在科學(xué)研究中师崎，細(xì)胞遷移和侵襲是理解生物體內(nèi)許多重要過(guò)程的關(guān)鍵默终。本期文章深入探討了常用的檢測(cè)方法：細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和 Transwell 遷移/侵襲實(shí)驗(yàn)。一起來(lái)看下吧~

我的"寶貝"細(xì)胞終于養(yǎng)好了，導(dǎo)兒說(shuō)做遷移和侵襲試試齐蔽，一頭霧水......

莫慌两疚，遷移和侵襲可是大有不同！小 M 整理的這篇“干貨”涵蓋了基礎(chǔ)講解肴熏，實(shí)驗(yàn)操作鬼雀，以及常見(jiàn)問(wèn)題解答，包會(huì)的蛙吏！

01

遷移VS侵襲,大不同源哩！

細(xì)胞遷移

細(xì)胞遷移?(又稱(chēng)“細(xì)胞爬行、細(xì)胞移動(dòng)或細(xì)胞運(yùn)動(dòng)”)?是細(xì)胞在接收到遷移信號(hào)或感受到其他物質(zhì)的梯度后而產(chǎn)生的移動(dòng)鸦做。細(xì)胞伸出頭部偽足并建立新的黏附励烦，通過(guò)收縮細(xì)胞體尾部在時(shí)空上交替的過(guò)程。

遷移是活細(xì)胞普遍存在的一種運(yùn)動(dòng)形式泼诱，胚胎發(fā)育坛掠、傷口愈合、免疫應(yīng)答治筒、組織重塑等重要生命活動(dòng)過(guò)程都涉及細(xì)胞遷移[1][2]屉栓。

圖 1. 細(xì)胞遷移的示意圖[3]。?

細(xì)胞侵襲

細(xì)胞侵襲是入侵的細(xì)胞?(如癌細(xì)胞)?分泌蛋白酶降解胞外基質(zhì)層?(ECM)?或基底膜基質(zhì)層?(BME)耸袜，穿透基質(zhì)或組織進(jìn)入血管和淋巴管友多，從一個(gè)區(qū)域侵入到另一個(gè)區(qū)域的過(guò)程。

侵襲常發(fā)生于癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移等過(guò)程中堤框，是細(xì)胞遷移的一種特殊形式[2]域滥。

? Tips：

侵襲是腫瘤細(xì)胞及其微環(huán)境發(fā)生多種變化的累積結(jié)果，這些變化使細(xì)胞能夠遷移并侵入健康的宿主組織蜈抓。

當(dāng)增殖的腫瘤細(xì)胞試圖逃離原發(fā)腫瘤部位時(shí)启绰，必須發(fā)生局部細(xì)胞粘附和周?chē)M織的侵襲。在穿透血管內(nèi)皮并進(jìn)入血流之前沟使，癌細(xì)胞必須通過(guò)降解胞外基質(zhì)層?(ECM)?蛋白質(zhì)成分侵入局部組織委可，并最終穿過(guò)基底膜。一旦進(jìn)入血液循環(huán)腊嗡，這些細(xì)胞就可以在次要位置形成轉(zhuǎn)移性集落撤缴。

細(xì)胞遷移和侵襲都是細(xì)胞在環(huán)境中移動(dòng)，依賴(lài)于細(xì)胞骨架的重組和細(xì)胞膜的動(dòng)態(tài)變化叽唱，且受到細(xì)胞外信號(hào)?(如趨化因子、細(xì)胞因子等)?調(diào)控微宝，與 ECM 的相互作用密切相關(guān)棺亭。但二者在機(jī)制、功能和意義方面有所區(qū)別蟋软。

表 1. 細(xì)胞遷移和細(xì)胞侵襲的不同比較[4]镶摘。

02

細(xì)胞遷移檢測(cè)

細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)可以揭示遷移機(jī)制嗽桩，用于藥物篩選與評(píng)估。廣泛應(yīng)用于癌癥研究凄敢、傷口愈合碌冶、免疫學(xué)、發(fā)育生物學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域涝缝。

細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和 Transwell 遷移實(shí)驗(yàn)是檢測(cè)細(xì)胞遷移能力最常見(jiàn)的方法扑庞。

細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)

??一、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)拒逮，又稱(chēng)“傷口愈合實(shí)驗(yàn)”罐氨，是一種經(jīng)典的檢測(cè)細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)與修復(fù)能力的方法。

原理：在體外培養(yǎng)皿或平板培養(yǎng)的單層貼壁細(xì)胞上滩援，用槍頭或其它硬物在細(xì)胞生長(zhǎng)的中央?yún)^(qū)域劃線(xiàn)栅隐，去除中央部分的細(xì)胞，然后繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞至實(shí)驗(yàn)設(shè)定的時(shí)間玩徊，依據(jù)劃痕邊緣細(xì)胞逐漸進(jìn)入空白區(qū)域使“劃痕”愈合的能力租悄，判斷細(xì)胞生長(zhǎng)遷移能力[5]。其可模擬傷口愈合過(guò)程恩袱，用于評(píng)估細(xì)胞在傷口處的遷移能力泣棋。

圖 2. 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)的示意圖[6]。?

