hello，又到周五低矮，一周的收官之戰(zhàn)蜡塌，今天我們要繼續(xù)分享單細(xì)胞空間聯(lián)合分析的文章赦肃，參考文章在Spatiotemporal Immune Landscape of Colorectal Cancer Liver Metastasis at Single-Cell Level，2021年8月發(fā)表于cancer discovery,IF17.40分货邓，我們來看一下這一次運(yùn)用單細(xì)胞空間聯(lián)合技術(shù)給我們帶來什么不一樣的生物學(xué)分析內(nèi)容秆撮。

圖片.png

ABSTRACT

肝轉(zhuǎn)移是結(jié)直腸癌死亡的主要原因，表現(xiàn)出高度異質(zhì)性和抑制性的免疫微環(huán)境换况。 在這里职辨，使用 single-cell RNA-seq 和空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)對(duì) 97 個(gè)匹配的樣本進(jìn)行了測(cè)序。 Strikingly戈二，轉(zhuǎn)移性微環(huán)境經(jīng)歷了免疫抑制細(xì)胞（如 MRC1⁺ CCL18⁺ M2 樣巨噬細(xì)胞）的顯著空間重編程舒裤。 進(jìn)一步開發(fā)了 scMetabolism，這是一種用于量化單細(xì)胞代謝的計(jì)算pipeline（這個(gè)值得大家注意一下）觉吭，并觀察到這些巨噬細(xì)胞具有增強(qiáng)的代謝活性腾供。 有趣的是，新輔助化療可以阻斷這種狀態(tài)并恢復(fù)反應(yīng)性患者的抗腫瘤免疫平衡鲜滩，而無反應(yīng)性患者則惡化為更具抑制性的狀態(tài)伴鳖。 研究的工作描述了轉(zhuǎn)移的免疫進(jìn)化，并揭示了腫瘤如何對(duì)新輔助化療作出反應(yīng)的black box徙硅。

STATEMENT OF SIGNIFICANCE

We present a single-cell and spatial atlas of colorectal liver metastasis and found the highly metabolically activated MRC1⁺ CCL18⁺ M2-like macrophages in metastatic sites. Efficient neoadjuvant chemotherapy can slow down such metabolic activation, raising the possibility to target metabolism pathways in metastasis.（解析了結(jié)直腸肝轉(zhuǎn)移的單細(xì)胞和空間圖譜榜聂，并在轉(zhuǎn)移部位發(fā)現(xiàn)了高度代謝激活的 MRC1⁺ CCL18⁺ M2 樣巨噬細(xì)胞。 有效的新輔助化療可以減緩這種代謝激活嗓蘑，提高靶向轉(zhuǎn)移代謝途徑的可能性）须肆。

INTRODUCTION

Liver metastasis（肝轉(zhuǎn)移） remains a major hurdle to long-lasting survival of colorectal cancer（結(jié)腸癌） patients, which can be partly explained by the highly dynamic spreading routes of cancer cells（癌細(xì)胞的高度動(dòng)態(tài)spreading routes ）. Outside the cancer cells, tumor microenvironment (TME) of liver metastasis harbors a highly immunosuppressive phenotype, induces a systemic loss of antigen-specific T lymphocytes, and drives the spread of tumor（免疫細(xì)胞失去其功能也是導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移的一個(gè)推手）. It still remains largely unknown how the immune cells spatially orchestrate Colorectal Cancer Liver Metastasis (CRLM) progression and whether the metastatic cellular microenvironment differs from the primary ones（看來很多生物學(xué)問題必須要借助單細(xì)胞空間的聯(lián)合技術(shù)）. There is hence a pressing need for recording, identifying, and quantifying cellular or even spatial landscape of CRLM to refresh our understanding of metastasis biology.

Neoadjuvant Chemotherapy (NAC匿乃，新輔助化療) refers to that chemical drugs are administered prior to surgical removal of a tumor（在手術(shù)切除腫瘤之前施用化學(xué)藥物）. Paradoxical results（矛盾的結(jié)果） have been seen for the effect of NAC in CRLM. In some reports, NAC was shown to prolong the progression-free survival and overall survival. However, especially in the low-risk resectable CRLM patients, NAC was unexpectedly associated with an unimproved overall survival（看來腫瘤異質(zhì)性對(duì)藥物的反應(yīng)是不同的）. Another independent group also reported that NAC did not prolong disease-free interval. Those seemingly contradictory data raise a critical but poorly understood question whether NAC could favor anti-tumor response and improve outcome of CRLM patients. Thus, dissecting the precise effect of NAC, especially tumor microenvironment alterations, is crucial for understanding the key mechanisms of NAC and designing novel therapeutic strategies（目前單細(xì)胞技術(shù)無法臨床運(yùn)用的關(guān)鍵就在于此吧）。

Here, using single-cell RNA-seq (scRNA-seq) and Spatial Transcriptomics (ST) of 97 samples from 24 patients（單細(xì)胞空間聯(lián)合的技術(shù)）, we aim to explore the immune atlas of CRLM. We revealed that immune microenvironment showed dynamic cellular and spatial changes from primary to metastatic sites（免疫細(xì)胞的特征以及空間動(dòng)態(tài)）. Following NAC treatment, the immune phenotypes underwent antitumor remodelling in responsive patients but shifted towards more immunosuppression in non-responsive patients, where the immunosuppressive cells were reprogrammed at metastatic sites（免疫細(xì)胞經(jīng)歷了重編程）. Our findings highlight the favorable effect of efficient NAC treatment in resectable CRLM patients and allow for the data-driven design of novel therapeutic combinations such as NAC plus immunotherapy in selected patients（可以指導(dǎo)臨床運(yùn)用豌汇，這個(gè)肯定是未來的方向)幢炸。

RESULTS

Integrated scRNA-seq and Spatial Transcriptomics Precisely Quantify Immune Cell Diversity in Resectable CRLM

