作者耙蔑，Evil Genius
歡迎來(lái)到大齡剩男相親記颤陶，昨天下午7點(diǎn)多見(jiàn)了一個(gè)女醫(yī)生票编，我覺(jué)得我自己就比較現(xiàn)實(shí)了妄迁，她更現(xiàn)實(shí)，著急的兑障，實(shí)際上她94年的侄非，我覺(jué)得不用急，結(jié)果她把醫(yī)學(xué)報(bào)告拿出來(lái)了流译，讓我看逞怨，告訴我女性超過(guò)30歲生孩子風(fēng)險(xiǎn)急劇升高，超過(guò)33歲生下的孩子是弱智的概率大大提升福澡，然后說(shuō)男女都一樣叠赦，超過(guò)30歲細(xì)胞有絲分裂開(kāi)始不穩(wěn)定，女性一生大概400個(gè)卵子竞漾，但是只有前面的200個(gè)左右是高質(zhì)量的眯搭，男性精子的數(shù)量和質(zhì)量從28歲左右開(kāi)始下降窥翩，再加上現(xiàn)在生活壓力比較大业岁，男性在抽煙喝酒熬夜等，這個(gè)生理只會(huì)提前寇蚊。
說(shuō)實(shí)話笔时，我第一次見(jiàn)女方這么說(shuō)。
還記得在上海的時(shí)候仗岸，女人都認(rèn)為35歲之前都算小呢允耿，40歲生孩子也不晚。
對(duì)于單細(xì)胞空間如何走向臨床扒怖，其實(shí)是一個(gè)很深的課題较锡，畢竟轉(zhuǎn)錄組層面不是根本，只是表象盗痒，但是空間排布確實(shí)反映了很多臨床信息蚂蕴，在臨檢公司看病理切片是一個(gè)非常專業(yè)且很大的部門低散。
衡量靶藥是否有效，目前最常見(jiàn)的辦法還是做NGS骡楼，但是空間病理信息也不可或缺熔号，那么從研究的角度看，需要制定策略以更好地確定哪些患者將從治療中受益鸟整，哪些患者可能需要化療或放療等額外治療來(lái)克服耐藥性引镊，尤其是免疫療法。那么借助單細(xì)胞+空間的力量篮条，也許可以深入并克服這一點(diǎn)弟头。
免疫療法僅在某些癌癥組織中取得成功，即使在這些類型中涉茧，也不是所有患者都能獲得臨床益處亮瓷。在乳腺癌中，缺乏雌激素受體降瞳、孕激素受體和人表皮生長(zhǎng)因子2蛋白表達(dá)的三陰性乳腺癌亞型(TNBC)是最具免疫應(yīng)答性的亞型嘱支，也是唯一將免疫檢查點(diǎn)抑制(ICI)作為標(biāo)準(zhǔn)治療的亞型。然而挣饥，即使在TNBC中除师，在轉(zhuǎn)移情況下，單一治療ICI的客觀反應(yīng)率僅為~20%扔枫，因此后續(xù)研究?jī)H追求ICI聯(lián)合化療和放療(RT)汛聚。這表明需要更好地了解腫瘤免疫微環(huán)境(TME)如何決定反應(yīng)。
乳腺腫瘤浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞表現(xiàn)出巨大的異質(zhì)性短荐，包括T細(xì)胞倚舀、B細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞忍宋，腫瘤浸潤(rùn)性淋巴細(xì)胞(TIL)豐度與化療和ICI反應(yīng)相關(guān)痕貌。在乳腺癌和其他癌癥中，研究使用了CyTOF糠排、bulk RNA測(cè)序(RNA-seq)和單細(xì)胞RNA測(cè)序(scRNA-seq)來(lái)表征ICI之前的TME舵稠，并將各種免疫譜與反應(yīng)聯(lián)系起來(lái)。
治療前TME中的細(xì)胞相互作用也可能控制ICI反應(yīng)入宦。
scRNA + CODEX技術(shù)哺徊。
結(jié)果1、空間分析確定TNBC中復(fù)發(fā)的細(xì)胞空間結(jié)構(gòu)
設(shè)計(jì)并實(shí)施了一項(xiàng)新輔助臨床試驗(yàn)（NCT03366844）來(lái)研究pembro和局灶性放療聯(lián)合治療TNBC患者 乾闰。50例新診斷的患者術(shù)前接受pembrots落追，三周后對(duì)原發(fā)乳腺腫瘤進(jìn)行pembrots + RT(3組24 Gy, pembrots + RT)，然后繼續(xù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)治療化療涯肩，手術(shù)和RT轿钠，在手術(shù)時(shí)確定病理完全緩解(pCR)雹熬。淋巴結(jié)陽(yáng)性患者經(jīng)細(xì)針穿刺或芯針活檢病理證實(shí)。
單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組部分：用磁分離CD45+和CD45-的活檢樣本活細(xì)胞的頂部和底部1/3部分進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序谣膳，CD45+樣本同時(shí)進(jìn)行配對(duì)T細(xì)胞受體（TCR）/B細(xì)胞受體（BCR）-seq竿报。