實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備：細(xì)胞憎蛤、培養(yǎng)基外傅、Transwell 小室或培養(yǎng)皿、劃痕工具?(無(wú)菌移液槍尖俩檬、劃痕刮刀或細(xì)胞劃痕器)萎胰、顯微鏡、合適的染色試劑?(如結(jié)晶紫或 DAPI)棚辽。

實(shí)驗(yàn)步驟

(1)?細(xì)胞培養(yǎng)：將細(xì)胞以適宜的密度接種到培養(yǎng)皿或小室中進(jìn)行培養(yǎng)技竟，直到細(xì)胞生長(zhǎng)到 80%-90% 匯合狀態(tài)。

(2)?劃痕制備：使用無(wú)菌移液槍頭或劃痕器在細(xì)胞單層上輕輕劃出一道直線(xiàn)或網(wǎng)格狀傷口屈藐，確崩谱椋可以形成均勻的劃痕。在劃痕處联逻，盡量避免損傷周?chē)?xì)胞搓扯，以減少對(duì)數(shù)據(jù)的干擾。

(3)?清洗細(xì)胞：輕輕用 PBS 沖洗細(xì)胞兩次包归，以去除游離的锨推、未附著的細(xì)胞。

(4)?更換培養(yǎng)基：更換新鮮的培養(yǎng)基，保持實(shí)驗(yàn)條件的一致性换可。

(5)?觀察劃痕愈合：用顯微鏡拍攝劃痕的圖像椎椰，記錄初始劃痕的狀態(tài)?(T0)，隨后在 0沾鳄、12慨飘、24、48 小時(shí)等不同時(shí)間點(diǎn)拍照译荞，觀察劃痕的寬度或遷移的細(xì)胞數(shù)瓤的。

(6)?數(shù)據(jù)分析：使用圖像分析軟件?(如 ImageJ)?分析拍攝的圖像，測(cè)量劃痕的寬度磁椒，計(jì)算愈合面積堤瘤。

圖 3. 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)中測(cè)量 NIH3T3 細(xì)胞遷移 (上) 和 M3 黑色素瘤細(xì)胞遷移 (下)?[5][7]。

注意事項(xiàng)

劃痕：劃痕時(shí)確保寬度一致浆熔，形狀盡量規(guī)則本辐。

對(duì)照組：設(shè)置適當(dāng)?shù)膶?duì)照組?(如未處理組)?以便比對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

顯微鏡觀察：定期拍照記錄医增，確保拍攝角度一致慎皱，以便于后期比較。

Transwell 遷移實(shí)驗(yàn)

? 二叶骨、Transwell 遷移實(shí)驗(yàn)

Transwell 遷移實(shí)驗(yàn)茫多，又稱(chēng)“穿孔實(shí)驗(yàn)”，是一種廣泛使用的細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)技術(shù)忽刽。

原理：將小室放入培養(yǎng)板中天揖，小室內(nèi)稱(chēng)為上室，培養(yǎng)板內(nèi)稱(chēng)為下室跪帝，上下層培養(yǎng)液以聚碳酸酯膜相隔今膊，上室內(nèi)添加上層培養(yǎng)液，下室內(nèi)添加下層培養(yǎng)液伞剑。將細(xì)胞種在上室內(nèi)斑唬，由于膜有通透性，下層培養(yǎng)液中的成分可以影響到上室內(nèi)的細(xì)胞黎泣，從而可以研究下層培養(yǎng)液中的成分對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)恕刘、運(yùn)動(dòng)等的影響[9]。

圖 4. Transwell 遷移檢測(cè)的示意圖[9]抒倚。?