為了定義 CRLM 的single-cell landscape，應(yīng)用 scRNA-seq 和 ST 來量化 CD45⁺ 細(xì)胞動(dòng)態(tài)瘤礁，使用結(jié)直腸癌 (CRC)阳懂、鄰近結(jié)腸梅尤、肝轉(zhuǎn)移 (LM) 和鄰近肝臟柜思、結(jié)腸淋巴結(jié) (LN) 和外周血單核細(xì)胞 (PBMC) 的配對(duì)樣本。 根據(jù)嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)巷燥，總共recruited了 24 名可切除的 CRLM 患者赡盘。 如前所述，腫瘤的可切除性都通過了由資深臨床醫(yī)生組成的多學(xué)科團(tuán)隊(duì)討論缰揪。 具體而言陨享，20名患者的89份樣本進(jìn)行了scRNA-seq，4名患者的8份樣本進(jìn)行了ST測(cè)序钝腺，其中13名患者的54份樣本未接受治療抛姑，6名患者的30份樣本接受部分緩解的新輔助化療（PR )，來自 5 名患者的 13 個(gè)樣本接受了疾病進(jìn)展 (PD) 或疾病穩(wěn)定 (SD) 的新輔助化療艳狐。 所有腫瘤都是microsatellite stable定硝。

圖片.png

• 注：The experimental scheme for discovering and validating functional immune subpopulations in CRLM.

After two rounds of quality control and doublet removal of scRNA-seq data, 79,703 cells from untreated patients (n = 11), 36,284 cells from NAC PD/SD patients (n = 5), and 62,643 cells from NAC PR patients (n = 4) were used for further analysis. On average, each sample contained 2,007 cells and 1,064 genes (median) were quantified in each cell, with no obvious batch effects across different samples. We integrated all 178,630 CD45⁺ cells, performed the clustering analysis, and defined the main cell types using the SingleR(SingleR定義細(xì)胞類型) and cell marker genes（marker 基因也需要額外驗(yàn)證）. Largely consistent with previous scRNA-seq of colon cancer, we identified myeloid cells, CD8⁺ T cells, CD4⁺ T cells, NK cells, and B cells from the CRLM samples. Of note, T cell proportion was obviously distinct across different tissue types, suggesting the tissue heterogeneity of the immune microenvironment. Both CRC and paired LM showed ~10% Treg cells of all CD45⁺ cells, while such cells were scarce in the adjacent normal tissues. This indicated an suppressed intratumor immunity, which was previously ascribed to the reduced immunotherapeutic efficacy in liver metastasis. Likewise, we integrated the SingleR and manual marker-based annotation to further define immune cell subsets for further in-depth analysis.

同時(shí)，分析了來自 2 名未治療患者和 2 名 NAC PR 患者的 8 個(gè)樣本（配對(duì)的 CRC 和 LM）的 ST 數(shù)據(jù)毫目。無監(jiān)督聚類分析將樣本分為不同的區(qū)域蔬啡，例如腫瘤和成纖維細(xì)胞區(qū)域。為了整合 scRNA-seq 和 ST 數(shù)據(jù)镀虐，我們使用 Seurat 來量化主要免疫亞群箱蟆。在未經(jīng)處理的樣本中，我們觀察到與 scRNA-seq 一致的免疫細(xì)胞模式刮便，例如 CD8⁺ T 細(xì)胞在 LM 和 CRC 中的顯著富集空猜。相比之下，在 NAC 處理的樣本中恨旱，觀察到較小的腫瘤區(qū)域和免疫細(xì)胞的不規(guī)則分布辈毯。特別是在 LM 中，只有一小部分斑點(diǎn)聚集在癌細(xì)胞中窖杀，表明 NAC 治療后細(xì)胞區(qū)室的fundamental remodeling漓摩。總之入客，結(jié)果突出了 CRLM 患者的時(shí)空動(dòng)態(tài)免疫cell landscape和 NAC 后的huge remodeling管毙。(單細(xì)胞 CRLM 圖譜現(xiàn)已在線提供腿椎，用于探索原發(fā)和轉(zhuǎn)移部位的免疫多樣性 (http://www.cancerdiversity.asia/scCRLM))。

圖片.png

圖片.png

圖片.png

圖片.png

Metastatic Tumors Are Enriched with Immune Suppressive Cells, Especially MRC1⁺ CCL18⁺ M2-like Macrophages

鑒于患者的細(xì)胞成分異質(zhì)性夭咬，利用bias-corrected and accelerated (BCa)bootstrap algorithm來估計(jì)細(xì)胞比例啃炸，該算法使用引導(dǎo)重采樣 1,000 次來估計(jì)與細(xì)胞類型比例估計(jì)相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)誤差。分析過濾了低豐度的免疫細(xì)胞卓舵，聚集了免疫細(xì)胞的比例南用，并在整個(gè)組織中對(duì)它們進(jìn)行了scale。一般來說掏湾，在未處理的樣本中裹虫，免疫細(xì)胞豐度可分為 6 種不同的模式（鄰近結(jié)腸直腸高、CRC 高融击、鄰近肝臟高筑公、LM 高、結(jié)腸直腸高和肝臟高）尊浪。相鄰的結(jié)直腸樣本顯示出最高比例的 AIM2⁺ 記憶 B 細(xì)胞匣屡、TCL1A⁺ 初始 B 細(xì)胞和 CD4⁺ 初始 T 細(xì)胞，而 CRC 樣本主要富含 FOXP3⁺ Treg 細(xì)胞拇涤。 MAIT 細(xì)胞捣作、NK 細(xì)胞和 FGFBP2⁺ GZMB⁺ CD8⁺ T 細(xì)胞在鄰近的正常肝組織中富集，類似于之前在原發(fā)性肝癌中的報(bào)道鹅士。這些結(jié)果表明某些免疫細(xì)胞的器官特異性分布券躁。有趣的是，PDCD1⁺ CD4⁺ T 細(xì)胞和 CTLA4⁺ CD8⁺ T 細(xì)胞分別在原發(fā)性腫瘤（CD45⁺ 細(xì)胞的 2.24% 和 1.49%）和 LMs（CD45⁺ 細(xì)胞的 1.17% 和 3.02%）中相對(duì)富集如绸，這與其他計(jì)算預(yù)測(cè)一致嘱朽。這些細(xì)胞在 TME 中的共存表明對(duì)免疫細(xì)胞的common tumor education。相比之下怔接，一些免疫抑制細(xì)胞特異地存在于 LM 中搪泳，其中觀察到 SPP1⁺ 巨噬細(xì)胞和 MRC1⁺ CCL18⁺ 巨噬細(xì)胞的急劇增加。我們query了這種 LM 特異性巨噬細(xì)胞的起源扼脐，發(fā)現(xiàn)特別是 MRC1⁺ CCL18⁺ 巨噬細(xì)胞具有Kupffer細(xì)胞特征岸军，表明它們可能來自肝Kupffer細(xì)胞。據(jù)報(bào)道瓦侮，中性粒細(xì)胞具有潛在的促腫瘤作用艰赞，在 LM 中也富集。進(jìn)一步使用 ssGSEA（一種被證明對(duì) ST 數(shù)據(jù)穩(wěn)健的方法）來量化免疫細(xì)胞亞群的空間分布肚吏。同樣方妖，MRC1⁺ CCL18⁺ 巨噬細(xì)胞和 SPP1⁺ 巨噬細(xì)胞在未治療的 LM 中富集。這些數(shù)據(jù)與 scRNA-seq 數(shù)據(jù)部分一致罚攀，進(jìn)一步證實(shí)了肝轉(zhuǎn)移中潛在的抑制性 TME党觅。

