hello棘街，大家好，今天我們來繼續(xù)分享10X單細胞和10X空間轉錄組聯(lián)合分析解析疾病機制的研究移必，相信大家都已經(jīng)看到了室谚，轉錄組的時空表達越來越成為生物學研究的利器，參考的文章在NLRP3 Inflammasome Mediates Immune-Stromal Interactions in Vasculitis，2021年10月發(fā)表于Circulation Research秒赤，影響因子17分猪瞬，我們來看看這篇文章帶給我們什么新的分析角度。

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基本原理：NLRP3（NLR family pyrin domain containing 3)激活和 IL-1β（白介素-1β）產生與川崎病 (KD) 發(fā)病機制有關入篮； 然而陈瘦，仍然缺乏對參與心血管病變發(fā)展的molecular networks和細胞亞群的詳細和完整的表征。

研究目的：在這里潮售，在 KD 血管炎的小鼠模型中痊项，使用單細胞 RNA 測序和空間轉錄組學來確定發(fā)炎血管組織的細胞landscape。

方法和結果：研究觀察了與 Nlrp3 和 Il1b 表達增加相關的小鼠 KD 心血管病變中先天性和適應性免疫細胞的浸潤酥诽。 單核細胞线婚、巨噬細胞和樹突狀細胞是 IL-1β 的主要來源，而成纖維細胞和血管平滑肌細胞 (VSMC) 表達高水平的 IL-1 受體盆均。 發(fā)炎冠狀動脈周圍的 1 型 VSMC undergo表型轉換成為 2 型 VSMC塞弊，其特征在于與decreased contraction and enhanced migration and proliferation。 VSMCs 上 IL-1β 信號的遺傳抑制有效地減弱了 VSMCs 2 型表型轉換和小鼠 KD 血管炎期間心血管病變的發(fā)展泪姨。 此外游沿，NLRP3 的藥理抑制可防止心血管炎癥的發(fā)展。

結論：研究揭示了與鼠 KD 心血管病變中 IL-1β 產生和信號傳導有關的細胞多樣性肮砾，并為靶向 NLRP3 以抑制與 KD 相關的心血管病變的治療策略提供了理論依據(jù)诀黍。

Introduction

川崎病 (Kawasaki disease，KD) 是一種影響嬰幼兒的急性發(fā)熱性和全身性血管炎仗处，在高達 25% 的未治療病例中會導致冠狀動脈瘤 (CAA)眯勾。大劑量靜脈注射免疫球蛋白 (IVIG) 治療顯著降低了這一結果； 然而婆誓，多達 20% 的受影響兒童對 IVIG 治療沒有反應吃环，并且患 CAA 的風險增加。IVIG 降低發(fā)病率和預防 CAA 的確切機制洋幻，以及為什么一些兒童會產生 IVIG 耐藥性仍不清楚 . 對來自 KD 患者解剖的人體樣本的免疫組織化學分析表明郁轻，從中性粒細胞和單核細胞到 CD8⁺ T 細胞和 IgA 漿母細胞，各種各樣的先天性和適應性免疫細胞浸潤并積聚在冠狀動脈壁中文留。 這些細胞浸潤與促炎細胞因子circulating concentrations增加有關好唯，例如 IL-1β（白介素-1β）和 TNF（腫瘤壞死因子）-α； 然而燥翅，這些細胞因子促進血管炎癥和 CAA 發(fā)展的具體機制仍未確定骑篙。

IL-1β 的產生受到 NLRP3（NLR family pyrin domain containing 3)）炎性體的嚴格調控，炎性體是一種多蛋白復合物森书，在細胞內 NLRP3 感知病原體衍生靶端、環(huán)境或內源性危險信號后被激活和組裝谎势。 一旦被激活，寡聚化的 NLRP3 就會募集含有半胱天冬酶募集結構域 (ASC) 的接頭蛋白凋亡相關speck-like蛋白躲查。 組裝的 ASC 反過來與 Caspase-1 相互作用并激活 Caspase-1 以形成炎性體。Caspase-1 的激活導致 pro-IL-1β 和 pro-IL-18 裂解為成熟和功能形式译柏。通過免疫細胞的募集 和激活關鍵免疫通路镣煮，IL-1β 對于宿主防御感染至關重要。 然而鄙麦，不受控制和失調的 IL-1β 產生與多種炎癥性疾病的發(fā)展有關典唇。

在急性 KD 中，患者表現(xiàn)出循環(huán) IL-1β 和 IL-18 濃度升高胯府，隨后通過 IVIG 治療降低介衔。與 IL-1 信號通路相關的基因表達增加與急性 KD 和 IVIG 耐藥相關掸茅。單核苷酸介導 NLRP3 炎癥小體激活的肌醇 1,4,5-三磷酸 3 激酶 (ITPKC) 基因的多態(tài)性與急性 KD撞芍、CAA 和 IVIG 抗性相關。此外来农，IL1B 基因中的單核苷酸多態(tài)性與冠狀動脈病變和 IVIG 抗性的發(fā)展寒波。使用 IL-1 受體拮抗劑阿那白滯素阻斷 IL-1 通路可有效治療 IVIG 耐藥 KD 患者乘盼。同時新出現(xiàn)的數(shù)據(jù)也表明，長期抑制 IL-1β 可能顯著增加感染風險俄烁，尤其是侵襲性A 組鏈球菌绸栅，阿那白滯素是 KD 的短期治療方法，感染風險的增加可能不是特別關注的問題页屠。然而粹胯，用小分子抑制劑直接靶向 NLRP3 可能通過阻斷 IL-1β 和 IL-18 的產生為 KD 治療提供額外的優(yōu)勢。

