板塊“與實驗結(jié)緣”代號“Destiny”（命運(yùn)）主要想與大家聊聊售滤，科研中“干”“濕”實驗結(jié)合的那些事兒笑跛。
腫瘤細(xì)胞的侵襲性是腫瘤相關(guān)信號通路琅捏、藥物治療冤狡、靶向治療等腫瘤學(xué)研究的一個重要指標(biāo)孙蒙。Transwell實驗是研究細(xì)胞遷移和侵襲能力最常用的實驗手段项棠。
以之前解析的肺腺癌（LUAD）文章[1]為例（具體解析見Masterpiece｜空間+單細(xì)胞，文章輕松上10分）挎峦，文章使用單細(xì)胞測序數(shù)據(jù)分析得知基因UBE2C影響LUAD侵襲過程香追。之后使用Transwell實驗研究基因UBE2C對肺癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響。
RNAi可以使肺癌細(xì)胞的UBE2C基因保持在靜默或休眠狀態(tài)坦胶，從而構(gòu)建UBE2C低表達(dá)肺癌細(xì)胞透典。通過Transwell實驗檢測比較正常肺癌細(xì)胞與UBE2C低表達(dá)肺癌細(xì)胞遷移、侵襲能力顿苇。實驗結(jié)果（圖1）顯示基因UBE2C沉默后峭咒，肺癌細(xì)胞遷移、侵襲能力變差纪岁。從而直接驗證單細(xì)胞測序數(shù)據(jù)的結(jié)論：基因UBE2C影響LUAD侵襲過程凑队。
下面來聊一聊Transwell實驗常見問題及解決方法。
01 ?細(xì)胞遷移和侵襲的差別
細(xì)胞遷移指的是細(xì)胞因為受到刺激（化學(xué)信號影響）從原本的位置移動到另一個位置的運(yùn)動幔翰。損傷修復(fù)漩氨、細(xì)胞分化、胚胎發(fā)育以及惡性腫瘤轉(zhuǎn)移等諸多生理/病理過程都需要通過細(xì)胞遷移來完成导匣。
細(xì)胞侵襲與細(xì)胞遷移比較類似才菠，但是"侵襲"需要細(xì)胞穿過胞外基質(zhì)層(ECM）或基底膜基質(zhì)層(BME)，在這個過程中細(xì)胞先酶解去除ECM/BME的阻礙贡定，從而在趨化因子濃度梯度驅(qū)使下完成從一處到另一處的移動（圖2）[2]赋访。細(xì)胞侵襲通常發(fā)生在正常細(xì)胞的炎癥反應(yīng)過程中，也常發(fā)生在惡性腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移過程中缓待。
02 ?Transwell基本實驗流程
Transwell小室可以架在細(xì)胞培養(yǎng)板的孔上蚓耽，底部不接觸細(xì)胞培養(yǎng)板（圖3）。待研究的細(xì)胞接種在Transwell小室的微孔膜上旋炒，在小室和下室分別加入含有不同濃度的趨化因子的培養(yǎng)基（下室濃度>小室濃度）步悠。細(xì)胞在實驗時，為了獲得更多的營養(yǎng)瘫镇，會擠壓自身以穿過微孔膜上的小孔然后粘附在小室底膜的下表面鼎兽。實驗結(jié)束后，用棉簽擦掉小室膜上表面的細(xì)胞铣除，將小室放入染色液染色谚咬，使下表面的細(xì)胞著色，就可以在顯微鏡下拍照統(tǒng)計細(xì)胞數(shù)量來評價遷移/侵襲實驗尚粘。
與遷移實驗不同的是择卦，侵襲實驗需要在小室微孔膜上額外包被一層基質(zhì)膜，包含膠原、纖粘蛋白秉继、層粘連蛋白等（注意：有侵襲能力的細(xì)胞才可用于Transwell侵襲實驗）祈噪。
03 ?如何選擇Transwell小室產(chǎn)品
一般來說尚辑，共培養(yǎng)實驗辑鲤、Caco-2 Transport實驗及構(gòu)建細(xì)胞極化模型等不需要細(xì)胞穿膜，大多選擇0.4μm或1.0μm等小孔徑的產(chǎn)品腌巾。
而在細(xì)胞遷移實驗及侵襲實驗中遂填，細(xì)胞則需要穿過小室的膜，到達(dá)膜的背側(cè)澈蝙，因此需要選擇較大孔徑吓坚，如腫瘤細(xì)胞的遷移、侵襲實驗常選擇8μm孔徑的產(chǎn)品灯荧。
04 ?實驗常見問題及解決方案
A礁击、如何判斷細(xì)胞是否有侵襲能力？
實驗前先用酶譜法檢測基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的表達(dá)逗载，特別是MMP-2的表達(dá)哆窿。有侵襲能力的細(xì)胞才可用于Transwell侵襲實驗。
B厉斟、小室放入細(xì)胞培養(yǎng)板時挚躯，出現(xiàn)氣泡，是否會影響實驗擦秽？
一旦產(chǎn)生氣泡码荔，下室培養(yǎng)液的趨化作用就減弱甚至消失了。所以將小室放入培養(yǎng)板時要注意感挥，如有氣泡產(chǎn)生缩搅，須將小室提起，去除氣泡触幼，再將小室放進(jìn)培養(yǎng)板硼瓣。
C、侵襲時間要多久置谦？
侵襲時間一般為24-48h堂鲤，可以參考遷移實驗，不建議超過這個時間媒峡，會被質(zhì)疑是否為細(xì)胞增殖瘟栖。具體時間需要根據(jù)細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力來進(jìn)行判斷。
D丝蹭、鋪細(xì)胞前，有液體穿過小室會對實驗產(chǎn)生影響嗎？
基底膜水化后奔穿，需要檢查是否有液體穿過小室進(jìn)入到下室中镜沽，需要保證無液體穿過才可以繼續(xù)接種細(xì)胞。
E贱田、接種細(xì)胞是不是越多越好缅茉？
不同的細(xì)胞，其侵襲能力是不同的男摧。接種細(xì)胞量過多時蔬墩，穿過膜的細(xì)胞會過多，最后導(dǎo)致計數(shù)困難耗拓；而接種細(xì)胞過少時拇颅，可能還沒到檢測的時間點，所有的細(xì)胞都已穿過微孔膜進(jìn)入下室乔询。因此最少也要保證在收樣的時候樟插，小室內(nèi)還要有一定量的細(xì)胞存在。
引用文獻(xiàn)
[1] Zhu, Jianfei et al. “Delineating the dynamic evolution from preneoplasia to invasive lung adenocarcinoma by integrating single-cell RNA sequencing and spatial transcriptomics.”Experimental & molecular medicine?vol. 54,11 (2022): 2060-2076. doi:10.1038/s12276-022-00896-9
[2] Valastyan, Scott, and Robert A Weinberg. “Tumor metastasis: molecular insights and evolving paradigms.”Cell?vol. 147,2 (2011): 275-92. doi:10.1016/j.cell.2011.09.02
[3] van de Merbel, Arjanneke F et al. “Protocols for Migration and Invasion Studies in Prostate Cancer.”Methods in molecular biology (Clifton, N.J.)?vol. 1786 (2018): 67-79. doi:10.1007/978-1-4939-7845-8_4
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