影響因子：9.7

研究概述：DNA損傷修復(fù)（DDR）在肝細(xì)胞癌（HCC）中發(fā)揮著關(guān)鍵作用截驮，推動(dòng)著腫瘤的發(fā)生笑陈、發(fā)展和治療反應(yīng)。然而葵袭，DDR介導(dǎo)的免疫細(xì)胞和免疫調(diào)節(jié)途徑在HCC中的作用機(jī)制尚不明確涵妥。作者利用單細(xì)胞RNA測(cè)序（scRNA-seq）和bulk RNA-seq數(shù)據(jù)，引入了一種創(chuàng)新的深度機(jī)器學(xué)習(xí)框架坡锡，用于精確評(píng)估DDR蓬网。作者獲得了單細(xì)胞RNA測(cè)序數(shù)據(jù)，共分析了85628個(gè)原發(fā)性或免疫治療后病例的細(xì)胞鹉勒。大規(guī)模HCC數(shù)據(jù)集（包括1027名患者的內(nèi)部數(shù)據(jù)集和公共數(shù)據(jù)集）被用于101個(gè)機(jī)器學(xué)習(xí)模型帆锋，并在單細(xì)胞分辨率（DDRscore）上得出了新的DDR特征。利用169名HCC患者的反相蛋白質(zhì)陣列（RPPA）蛋白質(zhì)組圖譜和22種肝癌細(xì)胞系的RNA-seq數(shù)據(jù)禽额，預(yù)先推測(cè)了可用藥靶點(diǎn)锯厢。研究的示意圖見圖1A。

研究結(jié)果：

HCC惡性細(xì)胞的DDR異質(zhì)性分析

為了揭示哪些細(xì)胞區(qū)對(duì)患者間的異質(zhì)性貢獻(xiàn)最大绵疲，作者使用標(biāo)記基因?qū)γ總€(gè)細(xì)胞群進(jìn)行了注釋和分區(qū)哲鸳。HCC生態(tài)系統(tǒng)的組成主要由肝細(xì)胞和B細(xì)胞（BCs）等構(gòu)成（圖1B）。為了進(jìn)一步了解瘤內(nèi)異質(zhì)性盔憨，作者比較了單個(gè)樣本水平的細(xì)胞區(qū)的內(nèi)容（圖1C）徙菠。作者應(yīng)用CopyKAT算法從9個(gè)腫瘤樣本中提取了9957個(gè)惡性細(xì)胞，并作進(jìn)一步分析（圖1D）郁岩。觀察到的瘤間異質(zhì)性突顯了惡性細(xì)胞因原發(fā)樣本而存在的生物學(xué)差異（圖1E左側(cè)面板）婿奔。此外缺狠，不同樣本中已確定的惡性細(xì)胞群的頻率也各不相同，樹枝圖顯示萍摊，這些惡性細(xì)胞群基本上根據(jù)病理階段形成了聚類（圖1E右圖）挤茄。為了量化惡性細(xì)胞的DDR狀態(tài)，作者首先對(duì)9957個(gè)惡性細(xì)胞的單細(xì)胞表達(dá)譜進(jìn)行了高維加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析（hdWGCNA）冰木，以提取與致癌轉(zhuǎn)化相關(guān)的基因穷劈。接下來，作者從所有已識(shí)別模塊中選出了3230個(gè)與TNM分期顯著相關(guān)的基因踊沸，作為腫瘤進(jìn)展的關(guān)鍵指標(biāo)（圖1F）歇终。其中，56個(gè)基因已知參與了DDR過程（圖1G）逼龟。