為了為 IVIG 耐藥 KD 兒童設計適當?shù)闹委煾深A措施辰企，迫切需要在單細胞水平上更好地表征參與病理性 KD 免疫反應的細胞和分子改變风纠。 在這里，研究對來自健康對照 (HC)牢贸、急性和恢復期 IVIG 治療的 KD 患者的公開可用轉錄組學數(shù)據(jù)集進行分析和細胞解卷積议忽，并揭示循環(huán)先天免疫細胞的比例增加以及與 NLRP3-IL-1β 相關的轉錄本表達升高 during acute KD。 使用充分描述和接受的干酪乳桿菌細胞壁提取物 (LCWE) 小鼠 KD 血管炎模型十减，我們發(fā)現(xiàn) NLRP3 的藥理學抑制可防止血管組織炎癥的發(fā)展栈幸。此外，單細胞 RNA 測序（scRNA-seq）和空間轉錄組學（ST）在穩(wěn)態(tài)和 LCWE 誘導的 KD 血管炎期間產生了血管組織的全面細胞圖譜帮辟，揭示了不同免疫細胞在空間上發(fā)炎的血管中有組織和密集的浸潤速址。這種浸潤由巨噬細胞、單核細胞和樹突細胞 (DC) 組成由驹，它們表達高水平的 NLRP3-IL-1β 通路轉錄物芍锚。在心血管病變中昔园，觀察到血管平滑肌細胞 (VSMCs) 1 型到 VSMCs 2 型的表型轉換，它們具有纖維肌細胞和合成 VSMCs 的特性并炮，并顯示收縮蛋白的表達減少默刚，成纖維細胞標志物的表達增加，MMPs（基質）金屬蛋白酶）逃魄、炎癥和增殖標志物荤西。這些 2 型 VSMC 圍繞浸潤的先天免疫細胞的核心產生 IL-1β，并表達高水平的 IL-1 受體 (IL-1R) 轉錄物伍俘。 VSMCs 上 IL-1β 信號的可誘導基因缺失減弱了 VSMCs 2 型表型轉換邪锌，并顯著降低了 LCWE 誘導的心血管病變的發(fā)展。因此癌瘾，研究確定了在鼠 KD 發(fā)炎的血管組織中參與 IL-1β 產生和信號傳導的細胞亞群觅丰，并為靶向 NLRP3 以抑制與 KD 相關的心血管病變提供了基本原理。

RESULTS

Increased Expression of IL1B and NLRP3-Related Genes During Human KD

人類 KD 患者的轉錄組分析和遺傳研究以及用 KD 實驗鼠模型獲得的結果表明 NLRP3 激活和 IL-1β 產生在 KD 發(fā)病機制中起核心作用 然而妨退，產生或響應 IL-1β 的細胞亞群并涉及 在 KD 的發(fā)病機制中尚不清楚妇萄。首先生成了一個 IL-1β 基因特征，包括參與 IL-1β 產生（NLRP3咬荷、IL1B嚣伐、CASP1、GSDMD 和 PYCARD）或 IL-1β 信號傳導（MYD88萍丐、IL1R1 和 IL1RAP）的基因轩端，并檢查了它們在公開可用的表達（來自急性 KD 患者與 HC 或急性 KD 患者與恢復期 IVIG 治療的 KD 患者血液的基因表達數(shù)據(jù)集）。與 HC 患者相比逝变，急性 KD 患者中參與 IL-1β 產生或 IL-1 信號傳導的特征基因的表達增加基茵。

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• 注：Heatmaps illustrating the expression of genes involved either in IL-1β production (NLRP3, IL1B, CASP1, GSDMD, and PYCARD) or IL-1β signaling (MYD88, IL1R1, and IL1RAP) in blood from patients with acute KD compared with healthy control (HC) (GSE68004 and GSE73461) and patients with acute KD compared with convalescent KD patients (GSE63881). Color gradient represents expression relative to the mean of each row. Differential expression was analyzed with GEO2R and only genes of interest with an FDR <0.05 are represented.

重要的是，恢復期患者的KD resolution與這些 IL-1β 產生和信號基因特征的下調相關壳影。 對顯著差異表達基因的Ingenuity pathway analysis(IPA) 表明與炎癥反應相關的多個經(jīng)典通路上調拱层，例如 IL-8 和 IL-6 信號傳導、toll 樣受體信號傳導宴咧、急性期反應信號傳導和炎癥小體通路的上調（在急性 KD 患者中與 HC 或恢復期 KD 患者進行比較）根灯。為了表征 KD 患者血液的相對細胞異質性，我們對公開可用的基因表達數(shù)據(jù)集進行了細胞去卷積分析 (CIBERSORT掺栅，bulk數(shù)據(jù)的解卷積分析也是當前研究的一個很好的方向)烙肺。

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• 注：CIBERSORT cell deconvolution analysis of gene expression from patients with acute KD compared with HC (GSE68004 and GSE73461) and acute KD compared with convalescent KD patients (GSE63881). The cell proportion of each column sums to 1. FDR indicates false discovery rate.

與 HC 和恢復期 KD 患者相比，急性 KD 患者表現(xiàn)出中性粒細胞和單核細胞數(shù)量增加氧卧。 總之桃笙，這些數(shù)據(jù)表明，在急性 KD 患者中沙绝，與 NLRP3 誘導的 IL-1β 產生和信號傳導以及與中性粒細胞和單核細胞相關的基因表達相關的通路增加搏明。

NLRP3 藥理阻斷可預防 LCWE 誘導的 KD 血管炎

在 KD 血管炎實驗模型中阻斷 IL-1 信號傳導成功地阻止了心血管病變的發(fā)展鼠锈，這導致了最近在 IVIG 耐藥 KD 患者中使用阿那白滯素（一種 IL-1R 拮抗劑）的 2 期臨床試驗。此外星著，預防性中和 IL -18购笆，與 IL-1β 一樣，合成為需要 NLRP3 激活和由 Caspase-1 處理的無活性前體虚循，減少了 LCWE 注射小鼠心血管病變的發(fā)展同欠。

