??肝細(xì)胞癌(HCC)?
肝癌是指肝臟有惡性腫瘤，最常見是肝細(xì)胞癌莫瞬。
肝臟是耐操且不會(huì)表達(dá)疼痛的器官儡蔓，當(dāng)肝臟長出腫瘤時(shí)，
因?yàn)楦闻K神經(jīng)多在肝表面疼邀，病人難以感受喂江。
發(fā)現(xiàn)時(shí)候往往已是晚期，癌癥發(fā)展已經(jīng)進(jìn)入第3或第4期旁振，也增加治療的難度获询。
?早 期 癥 狀?
早期癥狀
感冒癥狀—疲倦? 食欲差??發(fā)燒? 頭暈燈
黃疸—上眼瞼翻開? 眼白發(fā)黃
其他—惡心嘔吐??腹脹? 腹痛??拉肚子? 體重減輕
?HOX基因?
HOX(homeobox)基因?qū)偻串愋秃屑易澹c多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后關(guān)系十分密切拐袜。研究發(fā)現(xiàn)該家族成員中的HOXB7可通過調(diào)控細(xì)胞增殖吉嚣、血管生成等促進(jìn)胃癌、肺癌蹬铺、胰腺癌及乳腺癌的發(fā)生發(fā)展尝哆，且HOXB7可通過誘導(dǎo)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。
TGF-β(transforming growth factor-β)作為一種生長因子甜攀，過度活化與多種疾病密切相關(guān)秋泄，如肝纖維化、炎性反應(yīng)和腫瘤等赴邻。HOXB7與TGF-β可能通過活化TGF-β/SMAD3信號(hào)通路促進(jìn)細(xì)胞侵襲進(jìn)而導(dǎo)致乳腺癌進(jìn)展印衔。
HOXB7在肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織，其表達(dá)水平與肝細(xì)胞癌預(yù)后顯著相關(guān)姥敛，但HOXB7在HCC進(jìn)程中的作用及機(jī)制尚未闡明奸焙。因此，本文采用HOXB7 shRNA轉(zhuǎn)染肝癌SMMC-7721細(xì)胞，探討HOXB7基因在肝癌細(xì)胞增殖与帆、侵襲了赌、遷移過程中的作用及部分機(jī)制，從而為尋找肝細(xì)胞癌的治療靶點(diǎn)提供新思路玄糟。
?細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染?
將HepG2勿她、SMMC-7721細(xì)胞培養(yǎng)于RPMI1640:FBS:PS=89:10:1的培養(yǎng)基中。分別對(duì)小干擾RNA組(實(shí)驗(yàn)組)阵翎、陰性對(duì)照小干擾RNA組(陰性對(duì)照組)逢并、空白對(duì)照組細(xì)胞使用1.2 μg DNA。按照轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000說明手冊(cè)對(duì)HOXB7的mRNA進(jìn)行轉(zhuǎn)染郭卫。
?熒光定量PCR?
按照說明書對(duì)肝癌SMMC-7721和HepG2細(xì)胞使用TransZol Up裂解液提取總RNA砍聊。通過Anchored Oligo(dT)18試劑盒得到反轉(zhuǎn)錄cDNA。利用2× TransStart? Tip Green qPCR SuperMix體系配置反應(yīng)體系并放入熒光定量PCR儀贰军，按照說明書進(jìn)行PCR擴(kuò)增玻蝌。采用半定量分析計(jì)算HOXB7基因相關(guān)的mRNA表達(dá)水平。相關(guān)引物序列見表 1词疼。
?Western blot檢測?
用裂解混合液提取肝癌細(xì)胞或shRNA轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞俯树，使用BCA法測蛋白質(zhì)濃度，于SDS-PAGE上取等量蛋白樣品進(jìn)行電泳贰盗，并用不同抗體分別行免疫印跡分析许饿，ECL顯色液避光顯色，凝膠成像系統(tǒng)照相舵盈。使用Image J軟件進(jìn)行條帶灰度分析米辐，其相對(duì)表達(dá)水平用目的蛋白條帶灰度與內(nèi)參蛋白條帶灰度的比率表示。
?劃 痕 實(shí) 驗(yàn)?
按照Lipofectamine 2000的試劑說明書轉(zhuǎn)染細(xì)胞书释。24 h后翘贮，用200 μl尖端輕輕劃線，1×PBS沖洗兩遍爆惧，相差顯微鏡下分別取0狸页、16、24 h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)拍照扯再，并計(jì)數(shù)劃痕處細(xì)胞數(shù)目芍耘。
?Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)?
