Liu, J.; Wang, H.; Fan, X.; Zhang, Y.; Sun, L.; Liu, C.; Fang, Z.; Zhou, J.; Peng, H.; Jiang, J. Establishment and application of a Multiple nucleotide polymorphism molecular identification system for grape cultivars. Sci. Hortic. (Amsterdam). 2024, 325, 112642, doi:10.1016/j.scienta.2023.112642.
摘要
葡萄（Vitis L）是中國(guó)最重要和最受歡迎的水果之一崖堤。然而，葡萄的有效鑒定對(duì)國(guó)產(chǎn)葡萄的保護(hù)和育種者的權(quán)利非常重要。在此窿冯，我們開發(fā)了一種稱為多核苷酸多態(tài)性（MNP）的新方法示血，它結(jié)合了多重 PCR 擴(kuò)增和高通量測(cè)序的優(yōu)點(diǎn)间学，提高了葡萄品種鑒定的效率囱皿。我們根據(jù) 31 個(gè)代表性栽培品種的全基因組測(cè)序數(shù)據(jù)荆姆，確定了 582 個(gè)通用 MNP 標(biāo)記并對(duì)其進(jìn)行了篩選蔼囊。隨后焚志，利用多重 PCR 擴(kuò)增和測(cè)序技術(shù)構(gòu)建了 60 個(gè)常見栽培品種的 MNP 文庫(kù)衣迷。對(duì) 60 種葡萄材料進(jìn)行配對(duì)比較后發(fā)現(xiàn)，MNP 標(biāo)記的識(shí)別率很高（大于 99%）酱酬。此外壶谒，MNP 還能準(zhǔn)確區(qū)分二倍體和多倍體，有助于葡萄的分子鑒定膳沽『共耍總之，MNP 分子鑒定技術(shù)為葡萄品種鑒定提供了一條新途徑挑社。與 SNP 相比陨界，MNP 無(wú)需制作昂貴的基因芯片，從而降低了鑒定成本痛阻。此外普碎，MNP 可以在一個(gè)試管中完成數(shù)千個(gè)引物的擴(kuò)增，并用測(cè)序代替聚丙烯酰胺凝膠電泳录平，與 SSR 相比大大節(jié)省了實(shí)驗(yàn)耗材和人力麻车。綜合來(lái)看，所開發(fā)的技術(shù)具有成本低斗这、效率高的優(yōu)點(diǎn)动猬，與目前其他鑒定方法相比更具競(jìng)爭(zhēng)力。該技術(shù)有助于資源研究表箭，促進(jìn)植物育種赁咙。
1. 1. 引言
葡萄（Vitis vinifera L，葡萄科）是一種多年生藤本植物免钻，原產(chǎn)于西亞和高加索地區(qū)的馴化中心（Dong 等彼水，2023 年）。葡萄于公元前 2 世紀(jì)晚期傳入中國(guó)极舔，至今已有兩千多年的栽培歷史凤覆。由于自然雜交、常規(guī)雜交拆魏、種苗選擇盯桦、芽變選擇等原因，葡萄的遺傳多樣性不斷豐富渤刃，在長(zhǎng)期的繁殖和栽培過(guò)程中積累了多種變異資源（Wang 等拥峦，2023 年）。隨著葡萄品種的多樣化卖子、栽培面積的擴(kuò)大以及葡萄入選品種間的頻繁交流（Emanuelli et al略号，2013），葡萄品種的鑒定、分類和命名已成為葡萄產(chǎn)業(yè)中的一個(gè)重要問(wèn)題玄柠。這也給葡萄種質(zhì)資源的收集氛琢、保存和創(chuàng)新帶來(lái)了不便。此外随闪，市場(chǎng)混亂等情況也會(huì)對(duì)育種者的權(quán)益造成負(fù)面影響阳似。在研究的早期階段，人們通過(guò)形態(tài)特征來(lái)評(píng)估葡萄種質(zhì)資源的遺傳多樣性铐伴。然而撮奏，這種方法耗時(shí)長(zhǎng)、難度大当宴，而且其效率受到環(huán)境條件和人為因素的影響畜吊。然而，隨著高通量測(cè)序和分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展以及全基因組序列數(shù)據(jù)的可用性（Jaillon 等人户矢，2007 年玲献；Velasco 等人，2007 年）梯浪，人們發(fā)現(xiàn)了多種基于 DNA 的分子標(biāo)記技術(shù)用于葡萄品種鑒定捌年。DNA 分子標(biāo)記技術(shù)，尤其是簡(jiǎn)單序列重復(fù)（SSR）和單核苷酸多態(tài)性（SNP）標(biāo)記挂洛，具有周期短礼预、對(duì)環(huán)境影響小等優(yōu)點(diǎn)，為葡萄品種鑒定提供了一種有效的方法虏劲。