實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備：Transwell 小室?(通常為 8 μm 的孔徑)褐着、細(xì)胞、培養(yǎng)基托呕、化學(xué)趨化因子含蓉、PBS洋访、甲醇或 4% 多聚甲醛、染色試劑?(如結(jié)晶紫谴餐、DAPI 或吉姆薩染色)、移液器和槍頭呆抑、顯微鏡岂嗓。

實(shí)驗(yàn)步驟

(1)?細(xì)胞培養(yǎng)：將細(xì)胞以適宜濃度接種于 Transwell 的上室中培養(yǎng)，直到細(xì)胞生長(zhǎng)到 70%-80% 匯合鹊碍。

(2)?準(zhǔn)備下室：在下室中加入合適濃度的化學(xué)趨化因子?(如生長(zhǎng)因子厌殉、細(xì)胞因子)?和培養(yǎng)基，建立化學(xué)梯度侈咕。

(3)?實(shí)驗(yàn)設(shè)置：可以設(shè)置對(duì)照組?(無(wú)趨化因子)?與實(shí)驗(yàn)組?(有趨化因子)?以比較細(xì)胞遷移能力的變化公罕。

(4)?遷移實(shí)驗(yàn)：將 Transwell 小室置于培養(yǎng)箱中，一般孵育 24-48 小時(shí)耀销，具體時(shí)間視細(xì)胞系和實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩ゾ欤源偈辜?xì)胞向下室遷移。

(5)?清洗細(xì)胞：用 PBS 輕輕沖洗 Transwell 上室熊尉，以去除未遷移的細(xì)胞罐柳。沖洗通常進(jìn)行 2-3 次，減少背景噪聲狰住。

(6)?固定細(xì)胞：用甲醇或 4% 多聚甲醛固定細(xì)胞张吉，常見(jiàn)的固定時(shí)間為 10-15 分鐘。固定結(jié)束后催植，用 PBS 沖洗細(xì)胞兩次肮蛹，去除多余的固定液。

(7)?染色細(xì)胞：將染色劑?(如 0.1% 的結(jié)晶紫溶液)?加入 Transwell 的上室染色 20-30 分鐘创南。染色后伦忠，用 PBS 輕輕沖洗 2-3 次，以去除多余的染料扰藕。

(8)?觀察與計(jì)數(shù)：使用顯微鏡觀察 Transwell 膜缓苛，然后拍攝圖像。選擇隨機(jī)區(qū)域計(jì)數(shù)遷移到膜底部的細(xì)胞邓深。根據(jù)各組遷移的細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行比較未桥，統(tǒng)計(jì)并計(jì)算遷移率。

圖 5. 人間充質(zhì)干細(xì)胞通過(guò) Transwell 小室遷移[8]芥备。

注意事項(xiàng)

Transwell 系統(tǒng)：選擇合適的透膜孔徑?(通常 8 或 12 μm)?或膜材料冬耿。

細(xì)胞狀態(tài)：確保細(xì)胞在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，以確泵瓤牵活力高適合遷移亦镶。

操作輕柔：在沖洗和固定細(xì)胞時(shí)日月，操作應(yīng)輕柔，以避免損傷已遷移的細(xì)胞缤骨。時(shí)間選擇：不同細(xì)胞系的遷移能力不同爱咬，因此需根據(jù)具體細(xì)胞的特性調(diào)整實(shí)驗(yàn)時(shí)間。

表 2. 劃痕實(shí)驗(yàn)和 Transwell 遷移實(shí)驗(yàn)的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)绊起。

02細(xì)胞侵襲檢測(cè)

細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)可用于研究細(xì)胞穿透基質(zhì)或組織的能力精拟，細(xì)胞侵襲性、揭示侵襲機(jī)制虱歪、藥物篩選與評(píng)估蜂绎，癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力及細(xì)胞對(duì)環(huán)境變化的反應(yīng)。廣泛應(yīng)用于癌癥笋鄙、創(chuàng)傷修復(fù)师枣、免疫反應(yīng)和再生醫(yī)學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域。

Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)是檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力最常見(jiàn)的方法萧落。

Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)

??三践美、Transwell?侵襲實(shí)驗(yàn)

Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)是一種廣泛用于評(píng)估細(xì)胞?(如腫瘤細(xì)胞)?侵襲能力的體外技術(shù)。

原理：與 Transwell 遷移實(shí)驗(yàn)類(lèi)似铐尚，但不同的是蟆肆，聚碳酸酯膜的上表面需涂布一層類(lèi)似基質(zhì)的材料?(如 Matrigel 或膠原蛋白)?以模擬細(xì)胞外基質(zhì)的環(huán)境斥滤，細(xì)胞會(huì)分泌酶類(lèi)?(如基質(zhì)金屬蛋白酶, MMPs)以降解基質(zhì)膠才能進(jìn)入下室，計(jì)數(shù)進(jìn)入下室的細(xì)胞即可反映細(xì)胞的侵襲能力[10]。該實(shí)驗(yàn)可了解細(xì)胞侵襲的調(diào)控機(jī)制萤悴，為相關(guān)疾病的治療提供依據(jù)拐叉。

圖 6. 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)的示意圖[9]救氯。

實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備：Transwell 小室?(通常 5 或 8 μm 孔徑)坡疼、基質(zhì)膠?(如 Matrigel 或膠原蛋白)、細(xì)胞系灵妨、培養(yǎng)基解阅、化學(xué)趨化因子、PBS泌霍、甲醇或 4% 多聚甲醛货抄、染色試劑?(如結(jié)晶紫、DAPI 或吉姆薩染色)朱转、移液器和槍頭蟹地、顯微鏡。?

