激活的
- Specific competitor：標(biāo)記探針100倍量的未標(biāo)記探針
- Mutant/non competitor：標(biāo)記探針100倍量的未標(biāo)記突變探針
- Probe：同位素標(biāo)記的探針
- super-shift：上移酌伊，抗體、轉(zhuǎn)錄因子缀踪、探針形成的復(fù)合物分子量更大了居砖，在電泳中的遷移速率下降虹脯，因此其條帶會出現(xiàn)上移。加入抗體后的反應(yīng)也就被稱為super-shift反應(yīng)
結(jié)果理解
（來自《養(yǎng)鯉魚》微信公眾號）
- 第1列陰性對照反應(yīng)：僅標(biāo)記探針悯蝉。按照理論归形，探針的位置應(yīng)該位于最下方；否則提示探針里有雜質(zhì)鼻由，影響電泳結(jié)果暇榴。
- 第2列常規(guī)反應(yīng)：激活的目的轉(zhuǎn)錄因子的核蛋白＋標(biāo)記探針。探究目的轉(zhuǎn)錄因子是否和探針結(jié)合蕉世，是實驗?zāi)康摹?
- 第3列探針冷競爭反應(yīng)：激活的目的轉(zhuǎn)錄因子的核蛋白＋標(biāo)記探針＋標(biāo)記探針100倍量的未標(biāo)記探針蔼紧。探究探針結(jié)合的特異性，如果冷探針（即100倍量的未標(biāo)記探針）可以競爭結(jié)合狠轻，阻礙了標(biāo)記探針（因為未標(biāo)記探針量太大奸例，標(biāo)記探針競爭不過它，幾乎只有未標(biāo)記探針和目的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合）向楼，說明第2列中的結(jié)合是特異性的（假設(shè)如果2中的結(jié)合是非特異性的結(jié)合查吊，是標(biāo)記的同位素和目的轉(zhuǎn)錄因子相結(jié)合，那么3中還會出現(xiàn)標(biāo)記的同位素和目的轉(zhuǎn)錄因子相結(jié)合湖蜕，即會出現(xiàn)第二行的條帶）逻卖。
- 第4列突變探針的冷競爭反應(yīng)：激活的目的轉(zhuǎn)錄因子的核蛋白＋標(biāo)記探針＋標(biāo)記探針100倍量的未標(biāo)記突變探針。按照假設(shè)目的轉(zhuǎn)錄因子和DNA探針序列相結(jié)合昭抒，突變的探針應(yīng)該不能和目的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合评也，同樣也說明第2列中的結(jié)合是特異性的。
- 第5列Super-shift反應(yīng)：激活的目的轉(zhuǎn)錄因子的核蛋白＋標(biāo)記探針＋目的轉(zhuǎn)錄因子的特異抗體灭返。探究目的轉(zhuǎn)錄因子的特異性盗迟，目的轉(zhuǎn)錄因子和抗體結(jié)合后，因為其形成的復(fù)合物分子量更大了熙含，在電泳中遷移速率下降罚缕，就會有super-shift。如果沒有婆芦，說明是其他的轉(zhuǎn)錄因子和標(biāo)記探針結(jié)合怕磨。
常見問題
1、為什么看不到遷移帶消约？
1）蛋白樣本提取質(zhì)量不高肠鲫，蛋白降解或者提取量不足。
2）樣本中沒有可以與探針結(jié)合的蛋白或粮。
3）探針與蛋白無特異性的相互作用导饲。
4）轉(zhuǎn)膜效率低，蛋白或者探針未轉(zhuǎn)移到膜上。
5）曝光或者成像時間過短渣锦。
在Super-Shift EMSA測定中看不到Super-Shift DNA/蛋白復(fù)合物帶還可能有以下原因：
6）抗體沒有工作硝岗。不是所有的抗體都可以用于Super-Shift EMSA，只有對非變性蛋白的表面抗原決定簇起反應(yīng)的抗體才能夠用于Super-Shift EMSA袋毙。
7）測定的活化的DNA/蛋白復(fù)合物中沒有希望檢測的構(gòu)成成分存在型檀。此時既看不到Super-Shift的帶，也看不到DNA/蛋白復(fù)合物的量的減少听盖。
