嵌合抗原受體（CAR）修飾的T細(xì)胞在治療癌癥方面效果顯著压鉴，但制造過程復(fù)雜。受體靶向慢病毒載體（LV）選擇性地將基因遞送到T細(xì)胞亞型可能促進(jìn)和改善CAR-T細(xì)胞的產(chǎn)生牛柒，但到目前為止，傳統(tǒng)LV（水泡性口炎病毒VSV-LV）的基因遞送率低。為了改善遞送效率低的問題侧但，該文章用轉(zhuǎn)導(dǎo)增強(qiáng)劑Vectofusin-1顯著增強(qiáng)CD4和CD8 LV的基因遞送，而不會(huì)損失靶細(xì)胞選擇性和所產(chǎn)生的CAR T細(xì)胞的殺傷能力航罗。
轉(zhuǎn)導(dǎo)增強(qiáng)劑通過促進(jìn)載體和細(xì)胞的有效共定位來促進(jìn)載體細(xì)胞進(jìn)入禀横。轉(zhuǎn)導(dǎo)增強(qiáng)劑可以是陽離子聚合物、脂質(zhì)或肽（如聚布倫粥血、硫酸魚精蛋白）柏锄，甚至是小分子。Vectofusin-1复亏，一種富含組氨酸的陽離子兩親性短肽趾娃，可促進(jìn)人CD34造血干細(xì)胞與各種假型LV的轉(zhuǎn)導(dǎo)。對于人T和B細(xì)胞缔御，使用Vectofusin-1增強(qiáng)了用長臂猿白血病病毒（GALV）包膜蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)抬闷，作者研究了Vectofusin-1對CD4-LV和CD8-LV以及VSV-LV和用BaEV糖蛋白（BaEV-LV）假型的LV轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的影響，轉(zhuǎn)導(dǎo)第二代CD19-CAR到人類T細(xì)胞耕突。截短的低親和力神經(jīng)生長因子受體（DLNGFR）作為報(bào)告基因笤成。
1. Vectofusin-1提高CAR基因CD4和CD8靶向LV的轉(zhuǎn)導(dǎo)率
靶向CD4-LV和CD8-LV載體設(shè)計(jì)方案，編碼第二代CD19特異性CAR通過P2A切割位點(diǎn)連接的報(bào)告蛋白DLNGFR（圖1A）眷茁。作者用CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞做了CD4-LV疹启、CD8-LV、VSV-LV蔼卡、BaEV-LV的轉(zhuǎn)導(dǎo)增強(qiáng)劑Vectofusin-1的對比實(shí)驗(yàn)（圖1B）喊崖。用流式檢測挣磨，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明（1）Vectofusin-1提高了CD4-LV的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率且特異性好。（2）Vectofusin-1提高了CD8-LV的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率且特異性好荤懂。（3）Vectofusin-1降低VSV-LV的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率茁裙。（4）BaEV-LV自身轉(zhuǎn)導(dǎo)效率最高，加入Vectofusin-1后其效率更高（圖1B）节仿。為了研究觀察到的Vectofusin-1 效果是否獨(dú)立于所使用的供體晤锥、PBMC激活條件或特定載體批次，在兩種不同的PBMC刺激方案下廊宪，使用不同的供體并使用兩到五個(gè)載體進(jìn)行多次轉(zhuǎn)導(dǎo)（圖1C）矾瘾。用流式細(xì)胞術(shù)檢測，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Vectofusin-1顯著改善了CD4-LV箭启、CD8-LV和BaEV-LV的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率壕翩，對VSV-LV有損耗，對載體特異性無影響傅寡，BaEV-LV的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率最高（圖1C）放妈。
2.Vectofusin-1不影響CAR-T細(xì)胞的殺傷能力
作者分析了Vectofusin-1是否影響CAR-T細(xì)胞在殺傷CD19陽性腫瘤細(xì)胞方面的功能。用CD8-LV轉(zhuǎn)導(dǎo)的CAR-T細(xì)胞與羧基熒光素琥珀酰亞胺酯（CFSE）標(biāo)記的CD19陽性Nalm-6細(xì)胞按不同比例孵育荐操，做Vectofusin-1的對比實(shí)驗(yàn)芜抒。通過流式細(xì)胞術(shù)測定靶細(xì)胞裂解。加與不加Vectofusin-1均能夠殺死Nalm-6 腫瘤細(xì)胞托启，并且與未轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細(xì)胞相比宅倒，顯示出顯著更高的殺傷活性。重要的是屯耸，使用或不使用Vectofusin-1轉(zhuǎn)導(dǎo)的CAR-T細(xì)胞在靶細(xì)胞裂解方面沒有觀察到顯著差異唉堪。該結(jié)果表明Vectofusin-1對CAR-T細(xì)胞的細(xì)胞毒性沒有負(fù)面影響（圖2）。
3.DLNGFR在LV顆粒表面并作為蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中
存在與不存在Vectofusin-1肩民，在受體陽性和陰性細(xì)胞上都檢測到DLNGFR的信號(hào)（圖3A）。CD4-LV链方、CD8-LV持痰、VSV-LV使用轉(zhuǎn)導(dǎo)增強(qiáng)劑Vectofusin-1轉(zhuǎn)導(dǎo)CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞，檢測DLNGFR信號(hào)祟蚀。Vectofusin-1使CD4-LV的非靶細(xì)胞的DLNGFR信號(hào)顯著增加工窍，而靶細(xì)胞本身DLNGFR信號(hào)可達(dá)77%。CD8-LV也觀察到了類似的結(jié)果前酿。對于VSV-LV患雏，Vectofusin-1使CD4或CD8非靶細(xì)胞DLNGFR信號(hào)達(dá)到所有LV假分型靶細(xì)胞的水平。而靶細(xì)胞本身的DLNGFR信號(hào)很高（圖3A）罢维。