由于 IL-1β 和 IL-18 有助于 LCWE 誘導的 KD 血管炎的發(fā)展，并且都是 NLRP3 激活的產物邮丰，接下來檢查了特定的藥理學 NLRP3 炎癥小體抑制是否有利于預防 LCWE 誘導的小鼠 KD 血管炎行您。 MCC950 是一種有效的特異性小分子铭乾，可直接與 NLRP3 NACHT 結構域的 Walker B motif相互作用剪廉，并在體外和體內鼠模型中抑制 NLRP3 活性和炎性體形成。囊性纖維化跨膜調節(jié)劑 (CFTR) 抑制劑 172（ CFTR(inh)-172) 是 CFTR 的合成抑制劑炕檩，它也以不依賴于 CFTR 的方式阻斷 NLRP3 激活和 IL-1β/IL-18 釋放斗蒋。MCC950 和 CFTR(inh)-172 有效阻斷了體外用 LPS 和尼日利亞菌素刺激的巨噬細胞產生的 IL-1β。 在體內笛质，用 MCC950 或 CFTR(inh)-172 治療導致 LCWE 注射的 WT 小鼠腹腔灌洗液中 IL-1β 和 IL-18 的release顯著減少泉沾。

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• 注：A, IL-1β (interleukin-1β) measurements at 24 h post-LCWE injection in the peritoneal lavage of LCWE-injected WT mice pretreated with either PBS (n=19), MCC950 (n=24), or CFTR(inh)-172 (n=20). B, IL-18 measurements at 8 h post-LCWE injection in the peritoneal lavage of LCWE-injected WT mice pretreated with either PBS (n=8), MCC950 (n=6), or CFTR(inh)-172 (n=6). C and D, Representative H&E-stained heart sections

為了確定直接阻斷 NLRP3 是否可以減少 LCWE 誘導的 KD 血管炎，WT 小鼠在 LCWE 注射前一天開始每隔一天接受 MCC950 或 CFTR(inh)-172妇押。 與注射 PBS 和 MCC950 或 PBS 和 CFTR(Inh)-172 的對照小鼠相比跷究，LCWE 注射導致與冠狀動脈炎、主動脈炎和腔內肌成纖維細胞增殖相關的劇烈心臟血管炎癥敲霍，模擬人類 KD 期間觀察到的病理俊马。

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• 注：(C) and heart vessel inflammation scores (D) of WT mice injected with LCWE (n=24), LCWE and MCC950 (n=15) or LCWE and CFTR(inh)-172 (n=10) at 2-wk post-LCWE injection. Scale bars, 500 μm. E and F, Pictures of the abdominal aorta area and H&E staining of abdominal aorta cross-sections。

相比之下肩杈，MCC950 或 CFTR(inh)-172 治療顯著減少了 LCWE 誘導的心臟血管炎癥以及腹主動脈擴張和動脈瘤的發(fā)展柴我。接下來測量了用或不用 MCC950 或 CFTR(inh)-172 處理的 PBS 和 LCWE 注射小鼠的血清中各種促炎細胞因子和趨化因子的產生。 注射后 2 周扩然，LCWE 導致 IL-6 和趨化因子 CXCL1 水平升高艘儒； 已知介導中性粒細胞募集。 用 NLRP3 抑制劑 MCC950 或 CFTR(inh)-172 治療可減少 LCWE 誘導的 IL-6 和 CXCL1 產生夫偶，同時促進抗炎細胞因子 IL-10 的產生界睁。 有趣的是，在用 NLRP3 抑制劑治療的 LCWE 注射小鼠中發(fā)現(xiàn) MIP-1α 和 MIP2 增強兵拢，這可能反映了這些趨化因子促進巨噬細胞愈合反應晕窑。 總的來說，這些發(fā)現(xiàn)表明卵佛，用 MCC950 和 CFTR(inh)-172 抑制劑直接靶向 NLRP3 炎癥小體激活足以在小鼠中預防 LCWE 誘導的心臟炎癥和腹主動脈擴張和動脈瘤的發(fā)展杨赤。

Cellular Landscape in LCWE-Induced Abdominal Aorta Vasculitis

為了確定在鼠 KD 血管炎期間炎癥和心血管病變發(fā)展中涉及的細胞組成和分子網(wǎng)絡敞斋，接下來通過 scRNA-seq 檢查了注射 PBS 和 LCWE 的對照小鼠的腹主動脈組織。 正如預期的那樣疾牲，LCWE 注射導致腹主動脈擴張和動脈瘤的發(fā)展植捎。為了獲得穩(wěn)態(tài)和 LCWE 誘導的 KD 血管炎期間腹主動脈細胞的圖譜，從新鮮分離的腹主動脈組織中生成了 scRNA-seq libraries阳柔，這些組織從左腎動脈延伸到 PBS 和 LCWE 注射小鼠的主動脈分叉處焰枢。在生物信息學去除雙細胞、死細胞和細胞碎片后舌剂，PBS 對照懸浮液中的 5386 個細胞和 LCWE 懸浮液中的 5091 個細胞被納入后期質量控制分析济锄。 來自 PBS 和 LCWE 條件的單細胞轉錄組被投影到統(tǒng)一流形近似和投影圖（UMAP）中以進行可視化。通過使用基于圖的方法結合規(guī)范相關性對齊和整合數(shù)據(jù)集來確定 PBS 和 LCWE 中共享和發(fā)散的細胞類型分析霍转。 在這個cluster空間中荐绝，我們確定了 25 個我們用 SingleR 自動注釋的細胞類型。（不知道這樣的UMAP圖避消，是不是被大家認為是批次效應去除了呢低滩？）

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• 注：C, Experimental design of the scRNA-seq experiment. Single-cell suspensions were obtained from the abdominal aorta of PBS (n=9 tissues pooled) and LCWE-injected mice (n=6 tissues pooled) 2-wk post-injection. Following magnetic dead cell removal, cells were encapsulated and profiled using the Chromium 10× Genomics 3’ V3 kit. D, UMAP plot of all abdominal aorta cells isolated from PBS (n=5386 cells, blue) and LCWE-injected (n=5091cells, red) WT mice. E, UMAP plot as in (D) with cell type annotation.

