上個(gè)月 (22.7.5) 發(fā)在Journal of Hepatology (IF: 30.083) 上的文章势誊。

背景：膽道閉鎖是引起嬰幼兒肝衰竭的常見(jiàn)疾病跟啤，病死率高烫饼。近年來(lái)，許多研究在膽道閉鎖發(fā)病機(jī)制已經(jīng)取得突破胰挑，但主要集中在適應(yīng)性免疫及病程中晚期蔓罚，對(duì)于病程早期引起膽管損傷的天然免疫細(xì)胞類(lèi)型椿肩、作用方式及調(diào)控機(jī)制仍不清楚，且臨床目前尚無(wú)治療膽道閉鎖的有效藥物豺谈。在此前的研究中郑象，作者報(bào)道了中性粒細(xì)胞在膽道閉鎖biliary atresia (BA)中可能起到病理?yè)p傷作用，因此在這篇文章中作者想要去探究CD177⁺中性粒細(xì)胞如何參與在BA的發(fā)生發(fā)展茬末。

分化抗原簇 177 抗原（CD177厂榛，也稱(chēng)為人中性粒細(xì)胞同種異體抗原 2a 和 NB1），是一種糖基化磷脂酰肌醇 (GPI) 偶聯(lián) N-糖基化跨膜蛋白团南，主要在中性粒細(xì)胞表面表達(dá)噪沙。CD177 表達(dá)可由粒細(xì)胞集落刺激因子引起炼彪，并可在妊娠期間或細(xì)菌感染期間被誘發(fā)吐根。CD177 通過(guò)與 CD31/PECAM-1 和整合素 β2 在內(nèi)皮細(xì)胞上的相互作用介導(dǎo)中性粒細(xì)胞的黏附性和跨內(nèi)皮遷移。CD177 還促進(jìn)蛋白酶 3 (PR3) 在細(xì)胞表面的表達(dá)辐马，可在中性粒細(xì)胞血細(xì)胞滲出期間起到增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞的連接完整性拷橘，從而增強(qiáng)血管的完整性的作用。與 CD11b/ITGAM喜爷、整合素 β2 和 PR3 結(jié)合冗疮，CD177 促進(jìn)了 TNF-α 誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞的激活，包括脫粒和超氧化物產(chǎn)生檩帐。CD177是一種多態(tài)性基因术幔，與多種重要臨床疾病相關(guān)，包括真性紅細(xì)胞增多癥湃密、Wegener 肉芽腫和免疫介導(dǎo)的新生兒中性粒細(xì)胞減少癥诅挑。

1. Gr-1⁺ cells are sufficient to induce bile duct obstruction in RRV-inoculated neonatal NOD/SCID mice

在作者之前的一項(xiàng)研究中，他們證明了 Gr-1⁺ 細(xì)胞的缺失阻止了 BALB/c BA 小鼠模型中 BA 的發(fā)生泛源。
Fig 1A, B： 為了探究Gr-1⁺ 細(xì)胞的功能是否依賴(lài)于適應(yīng)性免疫拔妥，作者給 NOD/SCID 小鼠 (T B細(xì)胞缺陷鼠)腹腔注射了恒河猴輪狀病毒(RRV)。結(jié)果顯示49.2% (30/61) 的 NOD/SCID 鼠和 100% (50/50) 的 BALB/c 鼠出現(xiàn)了BA. 小鼠出現(xiàn)明顯的黃疸和體重減輕达箍。膽管造影術(shù)顯示肝外膽道閉鎖没龙。

BALB/c 鼠注射RRV病毒是膽道閉鎖的經(jīng)典模型
NOD/SCID 小鼠注射RRV病毒是作者自己建的模型，說(shuō)明了先天免疫在BA形成過(guò)程中也起了重要作用缎玫。