接下來雌澄，試圖在另外三個(gè)獨(dú)立的 CRLM cohorts中驗(yàn)證分析的發(fā)現(xiàn)。首先杯瞻，使用多重免疫組織化學(xué) (mIHC) 來量化同一醫(yī)院另外 27 名 CRLM 患者（n = 18镐牺，未治療；n = 9魁莉，NAC-PR）中選定免疫細(xì)胞亞群的空間分布睬涧。在未處理的樣本中，觀察到 CRC 和 LM 中 FOXP3⁺ Treg 細(xì)胞旗唁、MRC1⁺ CCL18⁺ 巨噬細(xì)胞和 SPP1⁺ 巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)顯著增加畦浓，這與 scRNA-seq 數(shù)據(jù)基本一致。其次逆皮，利用 ssGSEA 對(duì) CRLM（n = 133）的大量微陣列數(shù)據(jù)集中的免疫細(xì)胞進(jìn)行評(píng)分宅粥。由于缺乏鄰近組織數(shù)據(jù)参袱，只能檢查原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性腫瘤之間的細(xì)胞豐度电谣。根據(jù)scRNA-seq 數(shù)據(jù)，在該驗(yàn)證cohorts中抹蚀，MRC1⁺ CCL18⁺ 巨噬細(xì)胞剿牺、SPP1⁺ 巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞在轉(zhuǎn)移性腫瘤中均顯著升高。第三环壤，在癌癥基因組圖譜 (TCGA) CRC cohorts（n = 430）中探討了 scRNA-seq 定義的免疫細(xì)胞亞群的預(yù)后價(jià)值晒来。 MRC1⁺ CCL18⁺ 巨噬細(xì)胞和 SPP1⁺ 巨噬細(xì)胞在原發(fā)性腫瘤中的高評(píng)分均預(yù)示著預(yù)后顯著更差≈Ｏ郑總而言之湃崩，CRLM 單細(xì)胞和空間免疫landscope可以在獨(dú)立的cohorts中得到驗(yàn)證，表明數(shù)據(jù)的穩(wěn)健性接箫。這些觀察結(jié)果還假設(shè)特定的巨噬細(xì)胞亞群可能在 CRLM 的促腫瘤生態(tài)位形成中發(fā)揮重要作用攒读。

圖片.png

• 注：Immune Remodeling from Primary Tumor to Liver Metastasis, Especially the MRC1⁺ CCL18⁺ Macrophages. (A) Heatmap showing proportions of immune cell subsets in different tissues. The color represents the scaled cellular proportion. The pattern of immune infiltration can be classified into 6 types, including adjacent colon high, CRC high, adjacent liver high, LM high, colon high, and liver high. (B) The proportions of selected immune cell subsets. The y axis represents the percentage (bootstrap), and x axis represents different tissues. The shaded areas represent the upper quantile and lower quantile bootstrap cell proportions. (C) The spatial transcriptomics of selected immune cell subsets in colon or liver tumor-normal samples. (D) Multiplex immunohistochemistry of FOXP3⁺ Treg cells. The blue arrows represent the FOXP3⁺ Treg cells. (E) Multiplex immunohistochemistry of SPP1⁺ macrophages and MRC1⁺ CCL18⁺ macrophages. The blue arrows represent the SPP1⁺ macrophages and the yellow arraws represent the MRC1⁺ CCL18⁺ macrophages. (F) The proportions of SPP1⁺ macrophages, MRC1⁺ CCL18⁺ macrophages, and FOXP3⁺ Treg cells among all CD45⁺ cells revealed by multiplex immunohistochemistry. The boxplot represents the mean value and the error bar represents the standard error value. **, P < 0.01; **, P < 0.005. P values were determined by Wilcox test. (G) The prognostic value of MRC1⁺ CCL18⁺ M2-like macrophages in TCGA CRC patients. P values were determined by log-rank test.

圖片.png

圖片.png

Metastatic Tumor Potentially Educated Macrophages Shift Towards Suppressive Status