Transwell上層小室中加入Matrigel膠母液60 μl，培養(yǎng)箱孵育30 min后加入50 μl無血清RPMI1640培養(yǎng)液熄阻，37℃孵育30 min斋竞，消化轉(zhuǎn)染HOXB7 shRNA(實(shí)驗(yàn)組)、陰性對(duì)照shRNA(陰性對(duì)照組)及空白組細(xì)胞(空白對(duì)照組)秃殉，各取200 μl接種于Transwell上層小室坝初，加500 μl含10%胎牛血清或含抑制劑的無血清RPMI1640培養(yǎng)液浸剩，培養(yǎng)24 h，吸取上層小室內(nèi)基質(zhì)膠鳄袍、液體绢要，PBS擦去膜上層細(xì)胞，4%多聚甲醛固定10 min拗小。結(jié)晶紫染色后重罪，在200×視野下觀察透膜細(xì)胞數(shù)。
?統(tǒng)計(jì)學(xué)方法?
利用SPSS23.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析哀九，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示剿配。t檢驗(yàn)用于兩獨(dú)立樣本均值比較，單因素方差分析用于多樣本間均數(shù)比較阅束。P?< 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義惨篱。
?在不同肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平?
熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，肝癌SMMC-7721和HepG2細(xì)胞株中HOXB7 mRNA的表達(dá)量分別為(3.198±0.9291)和(1.053±0.376)围俘，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.021)，
*:P< 0.05, compared with HepG2 cell lines
Real-time PCR檢測肝癌細(xì)胞系中HOXB7 mRNA的表達(dá)量
?shRNA敲除HOXB7基因表達(dá)的效果?
空白對(duì)照組HOXB7 mRNA表達(dá)水平(1.038±0.395)與陰性對(duì)照組(0.943±0.006)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.766)琢融，實(shí)驗(yàn)組HOXB7 mRNA水平(0.450±0.670)較陰性對(duì)照組明顯降低(P=0.009)界牡，見圖 2A；同時(shí)實(shí)驗(yàn)組肝癌SMMC-7721細(xì)胞經(jīng)HOXB7 shRNA轉(zhuǎn)染后HOXB7蛋白表達(dá)量較陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組均降低(P=0.01)漾抬，而陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組HOXB7蛋白表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.878)宿亡，
*: P < 0.05, compared with control or blank group?
?shRNA轉(zhuǎn)染SMMC-7721肝癌細(xì)胞的沉默效果
?基因敲除后對(duì)肝癌細(xì)胞增殖能力的影響?
CCK8細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HOXB7 shRNA實(shí)驗(yàn)組肝癌細(xì)胞的吸光度值(0.644±0.007)顯著低于空白對(duì)照組(1.068±0.006)與陰性對(duì)照組(1.096±0.052)纳令，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001)挽荠，而空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.889)。
*:P< 0.05, compared with control or blank group
?CCK8法檢測shRNA轉(zhuǎn)染后SMMC-7721細(xì)胞的增殖能力
?基因敲除后對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲能力的影響?
Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組跨膜細(xì)胞數(shù)少于陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組平绩，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P?< 0.001)圈匆，陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.782)，
Transwell檢測shRNA轉(zhuǎn)染后SMMC-7721細(xì)胞的侵襲能力??(×200)?
?基因敲除后對(duì)肝癌細(xì)胞遷移能力的影響?
細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示捏雌，與陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組相比跃赚，24 h后實(shí)驗(yàn)組肝癌細(xì)胞的遷移能力降低(P?< 0.05)，說明HOXB7低表達(dá)能抑制人肝癌SMMC-7721細(xì)胞的遷移能力性湿，
劃痕實(shí)驗(yàn)檢測shRNA轉(zhuǎn)染后SSMC-7721細(xì)胞遷移能力
?基因敲除對(duì)肝癌細(xì)胞TGF-β信號(hào)通路的影響?
HOXB7基因敲除后纬傲，實(shí)驗(yàn)組p-Smad3蛋白表達(dá)水平(0.624±0.232)較空白對(duì)照組(1.241±0.112)及陰性對(duì)照組(1.294±0.690)水平明顯降低(P?< 0.001)，空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組p-Smad3蛋白表達(dá)量差異無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.548)肤频，而實(shí)驗(yàn)組Smad3蛋白表達(dá)水平與空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P?> 0.05)叹括，
Western blot法檢測HOXB7基因敲除對(duì)TGF-β信號(hào)通路的影響
?討 論?