作者開發(fā)了一個(gè)參數(shù)化評(píng)分系統(tǒng)（DDRscore）评凝，可根據(jù)惡性細(xì)胞定量評(píng)估DDR狀態(tài)，通過此系統(tǒng)作者發(fā)現(xiàn)與晚期HCC相比腺律，早期HCC的DNA損傷修復(fù)活性水平明顯更高（圖1H）奕短，這支持了之前的假設(shè)。利用惡性細(xì)胞的DDR評(píng)分得出HCC樣本的總體DDR水平匀钧，DDR水平大于0的樣本被定義為"DDR-高"組翎碑，而DDR水平小于0的樣本被定義為"DDR-低"組（圖1I）。在這種分組分配下之斯，作者根據(jù)基因富集分析比較了相關(guān)通路以區(qū)分這些腫瘤細(xì)胞杈女，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了抗腫瘤的p53和腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（TRAIL）通路在低DDR組中上調(diào)，而親腫瘤的表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）和磷脂酰肌醇3-激酶（PI3Ks）通路在高DDR組中上調(diào)吊圾，這驗(yàn)證了作者的DDR評(píng)分分類（圖1J）达椰。綜上所述，這些結(jié)果表明项乒，惡性細(xì)胞的DDR在腫瘤間具有顯著的異質(zhì)性啰劲，可能會(huì)導(dǎo)致腫瘤進(jìn)展。

不同DDR條件下HCCTME生態(tài)系統(tǒng)的不同特征

在闡明DDR驅(qū)動(dòng)的致瘤性改變后檀何，作者繼續(xù)從TME角度探索HCC樣本的差異蝇裤。作者以單細(xì)胞分辨率生成了DDR-high和DDR-low TME（圖2A），然后應(yīng)用基于OR的統(tǒng)計(jì)分析來評(píng)估潛在的細(xì)胞類型改變频鉴。作者發(fā)現(xiàn)栓辜，NK細(xì)胞與“低DDR”組的聯(lián)系最強(qiáng)，而B細(xì)胞似乎在“高DDR”組中富集最多（圖2B）垛孔。通過關(guān)注NKs子種群藕甩，作者生成了一個(gè)自由分類，然后作者進(jìn)一步解剖了這些異源細(xì)胞群的細(xì)節(jié)周荐。對(duì)于NK細(xì)胞狭莱，單細(xì)胞表達(dá)譜（包括DDR-高和DDR-低腫瘤）在各種分辨率下進(jìn)行聚類僵娃，隨后構(gòu)建分類樹。結(jié)果表明該樹中有一個(gè)穩(wěn)定的區(qū)域（圖2C）腋妙。NKs聚集成六個(gè)亞群:SPP1+NKs默怨、LDLRAD4+NKs、GSTA1+NKs骤素、IGLC3+NKs匙睹、IRF8+NKs和FCGR3A+NKs（圖2D–E）。在這些NK亞群中济竹，大多數(shù)（78%）屬于“低DDR”組垃僚，這些亞群主要包含SPP1+NKs、LDLRAD4+NKs规辱、IRF8+NKs和FCGR3A+NKs。相反栽燕，“DDR-高”組以GSTA1+NK和IGLC3+NK為主（圖2F）罕袋。

對(duì)于B細(xì)胞，作者還將其分為CD20+B細(xì)胞和CD138+漿細(xì)胞(圖2G下圖)碍岔。值得注意的是浴讯，CD20+B細(xì)胞在“DDR-低”組比“DDR-高”組更常見(圖2G，上圖)蔼啦。通路分析表明榆纽，CD20+在“DDR-高”患者中激活了“PPAR信號(hào)通路”，而在“DDR-低”患者中激活了“胞漿DNA傳感通路”捏肢，即cGAS-STING通路奈籽。對(duì)于CD138+漿細(xì)胞，“DDR-High”組的“B細(xì)胞受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)”活性也升高鸵赫，而“DDR-low”組的“糖酵解糖異生”增強(qiáng)(圖2H-K)衣屏。

免疫檢查點(diǎn)阻斷后高DDR介導(dǎo)的免疫抑制特點(diǎn)