鑒于 LM 中巨噬細(xì)胞亞群的富集，分析假設(shè)那些富含 LM 的巨噬細(xì)胞在不同組織中的功能可能不同辛友。因此薄扁，進(jìn)行了基于配體-受體的癌癥-免疫串?dāng)_分析（細(xì)胞通訊），并在原發(fā)部位和轉(zhuǎn)移部位之間進(jìn)行了比較废累。Strikingly邓梅，SPP1⁺ 巨噬細(xì)胞和 MRC1⁺ CCL18⁺ 巨噬細(xì)胞在 LM 和 CRC 之間的所有差異串?dāng)_（通訊）細(xì)胞類型中排名靠前。這一結(jié)果表明邑滨，肝轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞可能優(yōu)先重編程巨噬細(xì)胞并誘導(dǎo)其特定的功能狀態(tài)日缨，這可能是由于原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性癌細(xì)胞之間的內(nèi)在差異。值得注意的是掖看，LM 中的轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞優(yōu)先表達(dá)配體 CD47匣距，這是一個(gè)重要的“don’t-eat-me”的檢查點(diǎn)诈铛，因此可能通過相應(yīng)的受體 SIRPA 招募或激活 MRC1⁺ CCL18⁺ 巨噬細(xì)胞。進(jìn)一步利用 mIHC 來可視化這些蛋白質(zhì)墨礁，并直接觀察 CD47⁺ 腫瘤細(xì)胞和 SIRPA⁺ 巨噬細(xì)胞之間的串?dāng)_幢竹。這些特別富含 LM 的配體-受體對(duì)為靶向治療肝轉(zhuǎn)移提供了線索。
為了查明獨(dú)特的腫瘤微環(huán)境imprinted的差異恩静，在 CRC 和 LM 巨噬細(xì)胞之間進(jìn)行了差異基因表達(dá)分析焕毫。值得注意的是，富含 LM 的 MRC1⁺ CCL18⁺ 巨噬細(xì)胞高度表達(dá)了a broad spectrum of key molecules fundamental for macrophage polarization驶乾。 APOE作為抗炎和pro-M2轉(zhuǎn)化蛋白邑飒，是顯著差異表達(dá)的基因之一。其他 M2 極化相關(guān)基因如 MARCO 在富含 LM 的 MRC1⁺ CCL18⁺ 巨噬細(xì)胞中也顯著上調(diào)级乐。相比之下疙咸，分析發(fā)現(xiàn)富含 CRC 的 MRC1⁺ CCL18⁺ 巨噬細(xì)胞表現(xiàn)出更高的炎性細(xì)胞因子表達(dá)，包括 TNF风科、IL1B撒轮、CCL3 和 CCL4。在 SPP1⁺ 巨噬細(xì)胞中也觀察到這種分子譜的變化贼穆，表明巨噬細(xì)胞具有從原發(fā)部位到轉(zhuǎn)移部位的共同功能變化题山。然后，通路富集分析顯示來自 CRC 和 LM 的 MRC1⁺ CCL18⁺ 巨噬細(xì)胞中代謝通路的強(qiáng)烈富集故痊，突出了代謝在決定這些巨噬細(xì)胞功能中的基本作用顶瞳。值得注意的是，發(fā)現(xiàn) CRC 中的 MRC1⁺ CCL18⁺ 巨噬細(xì)胞富含氧化磷酸化愕秫，而它們?cè)?LM 中的對(duì)應(yīng)物則以氨基酸代謝為主慨菱。這些數(shù)據(jù)強(qiáng)調(diào)，代謝調(diào)節(jié)可能介導(dǎo)巨噬細(xì)胞響應(yīng)不同微環(huán)境線索的表型和功能轉(zhuǎn)變戴甩。

圖片.png

• 注：MRC1⁺ CCL18⁺ Macrophages in Metastatic Tumors Exhibited Terminally Differentiated 965 and Suppressive States. (A) The ranked differential tumor-immune cell crosstalk (LM v.s. CRC ) shows MRC1⁺ CCL18⁺ M2-like macrophages ranked the second among all ligand-receptor pairs. (B) The LM upregulated ligand-receptor crosstalk between MRC1⁺ CCL18⁺ macrophages and SPP1⁺ macrophages with cancer cells (LM v.s. CRC). The y axis represents the ligand & receptor name,while the x axis represents the tissue. The circle size represents the log normalized P-value while the color darkness represents the log-transformed mean expression of ligand & receptor. (C) Multiplex immunohistochemistry shows the crosstalk between tumor cells and MRC1⁺ CCL18⁺ macrophages or SPP1⁺ macrophages via the ligand-receptor of CD47-SIRPA. (D) The volcano plot represents the differentially expressed genes of MRC1⁺ CCL18⁺ M2-like macrophages between CRC and LM. (E) The selected gene expression of MRC1⁺ CCL18⁺ M2-like macrophages in CRC and LM. ***, P < 0.005. P values were determined by Wilcox test. (F) Pathway enrichment analysis of highly expressed genes of MRC1⁺ CCL18⁺ M2-like macrophages in CRC and LM respectively. KEGG gene sets were used to perform the pathway enrichment analysis. Only selected pathways were shown.

圖片.png

圖片.png

scMetabolism: A Computational Pipeline for Quantifying Metabolic Activity Using scRNA-seq Data

以單細(xì)胞分辨率挖掘代謝活動(dòng)仍然具有挑戰(zhàn)性符喝，主要是由于缺乏易于使用的計(jì)算pipieline。 盡管 Locasale Lab 最近報(bào)告了他們基于 ssGSEA 的工作流程等恐，但執(zhí)行此類分析仍然需要強(qiáng)大的計(jì)算背景并且非常耗時(shí)洲劣。 在這里，分析展示了一個(gè) R 包 scMetabolism课蔬，它集成了 dropout 基因插補(bǔ)囱稽、代謝量化和數(shù)據(jù)可視化。 分析證明該工作流程與 Seurat scRNA-seq 工具包具有良好的兼容性二跋，并且廣泛適用于 scRNA-seq 數(shù)據(jù)集战惊。 scMetabolism 的 R 包現(xiàn)在可以在 Github (https://github.com/wu-yc/scMetabolism) 上獲得。

scMetabolism 包由三個(gè)連續(xù)步驟組成

圖片.png

• 注：The schematic plot of scMetabolism, a pipeline for quantifying single-cell metabolism based on scRNA-seq.
• 首先扎即，scMetabolism 支持基于 ALRA 的 dropout 值的估算吞获。
• 其次况凉，scMetabolism 基于 VISION、AUCell 和 ssGSEA 量化代謝途徑活動(dòng)各拷。整合了報(bào)告的基因集并手動(dòng)審查了來自 KEGG 和 REACTOME 的基因集刁绒，以生成高質(zhì)量代謝基因集的列表。
• 第三烤黍，scMetabolism 提供了三種不同的方式知市，包括箱線圖、UMAP/tSNE 圖和點(diǎn)圖速蕊，以可視化單個(gè)細(xì)胞的代謝多樣性栅炒。還在 PBMC喝峦、黑色素瘤碰声、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌和睪丸等 4 個(gè)不同數(shù)據(jù)集上測(cè)試了 scMetabolism 的準(zhǔn)確性（與已發(fā)表方法的比較）乃沙、一致性（不同方法之間的相關(guān)性，如 VISION 和 AUCell）和穩(wěn)定性（dropout模擬）來測(cè)試這條管道的性能唉锌。
• 最后隅肥，我們開發(fā)了一個(gè)易于使用的網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器 scMetabolism online (http://www.cancerdiversity.asia/scMetabolism/)，供生物學(xué)家輕松量化單細(xì)胞的代謝活動(dòng)糊秆。