對照小鼠的腹主動脈主要由基質細胞 (97.6%) 組成，包括 1 型 VSMC岩喷、成纖維細胞恕沫、血管內皮細胞 (BEC) 和淋巴管內皮細胞，而免疫細胞群很少纱意。 相比之下婶溯，LCWE 注射小鼠的腹主動脈擴張和動脈瘤主要由先天性和適應性免疫細胞組成 (69.3%)

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Spatially Organized Communication Between Monocytes, DCs, Macrophages, and Stromal Cells Through the NLRP3/IL-1β/IL-18 Pathway

由于 IL-1β 在 KD 發(fā)病機制中具有關鍵作用，接下來試圖破譯參與 IL-1β 產生或 IL-1 信號傳導的腹主動脈細胞網(wǎng)絡偷霉。 與之前的報告一致迄委，即 LCWE 注射小鼠腹主動脈中的 CD11c⁺ 巨噬細胞表現(xiàn)出 Caspase-1 (Casp1) 活性并且是 IL-1β 的來源,觀察到 Nlrp3、Pycard腾它、Casp1 和 Il1b 的共表達跑筝，這些關鍵成分 IL-1β 產生途徑的影響，在浸潤性巨噬細胞瞒滴、炎性單核細胞（Cd14hi CD16/Fcgr3+ 單核細胞 1 型）和 DC 中曲梗。

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• 注：A, UMAP visualization (as in Figure 3D) split to show separated visualization of the scRNA-seq datasets from the abdominal aorta of PBS and LCWE-injected mice and representing a gradient expression of selected genes related to NLRP3 activation, IL-1β, and IL-18 production. Greyyellow-red gradient: min-max normalization of CP10K expression. B, Similar UMAP visualization in which cells in pink coexpress genes associated to the IL-1β production pathway (MyD88, Pycard, Casp1, and Il1b).

嗜酸性粒細胞和中性粒細胞也證實了這些標志物的共表達，表明它們也可能有助于 KD 血管炎期間腹主動脈中 IL-1β 的產生妓忍。 在 LCWE 注射小鼠的腹主動脈中觀察到 Il18 轉錄物的類似表達模式虏两，Nlrp3、Pycard世剖、Casp1 和 Il18 的共表達主要在 1 型炎性單核細胞和浸潤性巨噬細胞中觀察到定罢。在 NLRP3 激活和 IL-1β/IL-18 生產軸的另一端，包括 1 型 VSMC旁瘫、2 型 VSMC祖凫、成纖維細胞和 BEC 在內的基質細胞共表達 Il1r1琼蚯、Il1rap 和 Myd88，這是 IL-1β 信號傳導所必需的 , 而免疫細胞群只有這些基因的分散和低共表達

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• 注：C, UMAP visualization split to show separated visualization of the scRNA-seq datasets from the abdominal aorta of PBS and LCWE-injected mice and representing a gradient expression of selected genes related to the IL-1 and IL-18 signaling pathways. Grey-yellow-red gradient: min-max normalization of CP10K expression. D, Similar UMAP visualization in which cells in pink coexpress genes associated to the IL-1 signaling pathway (Il1r1, Il1rap, and MyD88). CP10K indicates counts per 10 000 reads; and VSMC, vascular smooth muscle cell.

相反惠况，IL-18 信號傳導所需的 Il18r1遭庶、Il18rap 和 Myd88 基因的共表達主要在免疫細胞上觀察到，例如浸潤性 T 細胞稠屠、NK 和 NK T 細胞峦睡，而不是基質細胞。其他 NLRP3 和 IL-1β 相關基因的表達也在 LCWE 注射小鼠的腹主動脈中上調权埠。 有趣的是榨了，編碼 IL-1 誘餌受體的 Il1r2 在抗原呈遞細胞亞群中的表達很高.

接下來使用 ST 來表征空間組織和 NLRP3/IL-1β/IL-18 介導的細胞通訊在小鼠 KD 血管炎期間驅動 LCWE 誘導的心臟組織病變。來自注射 PBS 和 LCWE 的對照小鼠的心臟組織是注射后 2 周收集攘蔽，并使用 10x Genomics Visium 平臺分析組織切片

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經(jīng)過質量控制分析龙屉，例如排除未覆蓋組織的spot和相關H＆E切片上折疊等加工偽影，分別分析了LCWE和PBS注射小鼠心臟組織切片中的683和1803個spot秩彤，平均每個spot覆蓋了3610個基因叔扼。 spot和數(shù)據(jù)集中共有 18408 個基因事哭。 心臟組織切片的病理分析表明漫雷，與 PBS 注射相比，LCWE 注射導致細胞浸潤和 CAA 血管重塑

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• 注：Heart tissue sections from PBS and LCWE-injected mice used for ST. Scale bars, 1 mm. H&E staining of the heart tissue sections (left) and H&E-stained tissue sections overlaid with the 3 clusters identified in an unsupervised manner in the transcriptomic data showing correlation with ventricle (cluster 0), atrium (cluster 1), and coronary/aorta (cluster 2) (right).