為了揭示導(dǎo)致免疫療法引起的生物差異的關(guān)鍵細(xì)胞成分，作者首先使用“TransferData”算法通過引用上述SING細(xì)胞數(shù)據(jù)(GSE149614)推導(dǎo)出的細(xì)胞類型來注釋細(xì)胞類型(圖3A)辩棒。此外狼忱，與非免疫組相比，免疫組的惡性細(xì)胞較少一睁，CD8+T細(xì)胞較多(圖3B)钻弄。在確保細(xì)胞注釋和聚集的穩(wěn)健性后，作者注意到免疫治療后總體肝癌腫瘤上皮比率下降者吁，這一發(fā)現(xiàn)可能歸因于免疫檢查點(diǎn)抑制劑誘導(dǎo)的腫瘤殺傷(圖3B-C)窘俺。與非免疫治療的肝細(xì)胞癌相似，H08复凳、H68和H74都表現(xiàn)出相當(dāng)大的腫瘤間異質(zhì)性批销，相比之下洒闸，接受免疫治療的其他肝癌細(xì)胞彼此相對(duì)較近(圖3D)。接下來均芽，作者使用DDRScore算法來探索這些ICI治療樣本中的DDR狀態(tài)丘逸，在患者水平上，不同的DDR狀態(tài)形成了不同的TME掀宋，一些免疫表型成分發(fā)生了變化(圖3E)深纲。作者進(jìn)一步對(duì)按DDR狀態(tài)分層的惡性細(xì)胞群體進(jìn)行了差異和功能分析。作者觀察到“DDR-LOW”組激活了脂肪酸代謝途徑劲妙、WNT途徑和可能的致癌MYC激活(圖3F-G)湃鹊。相反，“DDR-HIGH”組表現(xiàn)為上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)镣奋，KRAS的致癌激活與上述發(fā)現(xiàn)相匹配(圖3E)币呵。

接下來，為了探索EMT是如何介導(dǎo)DDR轉(zhuǎn)變的侨颈，作者繪制了腫瘤細(xì)胞的發(fā)展軌跡余赢。偽時(shí)間推斷了一種從惡性細(xì)胞團(tuán)開始并逐漸分化為成纖維細(xì)胞的發(fā)展趨勢(shì)，這表明在DDR適應(yīng)條件下纖維化TME的形成可能起到了作用(圖3H)哈垢。最后妻柒，作者調(diào)查了不同DDR評(píng)分患者的免疫細(xì)胞成分，特別是LAG-3在“DDR-LOW”患者的CD8+T細(xì)胞中的表達(dá)顯著升高(圖3I)耘分。此外举塔，通過測(cè)量MHC分子，作者發(fā)現(xiàn)MHCI分子HLAA求泰、B央渣、C(經(jīng)典)和HLA-E、F渴频、G(非經(jīng)典)顯示出增加的伴侶痹屹，類似地，細(xì)胞類型特異性MHCII分子(僅限于B細(xì)胞枉氮、DC和巨噬細(xì)胞介導(dǎo))在“DDR-LOW”患者中同時(shí)上調(diào)(圖3I)志衍。綜上所述，這些現(xiàn)象表明聊替，以DDR分?jǐn)?shù)為特征的DDR狀態(tài)在TME中對(duì)區(qū)分接受ICI免疫治療的肝癌患者具有一定的調(diào)節(jié)作用楼肪。

共同中心基因的選擇和驗(yàn)證

作者接下來使用了多種生物信息學(xué)工具（CellPhoneDB、NicheNet和scMLnet）來識(shí)別ICI治療患者不同DDR狀態(tài)下特定細(xì)胞類型中配體-受體對(duì)之間的分子相互作用惹悄。在整體范圍來看春叫，TME細(xì)胞-細(xì)胞間的通訊發(fā)生了動(dòng)態(tài)重編程，其中"DDR-高"通過成纖維細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞軸集中，而"DDR-低"則完全轉(zhuǎn)向以巨噬細(xì)胞為主的模式（圖4A-B）暂殖。在DDR低的組中价匠，與巨噬細(xì)胞、DC和NK細(xì)胞的交流分別增加（圖4B-C）呛每。除了CD8+T細(xì)胞自身相互作用產(chǎn)生的通訊外踩窖，與內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的相互作用現(xiàn)象也較少（圖4B-C）晨横。從配體表達(dá)水平來看洋腮，利用NicheNet算法，作者確定了與不同DDR水平相關(guān)的主要配體表達(dá)（圖4D）作者使用CellphoneDB進(jìn)一步研究了它們潛在的互作分子（圖4E）手形。