例如托酸，由于 SSR 標(biāo)記具有共顯性和高多態(tài)性的優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于葡萄種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析柒巫。1996 年励堡，研究人員利用 4 個(gè) SSR 標(biāo)記區(qū)分了 77 個(gè)葡萄品種（Bowers 等人，1996 年）堡掏。目前应结，已開發(fā)出一套 30 個(gè) SSR 標(biāo)記系統(tǒng)，用于識(shí)別葡萄品種布疼，構(gòu)建 DNA 指紋數(shù)據(jù)庫(kù)摊趾，分析 314 個(gè)葡萄品種的遺傳多樣性（Wang 等币狠，2020 年）游两。然而，由于 SSR 標(biāo)記數(shù)量有限漩绵、檢測(cè)通量小贱案、數(shù)據(jù)讀取困難等原因，在更大范圍內(nèi)對(duì)葡萄品種的鑒定受到限制。Dong等（2010）發(fā)現(xiàn)了9對(duì)SNP引物宝踪，成功區(qū)分了16個(gè)葡萄品種侨糟，表明SNP標(biāo)記在葡萄品種鑒定和遺傳多樣性分析中的高效性。最近瘩燥，Wang 等（2022 年）鑒定了 22 個(gè)高質(zhì)量的等位基因特異性 PCR（KASP）標(biāo)記秕重，識(shí)別了 60 個(gè)葡萄 SNP 位點(diǎn)，構(gòu)建了中國(guó) 76 個(gè)主要栽培葡萄品種的 SNP 指紋厉膀。然而溶耘，SNP 標(biāo)記使用的基因芯片復(fù)雜且成本高昂。
然而服鹅，葡萄基因組測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)為葡萄分子育種研究帶來(lái)了革命性的變化凳兵，包括探索葡萄種群的遺傳變異、鑒定重要性狀位點(diǎn)企软、研究遺傳關(guān)系和進(jìn)化（Myles et al, 2011）庐扫。植物品種鑒定--MNP 標(biāo)記法（GB/T 38,551-2020）是 2020 年 10 月 1 日實(shí)施的中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，隸屬于中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)化研究院仗哨。多核苷酸多態(tài)性（MNP）是由基因組 300 bp 范圍內(nèi)的多個(gè)核苷酸組成的標(biāo)記形庭。MNP 利用多重 PCR 和新一代測(cè)序技術(shù)擴(kuò)增和檢測(cè)樣品基因組上的 MNP 標(biāo)記位點(diǎn)，分析檢測(cè)數(shù)據(jù)厌漂，確定標(biāo)記位點(diǎn)碘勉。與 KASP 技術(shù)相比，MNP 的開發(fā)過(guò)程大大簡(jiǎn)化桩卵，不需要兩輪標(biāo)記檢測(cè)验靡。同時(shí)，聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）和樣品多重分析的通量也大大提高雏节。使用 MNP 技術(shù)的單管 PCR 反應(yīng)系統(tǒng)可實(shí)現(xiàn)數(shù)千次高度均勻的 PCR 反應(yīng)胜嗓。MNP 分析可從 5 到 2000 個(gè)擴(kuò)增子中鑒定出 5 到 10,000 個(gè)標(biāo)記，大大降低了單個(gè)標(biāo)記的分析成本（Xu 等钩乍，2020 年）辞州。這種高度復(fù)用的 PCR 提高了標(biāo)記檢測(cè)的效率，降低了檢測(cè)成本寥粹。目前变过，MNP 技術(shù)已被開發(fā)并應(yīng)用于多種作物，如玉米（Guo 等涝涤，2019 年）媚狰、西蘭花（Shen 等，2021 年）和黃瓜（Zhang 等阔拳，2020 年）崭孤。此外，利用 179 個(gè) MNP 作為通用標(biāo)記，構(gòu)建了一個(gè) MNP 鑒定系統(tǒng)辨宠，用于鑒定金針菇品種遗锣，并建立了 232 個(gè)栽培和野生菌株的鄰接系統(tǒng)發(fā)育樹（Liu 等，2023 年）嗤形。此外精偿，MNP 技術(shù)不僅可用于品種鑒定，還可廣泛應(yīng)用于多年生作物育種項(xiàng)目赋兵，以加速品種開發(fā)（Yang 等还最，2016 年）。