空間蛋白組部分：剩余的1/3部分，福爾馬林固定继谚，石蠟包埋烈菌，并使用CODEX平臺(tái)，根據(jù)scRNA-seq鑒定的細(xì)胞類型花履，用抗體panels進(jìn)行分析芽世。
空間細(xì)胞類型的鑒定：經(jīng)典marker。
空間域分析：細(xì)胞類型被分組成空間受限的domain或“區(qū)”诡壁，在活檢中反復(fù)出現(xiàn)济瓢。為了使這一觀察標(biāo)準(zhǔn)化，作者開(kāi)發(fā)并應(yīng)用了一種無(wú)偏機(jī)器學(xué)習(xí)方法來(lái)識(shí)別12個(gè)domain的空間細(xì)胞結(jié)構(gòu)檢測(cè)妹卿。d0旺矾、d1、d5和d11區(qū)上皮細(xì)胞占89%夺克。有2個(gè)基質(zhì)區(qū)(d2和d10)和1個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞區(qū)(d7)箕宙。d9區(qū)以髓系細(xì)胞為主(78%)，部分CD4+ T細(xì)胞(CD4T, 11%)铺纽。d6區(qū)為CD20+ B細(xì)胞(10%)柬帕、CD4T細(xì)胞(13%)、CD8+ T細(xì)胞(CD8T, 18%)狡门、骨髓細(xì)胞(19%)和基質(zhì)細(xì)胞(37%)的混合物陷寝。大多數(shù)CD138+漿細(xì)胞(95%)位于d8區(qū)，與上皮細(xì)胞其馏、髓細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞(>10%)共存凤跑。d3區(qū)和d4區(qū)以淋巴細(xì)胞為主，d3區(qū)含CD4T最多(39%)和CD8T最多(41%)尝偎，d4區(qū)含B細(xì)胞最多(54%)饶火。
結(jié)果2 鹏控、治療誘導(dǎo)應(yīng)答性TNBC免疫微環(huán)境的重塑
從不同治療時(shí)間節(jié)點(diǎn)中的空間樣本分析相對(duì)細(xì)胞比例(占總細(xì)胞的百分比)和細(xì)胞密度(每單位面積的細(xì)胞數(shù))致扯。
- At baseline, total immune cell proportions did not distinguish response groups, though immune cell density was higher in responders
- B cell dominant district d4 was the only district higher in proportion and density in responders at baseline, but T cell rich d6 was also denser at this time。
- AUROC分析也發(fā)現(xiàn)了類似的趨勢(shì)当辐。在治療前抖僵，d4是唯一與應(yīng)答相關(guān)的區(qū)(AUROC > 0.75)，但在RTPD1治療后缘揪，所有免疫富集區(qū)(d3, d4, d6, d8和d9)按比例和密度在應(yīng)答者中富集耍群。
結(jié)果3义桂、單細(xì)胞數(shù)據(jù)分析
342,749個(gè)CD45+細(xì)胞的配對(duì)scRNA-seq數(shù)據(jù)。Leiden聚類鑒定出B細(xì)胞/漿細(xì)胞蹈垢、T細(xì)胞慷吊、骨髓細(xì)胞和肥大細(xì)胞。還將B細(xì)胞/漿細(xì)胞曹抬、T細(xì)胞和骨髓細(xì)胞分亞群溉瓶，并使用差異基因表達(dá)分析(DGEA)和CellTypist軟件來(lái)描述細(xì)胞表型。
T/NK-cells：8個(gè)subclusters谤民，
sc-t1和 sc-t7：NK-like cells堰酿，marker為NKG7，KLRB1
sc-t2：naive CD4+ /CD8+ T cells
sc-t3：Tregs
sc-t5：follicular-helper T cells
sc-t4 and sc-t6：effector/exhausted CD8+ T cells
B cells/plasma cells亞類：CD20+ B cell (sc-b0, sc-b2)张足，7 SDC1+ (CD138) plasma cell clusters
Myeloid cells亞類：12個(gè)亞類
sc-m7：migratory DC
sc-m8 and sc-m9：‘‘DC1’’ and ‘‘DC2’’
相關(guān)性分析空間域富集的細(xì)胞類型（spearman）
