質(zhì)粒是分子生物學(xué)研究的重要工具，猶如士兵手里的槍瞻惋，其地位不言而喻小染。過去幾十年的時間里，質(zhì)粒在不同研究者之間傳遞箱舞，極大地推動了生命科學(xué)的研究進(jìn)程遍坟。然而質(zhì)粒經(jīng)歷了傳遞，改造晴股，再傳遞的過程愿伴，再加上可能存在的突變（自發(fā)突變，酶保真性因素等等）电湘，我們手里拿到的質(zhì)粮艚冢可能已經(jīng)變得很"臟"。
就像下面這樣寂呛，雖然可以運行怎诫，但也有可能在某一刻失靈，更為確切的說贷痪，像是一件修修補補的衣服幻妓，程序員看了都要砸了鍵盤。
言歸正傳劫拢，上鏈接肉津，"Sorry，是案例"??
文獻(xiàn)：Zakataeva NP, Nikitina OV, Gronskiy SV, Romanenkov DV, Livshits VA. A simple method to introduce marker-free genetic modifications into the chromosome of naturally nontransformable Bacillus amyloliquefaciens strains. Appl Microbiol Biotechnol. 2010 Jan;85(4):1201-9. doi: 10.1007/s00253-009-2276-1. Epub 2009 Oct 10. PMID: 19820923.
在這篇文獻(xiàn)中舱沧，作者構(gòu)建了新的穿梭載體pNZT1妹沙，方法是將載體pKS1用 Eco32I 內(nèi)切酶（平末端切口）消化后連接而成，剔除了kanamycin resistance gene熟吏。
載體pKS1圖譜如下：
因為這個SnapGene自動注釋并不完善距糖，所以我們導(dǎo)入到plannotate中注釋結(jié)構(gòu)信息玄窝，得到如下圖譜：
因此可以看出一些問題：
- 作者為了剔除Kanamycin resistance gene，簡單的酶切去除部分Kan片段肾筐，所以有一部分殘留序列(kanR fragment)哆料。
- 序列中也殘留 knt fragment、lacZ fragment吗铐、HA-R等东亦，這是原始載體pKS1帶來的。
在深挖pKS1原始文獻(xiàn)[1]唬渗，發(fā)現(xiàn)其改造過程如下： pTV1-OK was digested by PstI and HindIII and the 1.3 kb fragment containing aphA3 (kanamycin resistance determinant of Enterococcus fecalis) was inserted between appropriate sites of pG-host9.
可以得出一些結(jié)論：
- 由于時代原因典阵，技術(shù)水平相對落后低，采用限制性內(nèi)切酶克隆的方法镊逝，不可能隨心所欲地改造任意片段壮啊，這就導(dǎo)致了有意或無意殘留一些"Scar Sequence"。現(xiàn)在無縫克隆早已擺脫了內(nèi)切酶的限制撑蒜。
- 作者可能也沒有意識到的一些片段的作用歹啼。
也許有人會覺得過于吹毛求疵，那么請看pHT01載體改進(jìn)的原始文獻(xiàn)[2]
"During the use of these two vectors, we detected structural instability after transformation of these vectors in E. coli. A close inspection of the DNA sequence of these vectors revealed a 117-bp direct repeat already present within the original shuttle cloning vector pNDH33"
那么座菠，如何查看自己所獲取的質(zhì)粒完整結(jié)構(gòu)信息呢狸眼，參看文章如何獲取質(zhì)粒上的特征元件
流程如下：
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Shatalin KY, Neyfakh AA. Efficient gene inactivation in Bacillus anthracis. FEMS Microbiol Lett. 2005 Apr 15;245(2):315-9. doi: 10.1016/j.femsle.2005.03.029. PMID: 15837388. ?
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Nguyen HD, Phan TT, Schumann W. Expression vectors for the rapid purification of recombinant proteins in Bacillus subtilis. Curr Microbiol. 2007 Aug;55(2):89-93. doi: 10.1007/s00284-006-0419-5. Epub 2007 Jul 11. PMID: 17624574. ?