圖片.png

圖片.png

A Sharp Increase of Metabolic Activity of MRC1⁺ CCL18⁺ Macrophages in Liver Metastasis

為了了解 CRLM 中髓樣細(xì)胞的代謝情況武福，首先計(jì)算了抑制性巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞中所有 76 種活躍代謝途徑的得分。 其中痘番，選擇了前 50% 的可變代謝評(píng)分，并根據(jù)其平均代謝評(píng)分對(duì)骨髓細(xì)胞（不包括低豐度的骨髓細(xì)胞）進(jìn)行排名平痰。 Strikingly汞舱，LM 浸潤(rùn)的 MRC1⁺ CCL18⁺ 巨噬細(xì)胞在所有骨髓細(xì)胞中表現(xiàn)出最高的代謝活動(dòng)，表明它們非常有活力宗雇，這可能與其在轉(zhuǎn)移部位的獨(dú)特功能有關(guān)昂芜。

圖片.png

• 注：The metabolic activity analysis of myeloid cells shows that MRC1⁺ CCL18⁺ macrophages and SPP1⁺ macrophages in metastatic tumors have the highest metabolic score. The circle size and color darkness both represent the scaled metabolic score.

MRC1⁺ CCL18⁺ 巨噬細(xì)胞的所有代謝相關(guān)基因的進(jìn)一步無監(jiān)督聚類觀察到與周圍組織相關(guān)的強(qiáng)烈代謝偏好，確定了 42 條代謝途徑可能在 CRC 和 LM 浸潤(rùn)的 MRC1⁺ CCL18⁺ 巨噬細(xì)胞中上調(diào)赔蒲。其中泌神，苯丙氨酸代謝有助于產(chǎn)生酪氨酸，在富含 LM 的 MRC1⁺ CCL18⁺ 巨噬細(xì)胞中表達(dá)更高舞虱。隨后仔細(xì)研究了差異表達(dá)的代謝基因欢际，發(fā)現(xiàn)在原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性浸潤(rùn)的 MRC1⁺ CCL18⁺ 巨噬細(xì)胞中特異性上調(diào)的代謝基因，部分是已知藥物的靶基因矾兜。 GSTO1 是細(xì)胞色素 P450 代謝異物的一種酶损趋，在 CRC 和 LM 浸潤(rùn)的 MRC1⁺ CCL18⁺ 巨噬細(xì)胞中顯著升高，并與分化相關(guān)椅寺。 IL4I1 和 MIF 是巨噬細(xì)胞激活所必需的基因浑槽，也顯示出相似的特征蒋失。通過使用 mIHC 驗(yàn)證了這些代謝酶并觀察到基本一致的結(jié)果。

接下來query巨噬細(xì)胞的這種高代謝激活狀態(tài)是否在物種之間是保守的桐玻。因此篙挽，構(gòu)建了 CRLM 的小鼠模型，并將 scRNA-seq 應(yīng)用于原發(fā)性/轉(zhuǎn)移性腫瘤镊靴。結(jié)果嫉髓，在小鼠 CRLM 模型中發(fā)現(xiàn)了類似的巨噬細(xì)胞亞群，例如 Mrc1⁺ 巨噬細(xì)胞和 Spp1⁺ 巨噬細(xì)胞邑闲。然而算行，沒有觀察到這些巨噬細(xì)胞在原發(fā)部位和轉(zhuǎn)移部位之間的顯著差異比例，可能是由于原發(fā)腫瘤是在皮下而不是在結(jié)腸中形成的苫耸。進(jìn)一步的代謝量化顯示了富含 LM 和 CRC 浸潤(rùn)巨噬細(xì)胞的特征代謝狀態(tài)州邢。分析檢查了前 3 條差異表達(dá)途徑（小鼠模型中的 LM 與 CRC），其中一些在人和小鼠中是保守的褪子。例如量淌，氧化磷酸化和苯丙氨酸代謝在人和小鼠巨噬細(xì)胞之間是一致的。苯丙氨酸代謝的關(guān)鍵酶Mif的表達(dá)也與人CRLM一致嫌褪⊙绞啵總之，LM 中的巨噬細(xì)胞具有代謝活動(dòng)的急劇增加笼痛，例如苯丙氨酸代謝裙秋。抑制這種代謝活動(dòng)可能會(huì)調(diào)動(dòng)抗腫瘤免疫反應(yīng)來控制晚期 CRC 的肝轉(zhuǎn)移。

為了說明代謝重編程與巨噬細(xì)胞表型變化的關(guān)聯(lián)缨伊，計(jì)算了巨噬細(xì)胞的經(jīng)典表型評(píng)分摘刑，例如抗原加工和呈遞、炎癥刻坊、血管生成枷恕、免疫抑制、吞噬作用谭胚、白細(xì)胞介素信號(hào)通路和補(bǔ)體徐块。事實(shí)上，在 LM 中灾而，MRC1⁺ CCL18⁺ 巨噬細(xì)胞的抗原加工和呈遞以及補(bǔ)體活性評(píng)分顯著增加胡控，SPP1⁺ 巨噬細(xì)胞也顯示出類似的趨勢(shì)。某些基因如 HLA-A（MHC I 類分子之一）在富含 LM 的 MRC1⁺ CCL18⁺ 巨噬細(xì)胞中上調(diào)绰疤。進(jìn)一步分析了 42 種腫瘤高代謝途徑與 MRC1⁺ CCL18⁺ 巨噬細(xì)胞表型評(píng)分之間的相關(guān)性铜犬。有趣的是，包括戊糖和葡萄糖醛酸相互轉(zhuǎn)化在內(nèi)的幾種巨噬細(xì)胞特異性代謝途徑與 LM 中的抗原加工和呈遞有很強(qiáng)的相關(guān)性，但在 CRC 中卻很弱癣猾。這些數(shù)據(jù)共同表明代謝在確定 MRC1⁺ CCL18⁺ 巨噬細(xì)胞表型中的潛在重要作用敛劝。