盡管 MNP 的適用性取得了進(jìn)展毡惜，但尚未有關(guān)于葡萄的研究報(bào)道拓轻。本研究基于31個(gè)代表性品種的全基因組重測(cè)序數(shù)據(jù)，開發(fā)了一套葡萄通用MNP標(biāo)記经伙，構(gòu)建了主要葡萄品種的MNP指紋圖譜扶叉，為鑒定葡萄品種提供技術(shù)支持。
2. 材料與方法
2.1. 植物材料
試驗(yàn)材料于 2022 年 6 月采集于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所國(guó)家果樹良種鄭州葡萄園帕膜。為進(jìn)行 MNP 標(biāo)記初篩枣氧，采用了 31 個(gè)不同品種、不同倍性垮刹、不同用途的代表性葡萄栽培品種（補(bǔ)充表 1达吞；代碼 1-31）。
2.2.DNA提取和全基因組測(cè)序
使用CTAB法從新鮮葡萄葉中提取基因組DNA（Doyle荒典，1987）酪劫。使用納米液滴對(duì)提取的DNA進(jìn)行定量，并使用1.0%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證其完整性寺董。使用NexteraXT試劑（Illumina）制備全基因組測(cè)序文庫(kù)覆糟。然后使用Novogene的Illumina Novoseq平臺(tái)按照制造商的說(shuō)明對(duì)DNA樣品進(jìn)行測(cè)序。
2.3.測(cè)序數(shù)據(jù)的處理
Soapnuke軟件用于去除具有測(cè)序接頭遮咖、低質(zhì)量和N堿基比率>1%的讀數(shù)滩字；獲得了高質(zhì)量的干凈數(shù)據(jù)，用于后續(xù)的比對(duì)分析（Chen等人御吞，2018）麦箍。短序列比對(duì)軟件BWA（0.7.15）的“mem”算法和比對(duì)參數(shù)“-t5-k 30-M-R”用于將過(guò)濾的干凈數(shù)據(jù)與葡萄參考基因組進(jìn)行比對(duì)（GCA_000003745.2_12X；Li和Durbin陶珠，2010）挟裂。生成比較結(jié)果文件（BAM文件），然后使用Picard（1.54）軟件的SortSam.jar工具將BAM文件轉(zhuǎn)換為sortbam文件（Danecek等人背率，2021）话瞧。通過(guò)SAMtools軟件將比較結(jié)果轉(zhuǎn)換為SAM格式嫩与。Picard（1.54）軟件的MergeSamFiles.jar工具用于合并同一樣本的不同庫(kù)/通道的比較文件寝姿。使用Picard（1.54）軟件的MarkDuplicates.jar工具標(biāo)記文庫(kù)制備過(guò)程中PCR擴(kuò)增產(chǎn)生的重復(fù)品交排。隨后，使用GATK（3.7）軟件的RealignerTargetCreator和IndelRealigner工具（De Summa等人饵筑，2017）對(duì)Indel附近的序列進(jìn)行重新比較和校正埃篓，以提高Indel周圍SNP基因座的準(zhǔn)確性。對(duì)處理后的BAM文件進(jìn)一步進(jìn)行突變檢測(cè)根资。
2.4.葡萄球菌MNP標(biāo)記物的篩選和引物設(shè)計(jì)
基于前期收集的SNP信息（Wang et al.架专，2022），在全基因組中篩選MNP標(biāo)記位點(diǎn)玄帕。首先部脚，使用Bowite 2，使用默認(rèn)比較參數(shù)裤纹，將31個(gè)代表性葡萄菌株的全基因組數(shù)據(jù)與葡萄的參考基因組進(jìn)行比較：GCA_00000374.5.2_12X_genomic.fna.gz委刘。之后，使用SAMtools對(duì)結(jié)果進(jìn)行排序鹰椒，并以BAM格式保存——“-@6-m 2G”參數(shù)用于設(shè)置六個(gè)線程進(jìn)行排序锡移，以及2GB的內(nèi)存。使用帶有默認(rèn)參數(shù)的samtools-mpile軟件來(lái)識(shí)別所有SNP位點(diǎn)漆际。隨后淆珊，使用滑動(dòng)窗口法在整個(gè)基因組中搜索候選標(biāo)記位點(diǎn)——選擇125bp的基因組區(qū)域，對(duì)該區(qū)域中的SNPs進(jìn)行計(jì)數(shù)奸汇，并使用以下方程確定該區(qū)域中31個(gè)葡萄的判別力（DP）施符；
DP = n/N
其中，"n "是成對(duì)比較所有材料時(shí)可區(qū)分的樣本對(duì)數(shù)擂找，"N "是比較的樣本對(duì)總數(shù)操刀。