實(shí)驗(yàn)步驟

(1) 細(xì)胞培養(yǎng)：將細(xì)胞以適宜濃度接種培養(yǎng)皿中藤为，確保細(xì)胞生長(zhǎng)至 70%-80% 匯合怪与。

(2)?準(zhǔn)備基質(zhì)膠：根據(jù)廠家的說(shuō)明書(shū)，在冰上將所需量的基質(zhì)膠?(Matrigel 或膠原蛋白)?溶解缅疟。在 Transwell 上室底部涂抹必要厚度的基質(zhì)膠?(通常為 50-100 μL)分别。在 4℃ 下孵育約 30 分鐘- 1 小時(shí)遍愿，以確保基質(zhì)膠固化耘斩。

(3)?準(zhǔn)備下室：在 Transwell 下室中加入合適濃度的化學(xué)趨化因子?(如生長(zhǎng)因子沼填、細(xì)胞因子)?和培養(yǎng)基。

(4)?遷移實(shí)驗(yàn)：將細(xì)胞?(通常為 1-2×105?個(gè)細(xì)胞)?懸浮于適宜的培養(yǎng)基中括授，并添加到 Transwell 上室中倾哺。在培養(yǎng)箱中孵育 24-48 小時(shí)，具體時(shí)間視細(xì)胞系和實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩ü舨保?xì)胞則向下室遷移和侵襲。

(5)?清洗細(xì)胞：用 PBS 輕輕沖洗 Transwell 上室忌愚，去除未侵襲的細(xì)胞曲管。沖洗通常進(jìn)行 2-3 次，減少背景噪聲硕糊。

(6)?固定細(xì)胞：用甲醇或 4% 多聚甲醛在 Transwell 上室中固定細(xì)胞院水，固定時(shí)間 10-15 分鐘。固定結(jié)束后简十，用 PBS 沖洗細(xì)胞 2 次檬某，去除多余的固定液。

(7) 染色細(xì)胞：將染色劑?(如 0.1% 結(jié)晶紫溶液)?加入 Transwell 上室染色 20-30 分鐘螟蝙。用 PBS 輕輕沖洗 2-3 次恢恼，去除多余的染料。

(8)?觀察與計(jì)數(shù)：使用顯微鏡觀察 Transwell 膜胰默，拍攝圖像场斑。并選擇隨機(jī)區(qū)域計(jì)數(shù)侵襲到膜底部的細(xì)胞。根據(jù)各組侵襲的細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行比較牵署，統(tǒng)計(jì)并計(jì)算侵襲率漏隐。

圖 7. Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)中 Rac1 siRNA 抑制 SNB19 細(xì)胞通過(guò) Matrigel 的侵襲[11]。?

注意事項(xiàng)

基質(zhì)膠的處理：基質(zhì)膠需在冰上處理奴迅，以保持其生物活性青责；鋪膠時(shí)，盡量垂直小室底部在小室底部中間加入取具，避免產(chǎn)生氣泡脖隶。

細(xì)胞狀態(tài)：確保細(xì)胞在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，以確闭咛睿活力高適合侵襲浩村。

輕柔操作：在沖洗和固定細(xì)胞時(shí)，操作應(yīng)輕柔占哟，避免損傷已侵襲的細(xì)胞心墅。

觀察時(shí)間選擇：不同細(xì)胞系的侵襲能力不同酿矢，根據(jù)具體細(xì)胞的特性和對(duì)實(shí)驗(yàn)的預(yù)期效果調(diào)整實(shí)驗(yàn)時(shí)間。

03

常見(jiàn)問(wèn)題及解答

??為何實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞遷移不足怎燥？

答：可能的原因包括細(xì)胞狀態(tài)不處于健康生長(zhǎng)期瘫筐、培養(yǎng)條件不具有適宜的培養(yǎng)基和生長(zhǎng)因子、基質(zhì)的厚度和成分不適合研究細(xì)胞遷移铐姚、實(shí)驗(yàn)環(huán)境不利于細(xì)胞遷移策肝、孵育時(shí)間不充分等。

