隨著單細胞測序技術(shù)的發(fā)展奸汇，單細胞的應(yīng)用方向也由醫(yī)學(xué)領(lǐng)域逐漸向農(nóng)學(xué)領(lǐng)域拓展沥寥，樣本類型也不再局限于人卸察、鼠或模式物種她倘，而逐漸發(fā)散到各種各樣的經(jīng)濟動植物璧微。前幾期推文我們介紹了畜牧類物種單細胞的制備與經(jīng)驗，本期我們將走入植物樣本硬梁，探索植物的單細胞制備研究前硫。目前市面上常見的植物單細胞制備方法有兩種，一是原生質(zhì)體制備荧止，二是植物抽核屹电。

植物原生質(zhì)體制備

植物單細胞分析主要依賴于細胞壁酶解產(chǎn)生原生質(zhì)體阶剑，通過不同消化酶、不同配比危号、不同酶解時間的組合牧愁，實現(xiàn)原生質(zhì)體的制備，從而進行后續(xù)單細胞的上機研究外莲。諾禾致源根據(jù)已有文獻參考和大量的實戰(zhàn)積累猪半，研發(fā)了較為全面的原生質(zhì)體制備方法，讓我們以兩篇文獻為例偷线，看一看植物原生質(zhì)體的制備方案磨确。

花生葉片

1. 花生幼苗室溫(25℃)下，黑暗條件下生長一周声邦，收集幼苗葉片乏奥；

2. 將葉片切成1-2mm的條狀，加入含有30mL酶溶液的試管中亥曹，酶溶液由3%纖維素酶R-10邓了、1.5%離析酶R-10、0.3%果膠酶Y-23媳瞪、0.25% BSA驶悟、5 mm MES和8% (w/v)甘露醇(不含Ca2+和Mg2+)組成，在25°C下以40 rpm搖2小時材失；

3. 然后用40μm細胞濾器過濾細胞痕鳍；

4. 臺盼藍染色法檢測細胞活性，顯微鏡檢測細胞濃度龙巨；

5. 原生質(zhì)體在8% (w/v)甘露醇溶液中重懸笼呆，上樣10x Genomics微流控芯片。

參考文獻：Single-cell RNA-seq describes the transcriptome landscape and identifies critical transcription factors in the leaf blade of the allotetraploid peanut (Arachis hypogaea L.), DOI: 10.1111/pbi.13656

擬南芥根

1. 播種后五天旨别，每個樣品收集1,000-3,500個初級根诗赌，距離根尖約0.5cm處剪斷；

2. 樣本放入一個直徑35mm的培養(yǎng)皿中秸弛，含有70μm細胞過濾器和4.5mL酶解液铭若；

3. 酶解液包含1.25% [w/v]纖維素酶，0.1%離析酶递览，0.4 M甘露醇叼屠，20 mM MES（pH 5.7），20 mM KCl绞铃，10 mM CaCl2镜雨，0.1%牛血清白蛋白和0.000194% (v/v)巰基乙醇；

4. 在搖床上以25℃儿捧、85rpm的條件下消化1小時荚坞，偶爾攪拌挑宠；

5. 將細胞溶液通過40μm的細胞過濾器過濾兩次，并以500xg的速度離心5分鐘颓影；

6. 用1mL洗滌液各淀，包括0.4 M甘露醇，20 mM MES（pH 5.7）诡挂，20 mM KCl揪阿，10 mM CaCl2，0.1%牛血清白蛋白和0.000194% (v/v)巰基乙醇重懸沉淀物咆畏，并在500xg的速度離心3分鐘南捂；

7. 沉淀用洗滌液重懸至約1000個細胞/μL的終濃度，上樣10x Genomics微流控芯片旧找。

參考文獻：A single-cell Arabidopsis root atlas reveals developmental trajectories in wild-type and cell identity mutants, DOI: 10.1016/j.devcel.2022.01.008