使用基于圖形的方法結合CCA對齊和整合數(shù)據(jù)集鳍咱，我們確定了 3 個不同的cluster對應于定義的解剖區(qū)域：心室降盹、心房和冠狀動脈/主動脈，如 H&E 部分和轉錄譜（心室中的 Myl2谤辜， Myl7 在中庭）蓄坏。正如腹主動脈 scRNA-seq 分析所觀察到的，LCWE 和 PBS 冠狀動脈/主動脈簇具有顯著的基因表達差異（n=1732 個基因丑念，F(xiàn)C>2 和 FDR<0.05）涡戳，包括基因 Ptprc/Cd45、Il1b脯倚、Lyz2渔彰、和 Ly6a/Sca-1。 LCWE 樣本中上調基因的基因本體論分析確定了幾個與炎癥推正、免疫細胞遷移以及重要的是細胞對細胞因子（包括 IL-1 和 TNF）反應相關的基因集恍涂。對下調基因的類似分析確定了與正常心臟功能有關的途徑，例如肌肉收縮和代謝植榕。對 LCWE 和 PBS 冠狀動脈/主動脈簇之間差異表達基因的 IPA 上游調節(jié)器分析確定 Tnf再沧、Ifng、Tgfb1 和 Il1b 為the top regulators尊残。

在scRNA-seq 分析中使用定義不同細胞類型的基因標記炒瘸，我們繪制了它們在 PBS 和 LCWE 注射小鼠心臟組織中的空間定位淤堵。 來自注射 LCWE 的心臟組織圍繞發(fā)炎冠狀動脈的細胞浸潤主要包含單核細胞、DC 和巨噬細胞顷扩，而中性粒細胞粘勒、嗜酸性粒細胞和淋巴細胞則散布在整個心肌中.

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這些細胞浸潤在 PBS 對照小鼠的穩(wěn)態(tài)下檢測到最低限度，表明它們參與了 LCWE 誘導的 KD 血管炎期間心臟炎癥和病變的發(fā)展屎即。 注意的是庙睡，根據(jù) scRNA-seq 分析，炎癥浸潤與 NLRP3技俐、IL-1β 和 IL-18 通路相關轉錄本的高表達在空間上重疊乘陪。對 1 型和 2 型 VSMC 基因進行空間定位顯示，與 PBS 對照相比雕擂，LCWE 誘導的炎癥期間 1 型 VSMC 減少啡邑，而 2 型 VSMC 表達了更高水平的參與 IL-1 信號通路的基因，例如 IL- 1 受體 (Il1r1)井赌、Il1rap 和 Myd88谤逼，在注射 LCWE 后冠狀動脈周圍更豐富。 成纖維細胞圍繞 2 型 VSMC 的血管周圍核心仇穗，并在空間上與 IL-1 信號相關的轉錄本重疊流部，盡管水平低于富含 2 型 VSMC 的區(qū)域。 IL-18 信號通路相關基因（Il18r1纹坐、Il1rap 和 Myd88）的共表達強度低于 IL-1 信號通路枝冀。

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總體而言，LCWE 誘導的 KD 血管炎與心血管病變中先天性和適應性免疫細胞的強烈浸潤有關耘子，這些細胞高度表達與 IL-1β 產生相關的基因果漾。 在 LCWE 注射小鼠的心臟組織中，浸潤的單核細胞谷誓、巨噬細胞和包圍發(fā)炎冠狀動脈病變的 DC 的核心是 IL-1β 產生的主要來源绒障，并被 2 型 VSMC 和成纖維細胞包圍，它們表達高水平的基因 屬于 IL-1 信號通路捍歪。 在注射 LCWE 的小鼠的發(fā)炎腹主動脈組織中也觀察到與 IL-1β 產生或信號傳導相關的類似基因表達的細胞模式户辱。

IL-1 Signaling in VSMCs Mediates LCWEInduced KD Vasculitis

通過腹主動脈和心臟組織病變 ST 的 scRNA-seq，發(fā)現(xiàn)在 LCWE 誘導的 KD 血管炎期間费封，由于 Il1r1焕妙、Il1rap 和 Myd88 共表達，包括 VSMC 和成纖維細胞在內的基質細胞對 IL-1 的反應能力最大 . 此外弓摘，ST 證明 IL1 反應細胞集中在發(fā)炎冠狀動脈周圍的區(qū)域焚鹊，與成纖維細胞和 VSMC 共定位，表明 IL-1β 可能作用于這些細胞以介導發(fā)病機制。 因此末患，試圖更好地了解這些細胞類型中的基因表達和表型變化研叫。

差異基因表達分析 (FDR<0.05, FC>2) 表明，LCWE 注射小鼠腹主動脈中的成纖維細胞顯示與蛋白質翻譯相關的轉錄本（包括 45 個核糖體蛋白基因璧针、9 個真核翻譯起始因子）的表達大量增加 基因和 2 個線粒體核糖體蛋白基因）嚷炉，以及參與細胞粘附和免疫反應的基因。 IPA 上游調節(jié)器分析確定了調節(jié)細胞代謝的 Mlxipl 作為這些基因以及炎性細胞因子（包括 Tnf探橱、Ifng 和 Il1b）的頂級調節(jié)器申屹。 LCWE 上調基因的基因本體分析確定了涉及翻譯、細胞粘附隧膏、免疫和炎癥反應哗讥、血管生成、膠原纖維組織和骨化的途徑胞枕，而對 LCWE 下調的基因的類似分析確定了涉及細胞外基質組織杆煞、細胞粘附、 骨化和膠原信號傳導.