??為什么細(xì)胞在 Transwell 實(shí)驗(yàn)中不能通過(guò)基質(zhì)隐绵？

答：可能的原因包括選擇的膜孔徑偏小之众、基質(zhì)膠或 Matrigel 的濃度過(guò)高、產(chǎn)生氣泡依许、缺少促進(jìn)細(xì)胞侵襲的生長(zhǎng)因子或細(xì)胞因子棺禾、細(xì)胞傳代次數(shù)太多失去遷移活性、細(xì)胞系不適合等峭跳。

??實(shí)驗(yàn)過(guò)程中如何減少背景噪聲膘婶？

答：實(shí)驗(yàn)后使用PBS徹底沖洗、使用適當(dāng)濃度的染料并控制染色時(shí)間蛀醉、在固定和沖洗細(xì)胞時(shí)避免損傷細(xì)胞等悬襟。

??如何選擇合適的細(xì)胞系進(jìn)行遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)？

表 3. 不同細(xì)胞系對(duì) Transwell 小室孔徑的選擇拯刁。

???染色后細(xì)胞分布不均一可能原因脊岳？

答：Transwell 小室未平衡放置于孔板中、細(xì)胞懸液未混勻垛玻、小室發(fā)生傾斜或晃動(dòng)逸绎、小室的滲透膜不平等。

??Transwell 小室接種細(xì)胞的加液順序是什么夭谤？

答：先將完全培養(yǎng)基加入培養(yǎng)皿或孔板中?(下室)棺牧，再輕輕將小室放入下室中。在放入時(shí)朗儒，建議將小室稍稍?xún)A斜颊乘，一側(cè)先接觸液面，避免垂直放入產(chǎn)生氣泡醉锄。之后將混合均勻的細(xì)胞懸液加入小室內(nèi)部乏悄。

產(chǎn)品推薦

Basement Membrane Matrix (HY-K6002)(詳情：https://www.medchemexpress.cn/inhibitor-kit/meltrex-standard-basement-membrane-matrix-phenol-red-free.html）

基底膜基質(zhì)膠 (無(wú)酚紅)

Basement Membrane Matrix (Phenol Red) (HY-K6001)（詳情：https://www.medchemexpress.cn/inhibitor-kit/meltrex-standard-basement-membrane-matrix-phenol-red.html）

基底膜基質(zhì)膠 (含酚紅)

Crystal Violet?(HY-B0324A)（詳情：https://www.medchemexpress.cn/crystal-violet.html）

堿性染料，可以將細(xì)胞核中的 DNA 染為深紫色

Giemsa stain (HY-D0944)（詳情：https://www.medchemexpress.cn/giemsa-stain.html）

可染色染色質(zhì)和核膜

DAPI dihydrochloride (HY-D0814)（詳情：https://www.medchemexpress.cn/DAPI_dihydrochloride.html）

一種 DAPI 染料

?參考文獻(xiàn)：

[1] Vicente-Manzanares M, et al. Cell migration: an overview. Methods Mol Biol. 2011;769:1-24.?

[2] Sahai E. Mechanisms of cancer cell invasion. Curr Opin Genet Dev. 2005 Feb;15(1):87-96.?

[3] Ananthakrishnan R, et al. The forces behind cell movement. Int J Biol Sci. 2007 Jun 1;3(5):303-17.?

[4] Bozzuto G, et al. Molecular aspects of tumor cell migration and invasion. Ann Ist Super Sanita. 2010;46(1):66-80.

[5] Liang CC, et al. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nat Protoc. 2007;2(2):329-33.

[6] Hulkower KI, et al. Cell migration and invasion assays as tools for drug discovery. Pharmaceutics. 2011 Mar 11;3(1):107-24.?

[7] Pijuan J, et al. In vitro Cell Migration, Invasion, and Adhesion Assays: From Cell Imaging to Data Analysis. Front Cell Dev Biol. 2019 Jun 14;7:107.

[8] Rüster B,et al. Induction and detection of human mesenchymal stem cell migration in the 48-well reusable transwell assay. Stem Cells Dev. 2005 Apr;14(2):231-5.?

[9] Justus CR, et al. Transwell In Vitro Cell Migration and Invasion Assays. Methods Mol Biol. 2023;2644:349-359.

[10] Shaw L M. Tumor cell invasion assays[J]. Cell migration: developmental methods and protocols, 2005: 97-105.

[11] Valster A, et al. Cell migration and invasion assays. Methods. 2005 Oct;37(2):208-15.