植物抽核制備

抽核的優(yōu)點在于能夠從難以酶解消化的植物組織中獲取細胞核內(nèi)的信息進行單細胞研究溺健，對于難以進行原生質(zhì)體制備的組織、原生質(zhì)體制備后直徑過大钮蛛，或者需要排除應(yīng)激反應(yīng)影響的研究鞭缭，可以采用植物抽核的方式，通常情況下植物抽核可以搭配流式細胞儀去除碎片魏颓，防止儀器堵塞實驗失敗岭辣。

玉米根尖

1. 組織放置在培養(yǎng)皿中，加入500μL LB01緩沖液中：15mM Tris pH 7.5甸饱，2mM EDTA沦童，0.5mM Spermine，80mM KCl叹话，20mM NaCl偷遗，15mM 2-ME，0.15% TrixtonX-100驼壶，切碎處理2分鐘氏豌；

2. 通過兩層miracloth過濾均質(zhì)化的組織；

3. 用DAPI染色至最終濃度約1μM热凹，并加載到流式細胞術(shù)儀器上泵喘；

4. 每個樣品分選120,000個細胞核，分別裝入四個收集管（每個管30,000個細胞核）般妙，每個管含有200μL LB01纪铺；

5. 分離的細胞核在搖床離心機中離心沉淀（5分鐘，500 rcf）股冗，重懸于10μL LB01中霹陡，混合后在帶熒光顯微鏡的血細胞計數(shù)板上進行觀察和蚪；

6. 將細胞核懸液離心沉淀（5分鐘止状，500 rcf）烹棉，并重懸于稀釋的細胞核緩沖液（10X Genomics）中，最終達到3,200個細胞核/μL的終濃度怯疤。

參考文獻：A cis-regulatory atlas in maize at single-cell resolution, DOI: 10.1016/j.cell.2021.04.014

玉米葉片

1.10日齡幼苗浆洗，使用顯微鑷子機械剝離大約100個幼苗的葉下表皮，并收集幼苗1cm段葉基集峦，剝離的表皮和葉基樣品在冰水中保存伏社，以便進行核分離的前處理；

2.材料吸干后（0.3g鮮重）置于一個5cm直徑的一次性無菌塑料培養(yǎng)皿中塔淤，含2mL Galbraith緩沖液摘昌，并添加了2%牛血清白蛋白、20μL二硫蘇糖醇（DTT）（1 M DTT在DEPC處理的雙蒸餾水中）高蜂、20μL RNase抑制劑1和10μL RNase抑制劑2聪黎；

3.用新的雙刃刀切碎經(jīng)過吸干的材料，將均質(zhì)物通過30μm的細胞過濾器分別過濾备恤，添加PI至最終濃度為50 μg/mL稿饰；

4.使用70或75μm的噴嘴進行細胞核的流式分選，0.01M磷酸鹽緩沖液（DEPC處理的水）作為鞘液露泊，通常在5-10分鐘內(nèi)喉镰，可分選出大約40,000個細胞核；

5.細胞核分選到一個預(yù)先用2% BSA漂洗過的2mL蛋白質(zhì)LoBind離心管惭笑，通過相差顯微鏡預(yù)估細胞核完整性侣姆，使用細胞計數(shù)器確認細胞核濃度。

參考文獻：The maize single-nucleus transcriptome comprehensively describes signaling networks governing movement and development of grass stomata, DOI: 10.1093/plcell/koac047

植物的送樣建議

植物樣本要求

寄送活株沉噩，可以使用木架固定培養(yǎng)瓶及幼苗铺敌，以保證運輸途中植物完整性及狀態(tài)的穩(wěn)定性，用于制備的目標組織量建議>2g

制備樣本

上機前建議檢測指標

a.捕獲上機的液體用不含Ca2+屁擅，Mg2+的緩沖液

b.AOPI計數(shù)偿凭，活性指標>60%，實驗背景相對干凈

關(guān)于特殊樣本類型

含淀粉樣本無法進行原生質(zhì)體制備派歌，只能抽核處理

如樣本涉及真菌侵染弯囊、細菌處理、病毒胶果、蟲害等處理匾嘱，需要確認樣本詳細情況，是否存在寄生早抠，是否存在殘留霎烙，如有殘留、影響別的物種，具有產(chǎn)生交叉污染的風(fēng)險悬垃，則無法進行實驗