結(jié)果4触创、效應(yīng)T細(xì)胞擴(kuò)增與抗原呈遞巨噬細(xì)胞相關(guān)
觀察新抗原反應(yīng)效應(yīng)CD8+ T細(xì)胞特征(“neoTCR8”)，發(fā)現(xiàn)sc-t4和sc-t6表現(xiàn)出最高的表達(dá)水平为牍，并且這種特征在應(yīng)答者的早期活檢中最高哼绑。僅在應(yīng)答者中，這些subcluster在pembroo后擴(kuò)張?jiān)黾拥锱兀渲衧c-t6在RTPD1后持續(xù)擴(kuò)張凌那。此外，在兩種治療活檢中吟逝，有反應(yīng)者的sc-16擴(kuò)增高于無(wú)反應(yīng)者帽蝶。
通過(guò)研究空間域的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)块攒，d3和d4在其空間模式上是相關(guān)的励稳，d6也與這兩個(gè)區(qū)域以及基質(zhì)富集的d2和d10相關(guān)。d8區(qū)與其他區(qū)無(wú)空間聯(lián)系囱井，而d9區(qū)與d3區(qū)和d6區(qū)均有空間聯(lián)系驹尼。這些區(qū)域間的空間相關(guān)性在反應(yīng)者和非反應(yīng)者之間沒(méi)有差異。
結(jié)果5庞呕、鑒定兩組具有不同免疫軌跡的responder groups
反應(yīng)性腫瘤在與反應(yīng)相關(guān)的空間因素上表現(xiàn)出異質(zhì)性新翎。為了研究這一點(diǎn)，根據(jù)腫瘤在所有活檢中的最大CODEX區(qū)域代表性對(duì)腫瘤進(jìn)行了無(wú)偏聚類住练。腫瘤聚集成3組地啰，大多數(shù)無(wú)應(yīng)答的腫瘤形成一個(gè)亞組，應(yīng)答的腫瘤形成兩個(gè)亞組讲逛。將響應(yīng)組subgroup1稱為R1亏吝，所有其他響應(yīng)組稱為R2，而所有無(wú)響應(yīng)組稱為NR盏混。
R2與免疫檢查點(diǎn)抑制的典型反應(yīng)組的表達(dá)相似度低蔚鸥，R1惡性細(xì)胞在base時(shí)顯示出免疫治療響應(yīng)的特征
為了研究區(qū)域共定位對(duì)擴(kuò)展的影響惜论，測(cè)量了所有CODEX圖像中每個(gè)區(qū)域的細(xì)胞密度，然后對(duì)位于相應(yīng)二元分布上的區(qū)域?qū)ο袼剡M(jìn)行分類止喷。然后馆类，將每個(gè)活檢中上象限的像素百分比與sc-t6擴(kuò)張相關(guān)聯(lián)，發(fā)現(xiàn)R2中d6/d9共密度與sc-t6擴(kuò)張之間存在唯一的顯著相關(guān)性弹谁。此外蹦掐，對(duì)d6/d9共密度和sc-t6膨脹之間形成的雙變量分布進(jìn)行上象限富集分析發(fā)現(xiàn)，R1和R2總體上富集相似僵闯，但最大富集與R2 RTPD1活檢相對(duì)應(yīng)卧抗。
結(jié)果6、RT和抗PD-1對(duì)TNBC小鼠模型免疫微環(huán)境的影響
分析發(fā)現(xiàn)R1惡性細(xì)胞在base和pembro之后表達(dá)與免疫治療反應(yīng)相關(guān)的癌癥基因特征鳖粟，并且這些基因在RTPD1后的R2中被擴(kuò)增社裆。此外，通過(guò)對(duì)區(qū)分每種腫瘤類型的基因進(jìn)行富集分析發(fā)現(xiàn)向图，R1癌細(xì)胞在base和pembro之后具有更高的MHC I泳秀、MHC II和TAP相關(guān)基因表達(dá)，并且在一次或兩次活檢中榄攀，這些基因在R1正常上皮細(xì)胞嗜傅、成纖維細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)。
結(jié)論
基于單細(xì)胞數(shù)據(jù)和CODEX分析檩赢，研究免疫細(xì)胞與非免疫細(xì)胞在空間上的浸潤(rùn)以及共定位情況吕嘀。三陰性乳腺癌中顯示無(wú)應(yīng)答者（Non-responders）在治療前后均缺乏免疫浸潤(rùn)，僅表現(xiàn)出治療引起的微弱免疫變化贞瞒；響應(yīng)者Responding tumors表現(xiàn)出兩種響應(yīng)模式偶房。在治療前可通過(guò)分類器進(jìn)行區(qū)分，其中一組在治療前表現(xiàn)出高的MHC表達(dá)军浆、存在三級(jí)淋巴結(jié)構(gòu)棕洋，并表現(xiàn)出抗腫瘤免疫效能。另一組應(yīng)答者在基線時(shí)與無(wú)應(yīng)答者相似乒融，只有在聯(lián)合治療后才會(huì)產(chǎn)生最大的免疫應(yīng)答掰盘，其特征是細(xì)胞毒性 T 細(xì)胞和抗原呈遞髓細(xì)胞相互作用。并且這些空間互作關(guān)系也在小鼠模型上得到了驗(yàn)證赞季。