差異基因表達分析 (FDR<0.05,FC>2) 表明腐泻，LCWE 注射小鼠腹主動脈中的 VSMC 顯示出與成纖維細胞（Lum决乎、Dcn、Thbs1 和 Fbln2）相關的轉錄本表達大幅增加和下調 參與收縮功能的轉錄本派桩，包括 Myh11构诚、Myl9、Lmod2窄坦、Tpm2唤反、Myocd 和 Acta2凳寺。此外鸭津，來自 LCWE 注射小鼠的 VSMC 顯示出 MMP（Mmp2 和 Mmp14）、MMP 抑制劑 Timp1肠缨、趨化因子和參與免疫細胞募集的基因（Cxcl1逆趋、Cxcl12、Cxcl2晒奕、Ccl2 和 Vcam1）的表達增強闻书。 IPA 上游調節(jié)因子分析確定 Il1b 是這些基因的頂級調節(jié)因子，其他重要的上游調節(jié)因子是 Myd88 和其他炎性細胞因子脑慧，包括 Tnf魄眉、Ifng、Il22 和 Il18闷袒。LCWE 注射后 VSMC 中上調基因的基因本體分析確定了涉及炎癥坑律、趨化性、細胞遷移和傷口愈合的通路囊骤，而對 LCWE 下調的基因進行的類似分析確定了涉及細胞粘附晃择、細胞外基質組織冀值、肌肉和心臟發(fā)育的通路， 肌肉收縮宫屠、彈性纖維組裝列疗、細胞遷移和細胞生長。 總體而言浪蹂，這些數(shù)據(jù)表明 LCWE 誘導腹主動脈中 VSMC 的顯著表型轉換抵栈。

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• 注：A, Gene expression profile (Volcano plot) of abdominal aorta VSMCs from LCWE-injected mice vs VSMCs from control PBS-injected mice (red represents FDR <0.05 and FC >2). B, IPA analysis of upstream regulators (top 10 up-(red) and top 5 down (blue)) in abdominal aorta VSMCs of LCWE-injected mice when compared with PBS control mice. C, Biological process of upregulated and downregulated genes (FC>2, FDR<0.05) in VSMCs from the abdominal aorta of LCWE-injected mice when compared to control PBS mice. The size of the dot represents how many genes were found in the biological pathway and the color indicates up or downregulation of those genes.

Overall, these data demonstrate LCWE induces a profound phenotype switch of VSMCs in the abdominal aorta.

ST 數(shù)據(jù)顯示 2 型 VSMC 位于冠狀動脈的血管周圍區(qū)域，靠近產生 IL-1β 的細胞坤次。 此外竭讳，VSMC 基因表達變化的最高調節(jié)因子是 IL-1β，這使我們假設 VSMC 可能是介導 IL-1β 致病反應的主要細胞類型浙踢。 我們接下來通過使用具有他莫昔芬誘導的平滑肌細胞 (SMC) 特異性 Il1r1 敲除的小鼠（Myh11^Cre-ERT2 小鼠與 Il1r1^fl/fl 小鼠雜交）研究了 VSMC 中的 IL-1 信號傳導如何促進 LCWE 誘導的 KD 血管炎的發(fā)展绢慢。 Myh11^Cre-ERT2 Il1r1^Δ/Δ 和 Il1r1^fl/fl 同窩對照小鼠喂食他莫昔芬 2 周以誘導 Il1r1 缺失，然后在 LCWE 注射前在normal chow上休息 4 周.In a separate experiment, Il1r1^fl/fl littermate controls and Myh11^Cre-ERT2 Il1r1^Δ/Δ mice were injected IP with tamoxifen for 5 consecutive days, then rested for 4 weeks before LCWE injection. In both experimental models, the specific deletion of Il1r1 in SMCs during LCWE-induced KD vasculitis resulted in significantly reduced heart vessel inflammation and abdominal aorta dilatation and aneurysm formation.這一發(fā)現(xiàn)表明 VSMC 中的 IL-1R 信號傳導對 LCWE 誘導的 KD 血管炎具有深遠的影響洛波，并且 VSMC 可能是 IL-1 誘導的腹主動脈瘤和 CAA 形成的主要介質胰舆。

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• 注：C, UMAP visualization (as in Figure 3D) split to show separated visualization of the scRNA-seq datasets from the abdominal aorta of PBS and LCWE-injected mice and representing a gradient expression of Acta2, Lum, and Mki67. Grey-yellow-red gradient: min-max normalization of CP10K expression. D, Annotated H&E heart sections from PBS and LCWE-injected mice (as in Figure 6C) and overlaid expression of Acta2, Lum, and Mki67. Dark blue spots; no coexpression of Acta2, Lum, and Mki67. Light blue-red gradient: min-max normalization of CP10K expression. Scale bars, 500μm

DISCUSSION

在這里，使用 scRNA-seq 和 ST 分析在 KD 血管炎小鼠模型中創(chuàng)建了浸潤心血管病變的免疫細胞的轉錄組圖譜蹬挤。 我們的研究表明缚窿，多種先天性和適應性免疫細胞遷移到發(fā)炎的血管組織，并且與 NLRP3 炎癥小體激活焰扳、IL-1β 產生和信號傳導相關的轉錄物在心血管病變中大量表達倦零。 我們發(fā)現(xiàn)特定的免疫細胞亞群，如巨噬細胞吨悍、單核細胞和 DCs扫茅，是 IL-1β 的主要來源，而基質細胞育瓜，如成纖維細胞和 VSMCs葫隙，對 IL-1β 有反應，這導致表型重編程和 心血管病變躏仇。 IL-1 在 KD 血管炎期間的致病作用得到了人類轉錄組數(shù)據(jù)集的進一步支持恋脚，該數(shù)據(jù)集顯示在急性 KD 期間 IL1 和 NLRP3 相關基因的豐度增加。 用特定的小分子抑制劑阻斷 NLRP3 激活焰手，或阻止 VSMC 上的 IL-1β 信號傳導糟描，減少了小鼠 KD 心血管病變的發(fā)展。 通過鑒定參與 KD 炎癥反應的關鍵細胞亞群并強調 NLRP3 炎癥小體和 IL-1β 信號在 KD 血管炎期間的重要性书妻，我們的結果提高了目前對 KD 發(fā)病機制的理解船响，并表明靶向 NLRP3/IL-1β 通路可能 抑制 KD 兒童心血管病變的發(fā)展。