通過生成一個(gè)完整的"配體-受體-轉(zhuǎn)錄因子-靶基因"網(wǎng)絡(luò)啥供，進(jìn)一步研究了這一"DCs-CD8+T細(xì)胞"相互作用軸，并預(yù)測(cè)了"DDR-低"組中可能受調(diào)控的多種免疫相關(guān)通路库糠。這一相互作用網(wǎng)絡(luò)不僅證實(shí)了之前發(fā)現(xiàn)的通過HLA-B伙狐、HLA-F/E和B2M等MHC呈遞的交叉對(duì)話，還證實(shí)了可能通過PD1/PD-L1通路橋接的致癌MYC基因激活（圖4F）瞬欧。有趣的是贷屎，CXCL10-CXCR3軸的一個(gè)重要靶基因IFNG可通過GATA3、REL和TBX21等轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控黍判，這揭示了CXCL10-CXCR3軸在低DDR狀態(tài)下招募DC和CD8+T細(xì)胞與CD8+T細(xì)胞相互作用并介導(dǎo)CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn)腫瘤龕中的關(guān)鍵作用（圖4F）。為此篙梢，作者的研究結(jié)果在使用生物信息學(xué)工具進(jìn)行深入分析的支持下顷帖，描述了免疫治療后以DDR狀態(tài)為特征的HCCTME的動(dòng)態(tài)變化（圖4G），從而探索了未來可能的治療策略渤滞。

DDR共識(shí)特征可預(yù)測(cè)HCC預(yù)后和免疫療法反應(yīng)性

為了進(jìn)一步利用上述轉(zhuǎn)錄特征贬墩，作者提取了通過單細(xì)胞RNA-seq鑒定出的56個(gè)重要DDR基因，并開發(fā)了一種基于機(jī)器學(xué)習(xí)的整合技術(shù)妄呕，利用外部大量RNA-seq數(shù)據(jù)集生成DDRscores陶舞。作者利用LOOCV框架擬合了101種組合式機(jī)器學(xué)習(xí)方法，并將TCGA-LIHC隊(duì)列作為訓(xùn)練數(shù)據(jù)集绪励，將ICGC-LIRI-JP隊(duì)列作為驗(yàn)證數(shù)據(jù)集肿孵。作者計(jì)算了每個(gè)模型的C指數(shù)（圖5A）。由此疏魏，作者得出了平均C指數(shù)為0.843的最佳預(yù)測(cè)模型（Lasso+隨機(jī)生存森林停做，RSF）（圖5A，右面板條形圖）大莫。

當(dāng)部分似然偏差達(dá)到最小值時(shí)蛉腌，使用LOOCV框架確定了最佳λ（圖5B，左側(cè)面板）。在此截?cái)鄺l件下烙丛，使用非零Lasso系數(shù)的RSF分析最終確定了17個(gè)DDR基因的重要性（圖5B舅巷，右圖）。然后利用RSF模型中17個(gè)DDR基因的回歸系數(shù)加權(quán)表達(dá)確定了每位患者的DDR評(píng)分河咽，隨后將患者分為"DDR高"或"DDR低"組钠右。作者發(fā)現(xiàn)在TCGA-LIHC和ICGC-LIRI-JP數(shù)據(jù)集中，"DDR高"患者的總生存期（OS）明顯低于"DDR低"患者（圖5C-D）库北。根據(jù)上述結(jié)論爬舰，基于所選17個(gè)基因建立的模型顯示，與"DDR低"組相比寒瓦，"DDR低"組患者的OS和無復(fù)發(fā)生存率（RFS）均有所改善（圖5E-F）情屹。