圖片.png

圖片.png

圖片.png

圖片.png

NAC Responsive and Non-Responsive Tumors Harbor Distinct Immune Dynamics Especially Macrophages

為了探索 NAC 對(duì)抗腫瘤免疫的影響，我們使用 TooManyCells（參考文獻(xiàn)在TooManyCells identifies and visualizes relationships of single-cell clades） 對(duì)所有 CD45⁺ 細(xì)胞進(jìn)行了聚類分析纷宇。有趣的是夸盟，觀察到 CRC 和 LM 之間細(xì)胞聚類的強(qiáng)烈差異。為了了解哪些細(xì)胞類型發(fā)生了變化像捶，計(jì)算了bootstrapped cell proportion并進(jìn)行了差異分析上陕。值得注意的是，NAC 對(duì) TME 的影響是高度特定于細(xì)胞類型和context的拓春。通常释簿，在 PR 腫瘤中，NAC 可以下調(diào)免疫抑制細(xì)胞并激活腫瘤中的細(xì)胞毒性細(xì)胞硼莽。在 LM 中庶溶，反應(yīng)性 NAC 下調(diào) SPP1⁺ 巨噬細(xì)胞，但上調(diào)細(xì)胞毒性 T 細(xì)胞懂鸵，如 GZMK⁺ CD8⁺ T 細(xì)胞和 XCL1⁺CD8⁺ T 細(xì)胞偏螺。特別是，在 NAC-PR 腫瘤中只剩下幾個(gè) MRC1⁺ CCL18⁺ 巨噬細(xì)胞和幾十個(gè) SPP1⁺ 巨噬細(xì)胞匆光，表明 NAC 在抑制巨噬細(xì)胞譜系中的潛在作用套像。然而，在 PD/SD 腫瘤中终息，觀察到與 PR 腫瘤不同的免疫細(xì)胞變化夺巩。例如，在LM中浸潤(rùn)的SPP1⁺巨噬細(xì)胞和MRC1⁺ CCL18⁺巨噬細(xì)胞水平增加采幌，而細(xì)胞毒性免疫細(xì)胞（即FGFBP2⁺ GZMB⁺ CD8⁺ T細(xì)胞）被下調(diào)劲够。 這些相反的結(jié)果可能是由器官特異性和治療功效相關(guān)的癌細(xì)胞的重塑。例如休傍，轉(zhuǎn)移性 PD/SD 癌細(xì)胞表現(xiàn)出 DNA 修復(fù)和脂肪酸代謝的特異性富集，而轉(zhuǎn)移性 PR 癌細(xì)胞與脂肪生成更相關(guān)蹲姐∧ト。或者，NAC 治療也可以直接和差異地調(diào)節(jié)個(gè)體免疫亞群柴墩。除腫瘤外忙厌，NAC上調(diào)鄰近正常肝臟中GZMB⁺CD8⁺T細(xì)胞的比例，并增加PR患者PBMC中FGFBP2⁺GZMB⁺CD8⁺T細(xì)胞的比例江咳。對(duì)于 PD/SD 患者逢净，在鄰近結(jié)腸和肝臟中也觀察到 FGFBP2⁺ GZMB⁺ CD8⁺ T 細(xì)胞水平降低。總之爹土，結(jié)果表明甥雕，有效的 NAC 不僅重新編程了腫瘤內(nèi)免疫平衡，還激活了全身抗腫瘤免疫反應(yīng)胀茵，為支持 NAC 在可切除 CRLM 中的潛在用途提供了證據(jù)社露。

圖片.png

• 注：Neoadjuvant Chemotherapy Restored the Immune Balance by Activating Cytotoxic Immune Cells and Inhibiting Immunosuppressive Cells in Metastatic Tumors. (A) The cell clustering in chemotherapy PD/SD, and PR tumors are largely different. (B) The dot plot shows the cell composition difference between untreated and NAC-PR tumors. P values were determined by Wilcox test of bootstrap cellular proportion. (C) The dot plot shows cell composition difference between untreated and NAC-PD/SD tumors. P values were determined by Wilcox test of bootstrap cellular proportion. (D) The cellular changes between untreated and NAC-PR tumors. P values were determined by Wilcox test of bootstrap cellular proportion.(E) The cellular changes between untreated and NAC-PD/SD tumors. P values were determined by 1018 Wilcox test of bootstrap cellular proportion. (F)The proportional changes of selected cell types between untreated, PR, and PD/SD samples. ***, adjusted P < 0.005. Adjusted P values were determined by Wilcox test.

圖片.png

圖片.png

Metabolic Reprogramming of Macrophages Induced by Neoadjuvant Chemotherapy in Responsive Tumors