同源盒基因B7(HOXB7)為HOX基因家族中的一種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，在DNA合成與轉(zhuǎn)錄方面有重要作用宵荒，其高表達(dá)可導(dǎo)致某些腫瘤的發(fā)生汁雷。研究表明HOXB7在多種腫瘤細(xì)胞內(nèi)異常表達(dá)净嘀，且與腫瘤的預(yù)后密切相關(guān)。前期課題組研究發(fā)現(xiàn)在肝癌組織中HOXB7基因表達(dá)顯著高于癌旁組織摔竿，這與Komatsu等的研究一致面粮，證實(shí)HOXB7作為癌基因參與了HCC的進(jìn)程。為明確HOXB7對(duì)肝癌細(xì)胞增殖继低、侵襲和遷移的影響熬苍，本研究通過靶向HOXB7基因的shRNA轉(zhuǎn)染HOXB7表達(dá)量較高的肝癌SMMC-7721細(xì)胞株，Real-time PCR及Western blot的結(jié)果表明袁翁，實(shí)驗(yàn)組中HOXB mRNA及蛋白表達(dá)水平受到明顯抑制柴底，CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖能力較空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組明顯下降，Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)組跨膜細(xì)胞數(shù)較空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組明顯減少粱胜，劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示實(shí)驗(yàn)組肝癌SMMC-7721細(xì)胞的遷移能力較空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組下降柄驻。本實(shí)驗(yàn)說明肝癌SMMC-7721細(xì)胞的增殖與遷移能力隨著HOXB7表達(dá)下調(diào)而受到抑制，與課題組以往的研究結(jié)果一致焙压，提示HOXB7可促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖活性鸿脓、侵襲和遷移能力。
HOXB7在HCC進(jìn)程中的作用機(jī)制目前尚無統(tǒng)一定論涯曲，據(jù)報(bào)道HOXB7可通過不同途徑發(fā)揮作用野哭，包括上調(diào)c-Myc和Slug表達(dá)并激活A(yù)KT通路、活化FGF介導(dǎo)的MAPK/ERK通路等幻件。此外拨黔，HOXB7還可以通過刺激FGF等生長因子的分泌從而介導(dǎo)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)發(fā)揮促癌作用，而TGF-β是參與EMT過程調(diào)節(jié)的主要因子之一绰沥。TGF-β還可通過多種途徑促進(jìn)腫瘤的侵襲篱蝇、浸潤，如TGF-β可分別激活Smad和Non-Smad信號(hào)通路促進(jìn)肝癌細(xì)胞EMT徽曲，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移零截。其中信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白Smad3為TGF-β通路中重要的下游蛋白，該蛋白的異常表達(dá)可引起腫瘤的發(fā)生秃臣、進(jìn)展與轉(zhuǎn)移瞻润。其下游信號(hào)也可能是通過調(diào)控其他通路調(diào)節(jié)EMT、細(xì)胞遷移等過程促進(jìn)肝癌的進(jìn)展甜刻，如MEK/Erk绍撞、PI3K/Akt、MAPK等通路得院。因此傻铣，為了進(jìn)一步明確HOXB7促進(jìn)HCC進(jìn)程的作用機(jī)制，本研究利用Western blot實(shí)驗(yàn)檢測HOXB7基因敲除后TGF-β通路中下游蛋白的活化水平祥绞，結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組Smad3蛋白表達(dá)水平較空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組無明顯差異非洲，而實(shí)驗(yàn)組p-Smad3的表達(dá)較空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組顯著下調(diào)鸭限。HOXB7敲除后Smad3的磷酸化水平下調(diào)，這提示HOXB7可能通過調(diào)節(jié)TGF-β通路中Smad3磷酸化促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖两踏、侵襲與遷移败京。然而HCC的侵襲、遷移是個(gè)復(fù)雜的過程梦染，尤其是HOXB7在促進(jìn)肝癌進(jìn)展的具體分子機(jī)制尚未完全明確赡麦，后續(xù)還需開展關(guān)于TGF-β通路的一系列分子機(jī)制研究，進(jìn)一步探討HOXB7在HCC進(jìn)程中的分子機(jī)制帕识。
本文轉(zhuǎn)自《腫瘤防治研究》雜志泛粹，僅用于學(xué)習(xí)探討，如侵權(quán)請(qǐng)聯(lián)系作者刪除