從 KD 患者身上收集的死后組織的組織學分析表明，在疾病的急性期灿意，CAA 中存在 CD8⁺ T 細胞估灿、IgA⁺ 漿細胞以及中性粒細胞和巨噬細胞；然而缤剧，它們對 KD 發(fā)病機制和炎癥反應的具體貢獻仍不清楚馅袁。我們對 LCWE 誘導的 KD 小鼠模型中腹主動脈瘤和擴張以及心臟組織的 scRNA-seq 和 ST 分析也揭示了免疫細胞的深刻浸潤，例如活化的 T 細胞荒辕、DC汗销、單核細胞和巨噬細胞。心外膜冠狀動脈炎和進行性管腔肌成纖維細胞增殖等組織學特征是人類 KD 的病理標志抵窒，在 LCWE 誘導的 KD 血管炎中也觀察到這些特征弛针，并且可以通過用于治療人類 KD 的療法來預防，例如 IVIG 和 IL-1β 抑制劑或IL-1R 拮抗劑（阿那白滯素）李皇。此外削茁，與人類 KD 類似，注射 LCWE 的小鼠會出現(xiàn)心肌炎和長期并發(fā)癥掉房，例如心肌重構和纖維化茧跋。急性 KD 期間循環(huán) IL-1β 和 IL-18 的水平增加。 然而卓囚，缺乏參與 IL-1β 產生和響應 IL-1β 的細胞亞群的身份瘾杭，這對于理解潛在的病理機制至關重要驅動 KD 血管炎。

研究表明哪亿，在 LCWE 誘導的心血管病變中粥烁，浸潤性巨噬細胞、單核細胞和 DC 表達高水平的 Nlrp3蝇棉、Il1b讨阻、Pycard、Casp1 和 Il18 轉錄本银萍，這表明這些細胞可能是 IL-1β 和 IL 的主要來源 -18 在發(fā)炎的腹主動脈瘤和心臟冠狀動脈病變中变勇。 這些結果與先前發(fā)表的研究結果一致，即來自 LCWE 注射小鼠心血管病變的巨噬細胞顯示出 caspase-1 活性贴唇。 有趣的是，與 Nlrp3 相比飞袋，這些細胞中 Nlrc4 和 Nlrp12 的表達相對較低戳气，表明 NLRP3 炎性體是 LCWE 誘導的 KD 血管炎期間 IL-1β 的主要激活劑。 然而巧鸭，IL-1R 轉錄物 (Il1r1) 在浸潤病變的免疫細胞中的表達很少瓶您，表明它們的致病功能可能獨立于直接的 IL-1R 信號傳導。

在 LCWE 誘導的 KD 血管炎期間，心血管病變的基質細胞群的巨大變化是明顯的呀袱。 ScRNA-seq 和 ST 分析揭示了在 LCWE 誘導的 KD 血管炎期間 VSMCs贸毕、成纖維細胞和 BECs 群體的全局轉錄組的巨大變化，表明可能的表型和功能變化夜赵。 在之前的一份報告中明棍，我們在 WT 和 Il1r1^-/- 小鼠之間產生了骨髓嵌合小鼠，并表明在 LCWE 誘導的 KD 血管炎中寇僧，非內皮基質細胞需要 IL-1 信號傳導摊腋，而不是骨髓衍生的造血細胞。 與這些發(fā)現(xiàn)一致嘁傀，心臟組織切片的腹主動脈和 ST 的 scRNA-seq 分析表明兴蒸，IL-1 信號傳導所需的 Il1r1、Il1rap 和 Myd88 的共表達僅限于心血管病變中的基質細胞 细办，包括 VSMC橙凳、成纖維細胞和 BEC.

觀察到，在注射 LCWE 的小鼠的腹主動脈和 CAA 中笑撞，VSMCs 表型從 1 型轉變?yōu)?2 型 VSMCs痕惋。表型轉換的 VSMC 2 型共表達 αSMA 和 Lumican 位于冠狀動脈周圍的血管周圍區(qū)域，靠近產生 IL-1β 的細胞娃殖。在健康組織中值戳，VSMC 具有收縮表型，可提供機械強度和血管張力炉爆。在動脈粥樣硬化和腹主動脈瘤等疾病中堕虹，VSMC 會發(fā)生表型轉換。 “合成”VSMC 的特征是收縮蛋白表達減少芬首、MMP 表達增加赴捞、增殖和遷移增強以及細胞凋亡增加。在動脈粥樣硬化中郁稍，“血管平滑肌細胞到成纖維細胞的轉變”也已被確定赦政，平滑肌細胞 (SMCs) 分化為纖維肌細胞，這一過程甚至可能對動脈粥樣硬化有益耀怜。 事實上恢着，雖然 IL-1β 在促進動脈粥樣硬化病變方面起著致病作用并且靶向 IL-1β 導致心血管事件的復發(fā)率顯著降低，一些研究還表明财破，IL-1β 信號還可以通過促進 VSMCs 轉換來保護晚期動脈粥樣硬化掰派，導致纖維帽重塑，增加斑塊穩(wěn)定性動脈粥樣硬化左痢，在這里靡羡，我們表明 VSMC 中 Il1r1 的特定缺失減弱了 LCWE 誘導的 KD 血管炎期間向 2 型 VSMC 的表型轉換系洛，表明 IL-1β 直接介導了這一過程。在 LCWE 注射小鼠的腹主動脈中觀察到的 VSMC 具有纖維肌細胞和合成 VSMC 的特性略步，顯示收縮蛋白的表達減少描扯，成纖維細胞標記物、MMP趟薄、炎癥和增殖標記物的表達增加绽诚。在 KD 血管炎中，VSMC 向肌成纖維細胞的轉變顯然是有害的竟趾，因為它通過管腔肌成纖維細胞增殖導致冠狀動脈狹窄憔购，這是 KD 血管炎病理學的標志。 VSMCs 1 型向 VSMCs 2 型的這種表型轉變岔帽，更增殖和表達 VSMC 和“成纖維細胞樣”特征玫鸟，可能參與 LCWE 注射小鼠冠狀動脈的閉塞性重塑。與我們的研究一致犀勒，已發(fā)現(xiàn) IL-1β 可直接調節(jié)平滑肌細胞表型屎飘，包括平滑肌細胞標志物（Acta2 和 Myh11）的下調和促炎基因的誘導，以及 MMP3 介導的增殖的誘導.