考慮到 NAC 主要影響髓細(xì)胞群，尤其是巨噬細(xì)胞琼娘，因此query巨噬細(xì)胞的軌跡是否由 NAC 編輯峭弟。根據(jù)接受 NAC 治療反應(yīng)來劃分骨髓細(xì)胞的 UMAP 分布，并確定了 PD/SD 和 PR 樣本之間豐富的骨髓表型多樣性脱拼。在未處理的樣本中瞒瘸，可以觀察到骨髓細(xì)胞的發(fā)育軌跡，而 PR 組的骨髓細(xì)胞富含單核細(xì)胞表型熄浓，巨噬細(xì)胞的祖細(xì)胞狀態(tài)情臭，表明早期分化狀態(tài)。 bootstrap 細(xì)胞比例差異分析證實(shí)了 NAC-PR 腫瘤中巨噬細(xì)胞缺乏終末狀態(tài)玉组，例如 MRC1⁺ CCL18⁺ 巨噬細(xì)胞和 SPP1⁺ 巨噬細(xì)胞的顯著下調(diào)谎柄。相比之下，與未經(jīng)治療的腫瘤相比惯雳，NAC-PD/SD 腫瘤的 MRC1⁺CCL18⁺巨噬細(xì)胞和 SPP1⁺ 巨噬細(xì)胞水平顯著增加朝巫。接下來利用 mIHC 來檢查另一個(gè)獨(dú)立隊(duì)列中的巨噬細(xì)胞（n = 18，未處理石景；n = 9劈猿，NAC-PR），證實(shí) NAC-PR LM 中 MRC1⁺ CCL18⁺ 巨噬細(xì)胞和 SPP1⁺ 巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)較低潮孽。使用 dynverse 的軌跡推斷分析進(jìn)一步確定了從 S100A9⁺ 單核細(xì)胞到 MRC1⁺ CCL18⁺ 巨噬細(xì)胞的清晰發(fā)展軌跡揪荣，表明未處理與 NAC-PR 細(xì)胞的相反極化。通過關(guān)注分別代表 MRC1⁺ CCL18⁺ 巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞的 MRC1 和 S100A9 表達(dá)往史，再次證明化療反應(yīng)細(xì)胞表現(xiàn)出富含單核細(xì)胞的表型仗颈。相反，在PD/SD組中椎例，未觀察到巨噬細(xì)胞的軌跡重編程挨决。結(jié)果表明，化療對(duì)巨噬細(xì)胞的軌跡阻斷是反應(yīng)性腫瘤獨(dú)有的订歪。

鑒于轉(zhuǎn)移性腫瘤中 MRC1⁺ CCL18⁺ 和 SPP1⁺ 巨噬細(xì)胞數(shù)量有限脖祈，對(duì)未處理和 NAC 處理的樣本之間的所有髓細(xì)胞進(jìn)行了通路富集分析，發(fā)現(xiàn) NAC 誘導(dǎo) PR 和 PD/SD 組 LM 中髓細(xì)胞的特定功能變化PR組中的巨噬細(xì)胞顯示出核糖體基因特征的富集刷晋，而PD/SD組中的巨噬細(xì)胞與補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)相關(guān)盖高。然后慎陵，專注于代謝變化的 scMetabolism 管道顯示 NAC 顯著阻止了骨髓代謝，PR 組顯示出更多的下調(diào)代謝喻奥。在 CRC 和 LM 的 PD/SD 和 PR 組的巨噬細(xì)胞中席纽，糖酵解和糖異生持續(xù)下調(diào)。相比之下映凳，PD/SD 組的巨噬細(xì)胞也與特定的代謝途徑有關(guān)胆筒，例如 CRC 和 LM 中的磷酸肌醇代謝上調(diào)≌┩悖總之仆救，NAC 對(duì)髓系譜系進(jìn)行了特定的代謝重編程，這可能會(huì)擴(kuò)展我們對(duì) NAC 誘導(dǎo)的抗腫瘤機(jī)制的理解矫渔，并為可切除的 CRLM 患者提供潛在的治療方法彤蔽。

圖片.png

圖片.png

圖片.png

圖片.png

Immune Microenvironment of Multifocal Metastasis Is Highly Diverse

正如最近報(bào)道的multifocal原發(fā)性肝癌的異質(zhì)性 TME 所證明的那樣，器官內(nèi)的很大一部分腫瘤是multifocal庙洼，具有多種遺傳顿痪、分子和免疫學(xué)特征。multifocal LM 是否具有多樣化的免疫微環(huán)境和對(duì)化療的獨(dú)特反應(yīng)仍不清楚油够。為了普遍捕獲轉(zhuǎn)移間免疫異質(zhì)性蚁袭，對(duì) 4 名multifocal LM（P5、P7石咬、P9 和 P10）患者的所有 CD45⁺ 細(xì)胞進(jìn)行了無監(jiān)督聚類揩悄。有趣的是，multifocal轉(zhuǎn)移顯示出不同的免疫特征鬼悠。對(duì)于未治療的患者 (P10)删性，LM 位點(diǎn) 2 位于相鄰肝臟的同一cluster中，而 LM 位點(diǎn) 1 與任何其他樣本都不相似焕窝。另外 3 個(gè) NAC 治療的multifocal LM 也具有轉(zhuǎn)移間異質(zhì)免疫特征蹬挺。接下來，bootstrap 細(xì)胞比例分析表明它掂，在未處理的樣本中巴帮，免疫抑制細(xì)胞在不同 LM 位點(diǎn)之間顯著且差異化地浸潤(rùn)，其中 MRC1⁺ CCL18⁺ 巨噬細(xì)胞在 P10 的 LM 中差異化浸潤(rùn)虐秋。它們還具有不同的轉(zhuǎn)移間表型/代謝活性晰韵，例如抗原加工和呈遞。因此熟妓，這種相當(dāng)大的轉(zhuǎn)移間異質(zhì)性可能導(dǎo)致對(duì)化療和其他治療的不同反應(yīng)，這在臨床實(shí)踐中得到了充分證明栏尚。