Fig 1C：流式結(jié)果顯示在兩種模型中硬纤，Gr-1⁺中性粒細(xì)胞和control相比，都升高了近三倍（兩個(gè)模型的巨噬細(xì)胞在造模后出現(xiàn)下降赃磨，NK細(xì)胞輕度增加筝家。BALB/c 模型鼠還出現(xiàn)了TB細(xì)胞的增多）。提示Gr-1⁺中性粒細(xì)胞可能是應(yīng)對(duì)病毒感染和介導(dǎo)膽道損傷的主要免疫細(xì)胞群煞躬。
Fig 1D-E：隨后作者分離了給予病毒5d的BALB/c 模型BA小鼠和對(duì)照小鼠的Gr-1⁺中性粒細(xì)胞肛鹏，進(jìn)行了單細(xì)胞測(cè)序逸邦。得到的細(xì)胞分為了兩個(gè)群（K2-C1和K2-C2），K2-C1群的數(shù)量是K2-C2數(shù)量的3.2倍在扰。E圖顯示70.9%的Gr-1⁺細(xì)胞表達(dá)CD177缕减，而表達(dá)CD177的K2-C1占到了90.4%。提示CD177⁺細(xì)胞可能是Gr-1⁺細(xì)胞中的一個(gè)功能性亞群芒珠，而且是K2-C1的marker桥狡。F圖顯示組間比對(duì)的話，CD177⁺細(xì)胞占到對(duì)照組Gr-1⁺細(xì)胞的74.5%皱卓，造模后輕度下降到66.7%.
Fig 1G：小鼠造模后中性粒細(xì)胞出現(xiàn)很多干擾素相關(guān)基因的表達(dá)裹芝。
Fig 1H：功能富集也主要富集到干擾素反應(yīng)和抗原呈遞等通路。
Fig 1I：中性粒細(xì)胞脫顆粒相關(guān)基因也出現(xiàn)表達(dá)增加娜汁，可能參與膽道閉鎖的形成嫂易。

2. Accumulation of CD177⁺ cells in patients with BA and a BA mouse model

Fig 2A, B：作者通過(guò)流式檢測(cè)了正常對(duì)照、肝內(nèi)膽汁淤結(jié)(IHC)和BA患者外周血和活檢肝臟組織中CD177⁺細(xì)胞掐禁，發(fā)現(xiàn)BA患者外周血和肝臟CD177⁺細(xì)胞都顯著升高怜械。
Fig 2C：免疫組化結(jié)果提示，BA患者肝臟中增多的CD177⁺細(xì)胞主要位于portal areas傅事。
Fig 2D, E：BA小鼠d3, 6, 9, 12肝臟中脾臟中的CD177⁺細(xì)胞都增高（雖然沒(méi)有時(shí)間依賴(lài)性）
Fig 2F：免疫組化結(jié)果提示BA小鼠肝臟中的CD177⁺細(xì)胞主要位于periductal area缕允。
Fig 2G：在NOD/SCID小鼠模型中，只有出現(xiàn)了黃疸的小鼠出現(xiàn)了CD177⁺細(xì)胞的增加蹭越。

3. Cd177 knockout alleviates the symptoms of RRV-induced BA in mice

為了進(jìn)一步探究Cd177在BA中的功能障本，作者構(gòu)建了Cd177^-/-小鼠。
Fig 3A-D：所有給予了RRV誘導(dǎo)BA的WT小鼠都出現(xiàn)了黃疸响鹃，而Cd177^-/-小鼠給予RRV后只有25%出現(xiàn)了黃疸驾霜，出現(xiàn)黃疸的時(shí)間也從6天延長(zhǎng)到了9天。小鼠的體重減輕有所改善茴迁，死亡率也顯著下降寄悯。
Fig 3E-H：和WT RRV小鼠相比，Cd177^-/-RRV小鼠d6和d12時(shí)肝臟表面沒(méi)有出現(xiàn)炎癥和壞死灶堕义；膽道造影顯示沒(méi)有閉鎖猜旬；肝內(nèi)膽道周?chē)鷽](méi)有出現(xiàn)明顯炎癥；肝內(nèi)膽道顯示為較正常的管樣結(jié)構(gòu)倦卖。
Fig 3I：和正常對(duì)照相比洒擦，Cd177^-/-RRV小鼠的各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)都較正常。
The results indicate that CD177+ cells play a major role in the pathogenesis of BA in mice.