盡管 IVIG 治療降低了發(fā)生 CAA 的風險贾费，但高達 20% 的 KD 患者對 IVIG 具有抗藥性钦购，并且發(fā)生 CAA 的風險更大。因此褂萧，研究替代的有效和更有針對性的療法以預防 CAA 的發(fā)展是一個主要的研究重點屈呕。

對來自 KD 患者的公開可用測序數(shù)據(jù)集的轉錄組分析囚戚，以及與急性 KD 期間 IL-1β 和 IL-18 循環(huán)水平升高的報告以及使用 KD 血管炎實驗模型收集的證據(jù)相關的已發(fā)表研究，都集中在一個關鍵的NLRP3/Caspase-1/IL-1 通路在這種疾病中的致病作用。雖然阿那白滯素目前正在用于治療 IVIG 耐藥患者的各種臨床試驗中進行測試湿痢，但 NLRP3 抑制劑可能提供一個有吸引力的替代方案蜈彼，因為它們可以抑制額外的NLRP3 介導的炎癥通路终娃，同時降低感染風險服傍，可以口服給藥。我們研究的一個關鍵方面是證明用 2 個獨立抑制劑直接靶向 NLRP3 炎癥小體成功地預防了 LCWE 注射小鼠的 CAA 和腹主動脈瘤和擴張节猿。 MCC950 是一種高度特異性和有效的 NLRP3 小分子抑制劑票从，可在體外和體內阻止 NLRP3 寡聚化、炎癥小體功能以及 IL-1β 和 IL-18 的產生.

CFTR(inh)-172 是一種合成的 CFTR 抑制劑滨嘱，據(jù)報道也能以不依賴 CFTR 的方式阻斷 NLRP3 激活和 IL-1β/IL-18 釋放峰鄙。兩種 NLRP3 抑制劑在降低 LCWE 誘導的心血管疾病的嚴重程度方面都非常有效 這種 KD 血管炎小鼠模型中的病變。 研究表明九孩，MCC950 治療減少了 Apoe^-/-（載脂蛋白-e 缺陷小鼠）的動脈粥樣硬化病變的發(fā)展先馆，減少了心肌梗塞小鼠模型中的心臟纖維化并改善了心臟重構，并防止了主動脈瘤小鼠模型中的主動脈破壞和動脈瘤形成躺彬。 動脈瘤煤墙，突出其對心血管疾病的治療潛力。 連同我們的數(shù)據(jù)顯示 MCC950 和 CFTR(inh)-172 通過抑制 IL-1β 抑制 LCWE 誘導的 KD 血管炎宪拥，有令人信服的證據(jù)表明使用 NLRP3 抑制劑來抑制 KD 和其他炎癥性血管疾病仿野。

與 IL-1β 阻斷相比，NLRP3 抑制可能通過抑制 IL-18 成熟和細胞焦亡細胞死亡她君，從而更大程度地抑制 IL-1β 依賴性和非依賴性炎癥脚作。與發(fā)熱對照組相比，急性 KD 患者血清中的 IL-18 水平顯著升高缔刹。13 在 LCWE 誘導的 KD 小鼠模型中球涛，我們觀察到 IL-18 在驅動心臟血管炎癥中起重要作用。因此校镐，IL-1β 和 IL-18 可能協(xié)同作用以驅動 KD 病變的發(fā)展亿扁。我們的 scRNA-seq 和 ST 數(shù)據(jù)表明 IL-1β 和 IL-18 轉錄物由血管病變中的單核細胞和巨噬細胞表達。然而鸟廓，與基質細胞上的 IL-1β 信號傳導相反从祝，IL-18 可能主要通過 T 細胞、NK T 細胞和 NK 細胞上的信號傳導發(fā)揮作用引谜。 IL-18 與許多自身炎癥和心血管疾病有關牍陌，包括動脈粥樣硬化。事實上员咽，IL-18 在存在于 Apoe^-/- 小鼠動脈粥樣硬化斑塊中的巨噬細胞中高度表達毒涧，并且 IL-18 促進巨噬細胞 IFN-γ 表達。56,57 IL-18 還增加了 IL-12 誘導的 IFN-γ 表達CD4⁺ 和 CD8⁺ T 細胞贝室、NK 細胞和巨噬細胞契讲。 5雖然需要進一步研究來研究 IL-18 功能的確切機制，以及 IL-18 和 IL-1β 如何協(xié)同作用档玻，但研究結果表明怀泊，阻斷 NLRP3 將抑制 IL-1β 和 IL-18 驅動的心臟血管炎癥，因此可能比僅針對 IL-1β 途徑的治療策略更有效误趴。

總之霹琼，文章確定了心血管病變中 VSMC 向增殖性和炎癥性成纖維細胞樣細胞類型的表型轉換，并且 IL-1β 信號傳導是 KD 血管炎小鼠模型中致病性 VSMC 反應的核心凉当。 血管組織浸潤巨噬細胞枣申、單核細胞和 DC 表達最高水平的 NLRP3 和 IL-1β 轉錄本，我們提供了來自人類和鼠類數(shù)據(jù)的確鑿證據(jù)看杭，表明 NLRP3 是治療 KD 血管炎的強大治療靶點忠藤。

Method

單細胞部分

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空間轉錄組部分

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