如果該區(qū)域包含 3 個(gè)以上 SNP 位點(diǎn)，且區(qū)分度大于 0.2婴洼，則該區(qū)域被視為候選 MNP 標(biāo)記位點(diǎn)骨坑。然后，向前滑動(dòng) 20 bp柬采，重新計(jì)算上述指標(biāo)欢唾。對(duì)得到的所有候選 MNP 標(biāo)記位點(diǎn)進(jìn)行物種特異性檢驗(yàn)，保留物種特異性最好的位點(diǎn)作為最終的葡萄 MNP 標(biāo)記位點(diǎn)粉捻。
2.5. 統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)分析
2.5.1. MNP 遺傳多樣性分析 根據(jù) MNP 基因型數(shù)據(jù)計(jì)算各種遺傳多樣性參數(shù)礁遣，如
MNP 基因型數(shù)據(jù)計(jì)算出各種遺傳多樣性參數(shù)，如小等位基因頻率 (MAF)肩刃、觀察到的雜合度 (Ho) 和多態(tài)信息含量 (PIC)祟霍。所有這些計(jì)算均在 Excel 2016 中使用以下公式進(jìn)行：
其中杏头，Pi 和 Pj 分別為第 i 和第 j 個(gè)等位基因的群體頻率。
基因型之間的遺傳距離用 TASSEL 5.0（Bradbury et al, 2007）中基因型的平均核苷酸差值來(lái)評(píng)估沸呐。
2.5.2. 全基因組重測(cè)序數(shù)據(jù)分析方法
根據(jù)全基因組重測(cè)序數(shù)據(jù)醇王，將獲得的數(shù)據(jù)與參考基因組進(jìn)行比較。使用 RectChr 軟件將獲得的 vcf 文件與測(cè)序樣本進(jìn)行比較崭添，分析 31 個(gè)代表性登錄樣本之間的遺傳差異寓娩。使用 vcftools-vcf 命令對(duì) vcf 文件進(jìn)行合并和過(guò)濾，以便進(jìn)行后續(xù)分析呼渣。使用 gcta_1.93.2beta 軟件（Yang et al, 2011）進(jìn)行主成分分析（PCA）棘伴。結(jié)構(gòu)分析使用 admixture_linux-1.3.0 軟件（Alexander 等，2009 年）進(jìn)行屁置。系統(tǒng)發(fā)生樹使用 FastTree（2.1.11焊夸，-gtr）軟件進(jìn)行分析。為了實(shí)現(xiàn)循環(huán)可視化蓝角，使用了 R 軟件（R 版本 4.1.1）中的 "circlize "軟件包（circlize 版本 0.4.15）阱穗。根據(jù)重測(cè)序數(shù)據(jù)以及樣本倍性和物種，使用 PowerMarker V3.25 和 Figtree v1.4.4 軟件繪制了 31 個(gè)代表性葡萄品種的聚類圖帅容。
3. 結(jié)果
3.1. 582 個(gè) MNP 標(biāo)記的遺傳信息
選擇 MNP 位點(diǎn)的目的是實(shí)現(xiàn)每個(gè)位點(diǎn)的高變異性颇象，以便從每個(gè) MNP 擴(kuò)增出多個(gè) SNP。所設(shè)計(jì)的 MNP 面板中實(shí)際可實(shí)現(xiàn)的 MNP 數(shù)量取決于測(cè)序深度并徘，該深度可覆蓋一定數(shù)量的設(shè)計(jì) MNP（Guo 等遣钳，2021 年）。本研究利用 MNP 技術(shù)對(duì) 31 個(gè)葡萄品種進(jìn)行了基因分型麦乞，共成功分型 582 個(gè) MNP 標(biāo)記蕴茴，包括 6078 bp 突變位點(diǎn)（圖 1A）。分析表明姐直，葡萄是雜合性很高的品種倦淀，夏黑及其早芽突變品種的遺傳背景相似。篩選出的 582 個(gè) MNP 標(biāo)記覆蓋了整個(gè)基因組声畏，發(fā)現(xiàn)它們均勻地分布在 19 條染色體上（圖 1B撞叽；補(bǔ)充表 2）。每個(gè) MNP 標(biāo)記包含 2-10 個(gè) SNP 位點(diǎn)插龄。
每個(gè) MNP 標(biāo)記的等位基因數(shù)從 1 到 20 不等愿棋。在 582 個(gè) MNP 標(biāo)記中，494 個(gè)標(biāo)記的區(qū)分度超過(guò) 80%均牢。此外糠雨，利用這 582 個(gè) MNP 標(biāo)記對(duì)同一品種的不同分生株上提取的 31 個(gè)代表性品種進(jìn)行 DNA 擴(kuò)增，結(jié)果一致徘跪，表明所鑒定的 MNP 標(biāo)記具有較高的重復(fù)性和穩(wěn)定性甘邀。