4. Increased oxidative phosphorylation level in BA CD177⁺ cells isolated from the liver

為了探究BA和IHC患者肝臟CD177⁺的功能怕膛，作者分離了IHC (n = 41)和BA (n = 41)患者肝臟CD177⁺細(xì)胞熟嫩，進(jìn)行了Smart-Seq測(cè)序（不是單細(xì)胞，測(cè)的是bulk褐捻。而且只測(cè)了IHC和BA這兩組掸茅，沒(méi)有正常對(duì)照）
Fig 4A：展示了IHC和BA患者肝臟CD177⁺細(xì)胞的差異基因椅邓。和HC相比，BA患者的CD177⁺細(xì)胞出現(xiàn)了4,654個(gè)上調(diào)基因和2,590個(gè)下調(diào)基因昧狮。但是可以看到景馁，組內(nèi)異質(zhì)性比較大。
Fig 4B：通路富集結(jié)果顯示線粒體和中性粒細(xì)胞相關(guān)通路在BA患者的CD177⁺細(xì)胞中顯著上調(diào)逗鸣。
Fig 4C, D：上述通路中的重要功能性基因如DAP3, HSD17B1, MRPS34, SFN和線粒體特異性基因MT-ND3, MT-ND4, MT-CO1, MT-CYB顯示出顯著上調(diào)合住。
Fig 4E, F：中性粒細(xì)胞功能相關(guān)基因ELANE, FCRR2A, RHOA, VAMP8和氧化磷酸化/氧化應(yīng)激相關(guān)基因CST3, CYBB (NOX2), IDH1和MPO也出現(xiàn)了上調(diào)。
The data presented here suggest a close relationship between enhanced mitochondrial activation and strong CD177+ cell immune function.

5. CD177⁺ cells of patients with BA promote BEC apoptosis via NETs

Fig 5A：為了探究是否BA患者的CD177⁺細(xì)胞可以引起膽道上皮細(xì)胞BEC的損傷撒璧，作者從患者外周血分離了CD177⁺細(xì)胞透葛。
Fig 5B：Giemsa染色顯示BA組的CD177⁺細(xì)胞缺乏分葉核并展示出增加的胞外細(xì)胞質(zhì)的擴(kuò)張。
Fig 5C, D：將con和BA患者的CD177⁺與膽道上皮細(xì)胞BEC共培養(yǎng)卿樱，結(jié)果顯示和BA患者的CD177⁺共培養(yǎng)的BEC出現(xiàn)了死亡的增加僚害。
Fig 5E：而且BA患者的CD177⁺誘導(dǎo)的BEC死亡主要是晚期凋亡而不是早期凋亡。
Fig 5F：隨后作者檢測(cè)了CD177細(xì)胞形成NETs的能力殿如。不管是否加入PMA（phorbol myristate acetateNETs贡珊，NET activator）之后最爬，BA組CD177細(xì)胞都可以生成NET filaments涉馁，而con組不管是否加入PMA都沒(méi)有NET filaments形成。
Fig 5G-I：BA組培養(yǎng)細(xì)胞上清中的dsDNA, NE 和MPO也顯著更高爱致。
Fig 5J, K：作者使用了四種NETs抑制劑：NE inhibitor (sivelestat), PAD4 inhibitor (GSK484), ROS scavenger (N-acetylcysteine, NAC) 和DNase I來(lái)培養(yǎng)CD177細(xì)胞烤送，并收取上清，用于條件培養(yǎng)基來(lái)培養(yǎng)BEC糠悯。結(jié)果顯示BA CM培養(yǎng)的BEC和正常相比形態(tài)和細(xì)胞增殖都受損帮坚，細(xì)胞數(shù)量顯著減少。給予不同Nets抑制劑后則都出現(xiàn)明顯改善互艾；PMA刺激組也得到了類(lèi)似的效應(yīng) (Fig. S10A,B)试和。
Fig 5L：BA CM培養(yǎng)的BEC和正常相比出現(xiàn)了明顯的死亡增加，給予不同Nets抑制劑后也同樣都出現(xiàn)明顯改善纫普。
The results indicated that, in the context of BA, CD177+ cells could induce BEC apoptosis by releasing NETs.