使用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行的進(jìn)一步分析也證明，在所有三個(gè)獨(dú)立隊(duì)列中杂腰，"DDR-低"HCC患者的生存獲益（圖5G-I）垃你。至此，這些結(jié)果證實(shí)了通過定量DDR狀態(tài)評(píng)估生成的穩(wěn)健模型喂很，該模型可能是預(yù)測(cè)HCC患者獲益的潛在預(yù)后指標(biāo)惜颇。作者還利用亞類圖譜將已確定的DDRscore組的表達(dá)模式與另一個(gè)已發(fā)表的包含47例免疫治療反應(yīng)性黑色素瘤患者的數(shù)據(jù)集的表達(dá)模式進(jìn)行了對(duì)比。使用TIDE算法模型少辣，所有三個(gè)獨(dú)立隊(duì)列都顯示低DDRscore與PD-1反應(yīng)之間可能存在關(guān)聯(lián)凌摄，而高DDRscore則傾向于PD-1無效（圖5J）。最后漓帅，通過使用獨(dú)立隊(duì)列锨亏，作者發(fā)現(xiàn)高DDRscore與疾病進(jìn)展相關(guān)（圖5K）。綜上所述忙干，作者的研究結(jié)果表明器予，DDRscore的額外值可能與免疫療法的療效有關(guān)，這一發(fā)現(xiàn)也得到了上述單細(xì)胞分析的證實(shí)捐迫。

通過抑制B-Raf通路以靶向高DDR評(píng)分的HCC患者

為了確定與DDR狀態(tài)相關(guān)的潛在治療靶點(diǎn)赞哗，尤其是那些DDR評(píng)分高乾颁、臨床療效可能較差的患者湿右，作者首先計(jì)算了22種HCC細(xì)胞系的DDR評(píng)分（圖6A）吭狡。然后缔俄，作者從TCGA-LIHC隊(duì)列中檢索了反相蛋白陣列（RPPA）數(shù)據(jù)遏佣，并將單個(gè)患者的DDR評(píng)分與配對(duì)的RPPA蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)進(jìn)行了關(guān)聯(lián)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)B-Raf表達(dá)與DDRscore呈正相關(guān)（圖6B）走敌。接下來异雁，作者應(yīng)用CERES評(píng)分評(píng)估了基于22個(gè)肝癌細(xì)胞系的單個(gè)基因依賴性與DDR評(píng)分之間的相關(guān)性，結(jié)果再次篩選出BRAF基因是高DDR評(píng)分的重要預(yù)測(cè)因子（圖6C）。

利用涵蓋384種關(guān)鍵致癌和可藥用蛋白及其修飾形式的面板取胎，作者發(fā)現(xiàn)B-Raf的活性形式（絲氨酸445處磷酸化的B-Raf）及其下游靶標(biāo)MARK3和ERK1/2在HCC中顯著升高（圖6D-E）。同時(shí)湃窍，作者還發(fā)現(xiàn)BRAF在DDR高分組中明顯上調(diào)（圖6F）闻蛀。這些數(shù)據(jù)結(jié)合了外部TCGA數(shù)據(jù)和內(nèi)部RPPA圖譜分析，揭示了針對(duì)DDR高患者的BRaf通路的潛在治療弱點(diǎn)您市，可能對(duì)患者分層具有重要的臨床意義觉痛。

研究總結(jié)：

作者的研究揭示了原發(fā)性HCC微環(huán)境中DDR與自然殺傷細(xì)胞和B細(xì)胞的動(dòng)態(tài)相互作用，通過新陳代謝程序形成了一種促進(jìn)腫瘤的免疫環(huán)境墨坚。對(duì)免疫治療后HCC的分析表明秧饮，DDR水平的升高誘導(dǎo)了上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化和成纖維細(xì)胞樣轉(zhuǎn)化，重塑了纖維化腫瘤微環(huán)境泽篮。相反盗尸，減弱的DDR可促進(jìn)樹突狀細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的抗原交叉呈遞，從而調(diào)節(jié)炎癥性腫瘤微環(huán)境帽撑。調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)泼各，CXCL10-CXCR3軸是低DDRHCC免疫治療反應(yīng)的關(guān)鍵決定因素，可能受轉(zhuǎn)錄因子GATA3亏拉、REL和TBX21的調(diào)控扣蜻。作者利用機(jī)器學(xué)習(xí)技術(shù)，將內(nèi)部的大量RNA-seq數(shù)據(jù)與公共數(shù)據(jù)集結(jié)合起來及塘，推出了DDRscore這一穩(wěn)健的共識(shí)DDR評(píng)分系統(tǒng)莽使，用于預(yù)測(cè)HCC患者的總生存期和對(duì)PD-1療法的耐藥性。最后笙僚，作者確定BRAF為高DDRscore患者的潛在治療靶點(diǎn)芳肌。