8）使用的抗體過度稀釋胀溺。一般10-20ul的反應(yīng)液需要使用0.5-1ul原倍的抗體。
9）多抗與DNA/蛋白復(fù)合物形成大的聚集物而不進(jìn)膠皆看。在這種情況下仓坞，雖然看不到Super-Shift的帶，但應(yīng)當(dāng)可以看到DAN/蛋白復(fù)合物的電泳帶明顯減少腰吟。
2无埃、為什么實驗背景高？
1）曝光或者成像時間過長毛雇。
2）封閉時間不足或者效率不高嫉称。
3）洗滌效果不佳
4）實驗過程中膜沒有一直處于濕潤狀態(tài)。
3灵疮、EMSA測定需要多少量的蛋白與標(biāo)記的探針澎埠？
對每一個特定的結(jié)合蛋白和探針，所用的純化蛋白始藕，部分純化蛋白，粗制核抽提液需作優(yōu)化：一般所用純化蛋白的量在20-2000ng間氮趋，可將蛋白:DNA的等摩爾比調(diào)整為蛋白的摩爾數(shù)是DNA的5倍伍派；用粗制核抽提液，需要2-10ug蛋白形成特異的復(fù)合物剩胁。
部分純化蛋白與粗制核抽提液應(yīng)保存在-80℃诉植、探針應(yīng)保存在-20℃以防止降解。
無論探針或是結(jié)合蛋白都應(yīng)避免多次凍融昵观。
4晾腔、Poly(dI:dC)，非特異性競爭DNA啊犬，特異性競爭DNA在EMSA測定中的作用灼擂？Poly(dI:dC)由肌苷和胞嘧啶組成。在EMSA反應(yīng)中加入poly(dI:dC)觉至，可抑制粗制核抽提液中轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子與標(biāo)記探針的非特異結(jié)合剔应。結(jié)合溶液中的poly(dI:dC)的用量需在正式實驗前進(jìn)行優(yōu)化，一般用量大約在0.05mg/ml左右。當(dāng)用純化的蛋白作凝膠遷移反應(yīng)時峻贮，不必一定加入poly(dI:dC)席怪，如加入，則普通反應(yīng)中所用終濃度不超過50-100ng纤控。對核抽提液挂捻，每2-3ug核抽提液用1 ug poly(dI:dC)。
為確定所形成的復(fù)合物的特異性船万，在含或不含增量的特異競爭DNA或非特異的競爭DNA時刻撒，作結(jié)合反應(yīng)的競爭實驗。一般唬涧，特異競爭探針是非標(biāo)記的DNA疫赎，其序列與標(biāo)記探針相同，故能與標(biāo)記探針競爭與結(jié)合蛋白的反應(yīng)碎节。非特異競爭探針的長度組成和DNA探針相同捧搞，但序列不同。如果結(jié)合蛋白與標(biāo)記探針的結(jié)合被特異競爭探針抑制狮荔，而不受非特異探針的影響表明靶結(jié)合蛋白的存在胎撇。特異與非特異性競爭DNA的用量也需優(yōu)化或滴定，但競爭DNA通常是標(biāo)記的探針用量的30-100倍（w/w）殖氏。
5晚树、用什么凝膠條件將蛋白質(zhì)/探針復(fù)合物和游離的探針分離開？將結(jié)合蛋白或粗制核抽提液和目的探針結(jié)合雅采，蛋白/探針復(fù)合物和游離探針可在非變性聚丙烯酰胺凝膠中經(jīng)電泳分離爵憎。聚丙烯酰胺的濃度一般為6%，在特定條件下可用高或低的濃度婚瓜。也可將TGE緩沖液（12.5mM Tris宝鼓，pH8.3，95mM 甘氨酸巴刻，0.5mM EDTA）用于不穩(wěn)定的蛋白/DNA復(fù)合物愚铡。在4℃進(jìn)行結(jié)合和電泳實驗以阻止不穩(wěn)定復(fù)合物和探針的解離。
當(dāng)帶型不緊密出現(xiàn)拖尾時胡陪，表明復(fù)合物存在解離沥寥。凝膠必需完全聚合，以避免帶型拖尾柠座。如復(fù)合物不進(jìn)入凝膠則表明所用的蛋白或探針過量邑雅，或鹽的濃度過量不適用于這一反應(yīng)。在含抽提液的帶中不含游離探針或復(fù)合物愚隧，但只含探針的帶中有探針表明抽提物有核酸或磷酸酶污染蒂阱，應(yīng)在抽提液中和結(jié)合反應(yīng)中加入相應(yīng)的抑制劑锻全。
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