6. Safety and efficacy of NAC in the treatment of BA

最后阅悍，作者想要去探究NETs抑制劑N-ace- tylcysteine (NAC)在BA患者中是否可以影響CD177細(xì)胞的數(shù)目和NETs形成。6例BA患者在Kasai procedure前接受了1周的NAC靜脈注射（10例對(duì)照）昨稼。接受治療后患者的general condition沒(méi)有出現(xiàn)相關(guān)改變节视。
Fig 6A：作者分離了患者外周血，發(fā)現(xiàn)接受了NAC治療的患者外周血CD177細(xì)胞出現(xiàn)明顯下降假栓。
Fig 6B：治療后的胞內(nèi)ROS水平也出現(xiàn)明顯下降寻行。
Fig 6C-E：線粒體活性、數(shù)量和NETs的形成在治療后都出現(xiàn)下降匾荆。
Fig 6F：4例患者在Kasai術(shù)后額外給予了一周的NAC拌蜘，結(jié)果提示治療組總膽酸和直接膽紅素和未治療組 (n=56) 相比出現(xiàn)顯著下降杆烁。

為了更好地理解潛在的信號(hào)通路，作者分離了BA (n=4) 和BA+NAC (n=6) 患者外周血的CD177細(xì)胞简卧，進(jìn)行了RNAseq连躏。
Fig 6G：和未治療組相比，治療組的CD177細(xì)胞出現(xiàn)了4個(gè)上調(diào)和41個(gè)下調(diào)基因（好少哦）
Fig 6H：下調(diào)通路的Metascape分析顯示主要富集到了中性粒細(xì)胞脫顆粒贞滨、MAPK信號(hào)通路的調(diào)節(jié)和白細(xì)胞遷移等通路入热。
Fig 6I：治療后下調(diào)的基因包括了CEACAM1 和S100A12 (參與多種通路)、STOM 和 HK3 (參與中性粒細(xì)胞脫顆粒)晓铆、GADD45A (參與MAPK信號(hào)通路)勺良。有趣的是，NAC治療下調(diào)了CD177的表達(dá)并增加了RASA4基因的表達(dá)骄噪。
These data suggest that NAC can reduce the number and expression of CD177⁺ cells, probably through inhibition of neutrophil degranulation, suppress the formation of NETs and ameliorate the pathological conditions of BA.

這篇文章機(jī)制做的不深尚困，但是思路很清晰，臨床意義非常大链蕊。
1. 小鼠肝臟Gr-1⁺中性粒細(xì)胞的單細(xì)胞測(cè)序發(fā)現(xiàn)引起B(yǎng)A主要是CD177⁺中性粒（適應(yīng)性免疫缺陷鼠也是一樣）
2. CD177⁺中性粒在BA患者外周血和肝臟事甜，小鼠肝脾中都出現(xiàn)明顯增加。
3. Cd177敲除減輕了RRV誘導(dǎo)的BA
4. BA患者外周血CD177⁺中性粒的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序探究了一下機(jī)制滔韵，發(fā)現(xiàn)氧化磷酸化增加逻谦。
5. 和BEC的共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)CD177⁺中性粒可以介導(dǎo)BEC損傷陪蜻，而且這種作用主要由NETs介導(dǎo)(給抑制劑后損傷減輕)邦马。
6. NETs抑制劑的臨床使用，顯示有效宴卖。