圖片.png

圖片.png

圖片.png

圖片.png

DISCUSSION

在這里起愈，使用最先進(jìn)的高通量 scRNA-seq 和 ST 定義了 CRLM 的細(xì)胞和空間免疫landscope。 眾所周知，原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性 CRC 細(xì)胞之間的基因組差異相對(duì)較低抬虽。 然而官觅，分析的數(shù)據(jù)顯示免疫微環(huán)境在 LM 中經(jīng)歷了廣泛的時(shí)空重塑，具有強(qiáng)烈的免疫抑制細(xì)胞富集阐污，與之前基于大樣本的研究一致休涤。 特別是，MRC1⁺ CCL18⁺ 巨噬細(xì)胞顯示出終末分化狀態(tài)笛辟，表現(xiàn)出代謝高能表型功氨，并且對(duì)新輔助化療敏感。 我們的研究不僅揭示了以前未被認(rèn)識(shí)的 CRLM 免疫生態(tài)系統(tǒng)的多樣性手幢，而且還為癌癥研究界提供了全面的資源捷凄。
通過應(yīng)用 scMetabolism（一種用于量化 CRLM 數(shù)據(jù)上單細(xì)胞代謝活動(dòng)的新型 R 包），驚訝地發(fā)現(xiàn)抑制性 MRC1⁺ CCL18⁺ 巨噬細(xì)胞表現(xiàn)出最高的代謝活性围来，尤其是在轉(zhuǎn)移性腫瘤中跺涤，這表明腫瘤內(nèi)免疫抑制細(xì)胞具有高能量 . 然而，化療后监透，這些免疫抑制細(xì)胞的代謝顯著減慢桶错。 例如，對(duì)巨噬細(xì)胞發(fā)育和命運(yùn)決定至關(guān)重要的 MRC1⁺ CCL18⁺ 巨噬細(xì)胞的丙氨酸胀蛮、天冬氨酸和谷氨酸代謝被 NAC 下調(diào)院刁。scMetabolism pipeline不僅揭示了 CRLM 免疫微環(huán)境的代謝landscope，而且為發(fā)現(xiàn)其他 scRNA-seq 數(shù)據(jù)集的功能性代謝檢查點(diǎn)和途徑開辟了新的計(jì)算機(jī)會(huì)醇滥。

與晚期卵巢癌中 NAC 相關(guān)的免疫激活（NK 細(xì)胞浸潤(rùn)增加和 T 細(xì)胞寡克隆擴(kuò)增）相比黎比，驚訝地觀察到巨噬細(xì)胞的細(xì)胞狀態(tài)在 NAC 反應(yīng)性患者中重新編程。在 PR 樣本中鸳玩，僅存在一小部分終末抑制性巨噬細(xì)胞阅虫，如 MRC1⁺ CCL18⁺ 巨噬細(xì)胞和 SPP1⁺ 巨噬細(xì)胞，而在 PD/SD 樣本中觀察到相反的趨勢(shì)不跟。從機(jī)制上講颓帝，一種可能性是這種免疫重編程是由癌細(xì)胞的化學(xué)治療調(diào)節(jié)誘導(dǎo)的，另一組也報(bào)道了利用離體培養(yǎng)平臺(tái)的化學(xué)調(diào)節(jié)作用窝革。隨著免疫抑制細(xì)胞的減少购城，細(xì)胞毒性細(xì)胞顯著增加，如 XCL1⁺CD8⁺T 細(xì)胞虐译。因此瘪板，數(shù)據(jù)顯示 NAC 有力地恢復(fù)了化療反應(yīng)患者的腫瘤內(nèi)免疫平衡，解碼了有利于這些患者新輔助化療的其他機(jī)制漆诽。

轉(zhuǎn)移性多灶性腫瘤具有不同的免疫微環(huán)境組成侮攀。 即使在同一患者的同一組織內(nèi)锣枝，抑制性免疫細(xì)胞也具有不同的豐度和不同的功能狀態(tài)。 至于多灶性肝細(xì)胞癌兰英，我們最近報(bào)道了不同的病變誘導(dǎo)了異質(zhì)性 TCR 擴(kuò)增撇叁，這可能會(huì)施加免疫選擇。 另一個(gè)獨(dú)立的研究小組還發(fā)現(xiàn)畦贸，在一名患有多灶性病變的高級(jí)別漿液性卵巢癌患者中陨闹，進(jìn)行性轉(zhuǎn)移排除了免疫細(xì)胞，而退化性病變則被 CD8 T 細(xì)胞浸潤(rùn)薄坏。 這可以部分解釋臨床實(shí)踐中同一患者的多灶性腫瘤的不同藥物反應(yīng)趋厉。 我們的數(shù)據(jù)將允許針對(duì)多灶性 CRLM 的最佳合理組合療法的新設(shè)計(jì)，例如組合 NAC颤殴、代謝檢查點(diǎn)抑制劑和免疫療法觅廓。

本文的研究確實(shí)有一些局限性。 由于符合納入標(biāo)準(zhǔn)（化療方案和樣本可切除性）的患者數(shù)量有限涵但，我們的 ST 隊(duì)列中僅招募了 4 名患者杈绸。 其次，ST 技術(shù)還沒有達(dá)到單細(xì)胞分辨率矮瘟。 當(dāng)前的 10X Visium 平臺(tái)僅支持在每個(gè)點(diǎn)估計(jì) 1-10 個(gè)細(xì)胞瞳脓。 更精確的空間圖，例如 Slide-seq 和 DBiT-seq澈侠，對(duì)于更好地理解如何在治療上靶向這種復(fù)雜疾病的時(shí)空異質(zhì)性至關(guān)重要劫侧。 第三，化療如何誘導(dǎo)轉(zhuǎn)移性腫瘤巨噬細(xì)胞的功能改變?nèi)圆磺宄?需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證來驗(yàn)證巨噬細(xì)胞的這種狀態(tài)轉(zhuǎn)變是由于分化的改變或種群變化（即巨噬細(xì)胞耗竭或單核細(xì)胞募集）哨啃。

In summary, we present the spatial & cellular atlas of CRLM and pinpoint the functional impacts of neoadjuvant chemotherapy on TME. Our scMetabolism pipeline not only deepens our understanding into the immunobiology of CRLM, but also enables the unbiased discovery of active metabolic states in other complex tissues. These findings provide unique insights into the biology of cancer spreading and raise the possibility to target metabolism pathways in metastasis.

Method（關(guān)注一點(diǎn)重點(diǎn)方法）

Cellular proportion analysis

To perform the differential cell-type composition analysis, we utilized scDC algorithm to conduct the bias-corrected and accelerated bootstrap analysis for cell-type proportion comparison. We used the scDC_noClustering function to perform the bootstrap resampling cell-type composition analysis (calCI = TRUE, calCI_method = BCa, nboot = 1000). To find out the tissue specific cellular types, we used the median value of bootstrap resampled cellular composition, filtered the immune cells with low composition, and performed the unsupervised clustering analysis.

生活很好烧栋，有你更好