DLNGFR陽性細(xì)胞的百分比在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)都相似淹仑，Vectofosin-1使其總體百分比較高，檢測到的DLNGFR陽性T細(xì)胞信號(hào)強(qiáng)，并隨時(shí)間略有升高匀借，與CD4和CD8靶細(xì)胞的結(jié)合效率是相當(dāng)颜阐。沒有Vectofosin-1的情況下，同樣能觀察到以上結(jié)果吓肋，只是效果不好凳怨，并且只與靶細(xì)胞結(jié)合（圖3B）。
為了確定DLNGFR是否結(jié)合到載體顆粒中是鬼，進(jìn)行了DLNGFR特異性ELISA肤舞。為了定量DLNGFR，使用重組DLNGFR蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)均蜜。在編碼CD19-CAR和DLNGFR作為報(bào)告基因的載體顆粒中檢測到DLNGFR分子李剖，在編碼GFP中沒有檢測到。DLNGFR分子總量的計(jì)算顯示每個(gè)顆粒有169至350個(gè)DLNGFR（表1）兆龙。
LV顆粒與非靶細(xì)胞的結(jié)合是否需要LV假分型的包膜蛋白杖爽。為了研究不同包膜成分的作用，用附著蛋白CD4-MV-H和CD8NiV-G紫皇，融合蛋白MV-F和NiV-F及LV用轉(zhuǎn)導(dǎo)增強(qiáng)劑Vectofusin-1轉(zhuǎn)導(dǎo)CD4+Tcell和CD8+Tcell慰安，檢測DLNGFR信號(hào)。結(jié)果顯示聪铺，Vectofusin-1使所有假分型LV的PBMC的顆粒結(jié)合以及DLNGFR檢測都得到了增強(qiáng)化焕，而對CD4或CD8靶細(xì)胞沒有任何偏好（圖4），并且與CD4-LV和CD8-LV的結(jié)合率相當(dāng)（圖3）铃剔。不使用Vectofusin-1的情況下撒桨，LV、MV-F-LV和NiV-F-LV在細(xì)胞結(jié)合中效率非常低键兜，而CD4-H-LV和CD8-G-LV僅限靶細(xì)胞結(jié)合效率高（圖4）凤类。結(jié)果表明，Vectofusin-1介導(dǎo)的顆粒與細(xì)胞的附著獨(dú)立于所用的包膜蛋白普气。
本文提供的數(shù)據(jù)表明谜疤，轉(zhuǎn)導(dǎo)增強(qiáng)劑Vectofusin-1有促進(jìn)基于副粘病毒糖蛋白的受體靶向載體將基因轉(zhuǎn)移到T淋巴細(xì)胞中。CD4-LV和CD8-LV的轉(zhuǎn)導(dǎo)水平與VSV-LV的轉(zhuǎn)導(dǎo)水平相當(dāng)现诀。CD4-LV和CD8-LV的轉(zhuǎn)導(dǎo)對各自的T淋巴細(xì)胞具有高度選擇性夷磕。這種高選擇性以及遞送的CD19-CAR對靶細(xì)胞的殺傷沒有受到Vectofusin-1的損害。與此一致仔沿，它對T細(xì)胞表型坐桩、生存能力和PBMC增殖能力的影響，只是微不足道的封锉。
由于CD4-LV和CD8-LV的顆粒數(shù)與VSV-LV的顆粒數(shù)非常相似绵跷，不使用Vectofusin-1膘螟，它們的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率降低是由于與培養(yǎng)細(xì)胞膜的低效接觸。Vectofusin-1以前被證明可以組裝成與病毒顆粒結(jié)合的納米纖維抖坪，導(dǎo)致其沉淀萍鲸，從而增加細(xì)胞表面的局部濃度。 Vectofusin1的這種作用可能解釋了為什么在向細(xì)胞添加病毒30秒后擦俐，使用轉(zhuǎn)導(dǎo)增強(qiáng)劑觀察到大量與細(xì)胞結(jié)合的載體顆粒脊阴。這種作用與所用的包膜蛋白無關(guān)。
DLNGFR不僅經(jīng)常被用作CAR分子的報(bào)告蛋白蚯瞧，而且還被用作其他治療性轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞跟蹤標(biāo)記嘿期。此外，DLNGFR被用作Vectofusin-1分析載體細(xì)胞附著行為的標(biāo)記埋合，因?yàn)樗粨饺胨挟a(chǎn)生的載體的顆粒表面备徐，包括VSV-LV。成為逆轉(zhuǎn)錄病毒載體顆粒中的胞質(zhì)蛋白甚颂，如GFP蜜猾，也是可能的，并負(fù)責(zé)載體細(xì)胞融合后不久的經(jīng)典蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移振诬，即所謂的假轉(zhuǎn)導(dǎo)蹭睡。通過詳細(xì)的載體細(xì)胞結(jié)合研究和摻入分析，作者發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)導(dǎo)后不久DLNGFR的存在不是由于經(jīng)典蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移赶么。在4℃下將PBMC與載體顆粒共孵育30秒后立即檢測到DLNGFR肩豁，這表明膜融合介導(dǎo)了DLNGFR從包裝細(xì)胞轉(zhuǎn)移到PBMC。相反辫呻，蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移是由細(xì)胞結(jié)合的載體顆粒介導(dǎo)的（圖5）清钥。Vectofusin-1增強(qiáng)了這種作用，它延長了載體顆粒與沒有膜融合的細(xì)胞相關(guān)的時(shí)間放闺，至少在受體陰性細(xì)胞上是這樣祟昭。
目前應(yīng)用于CAR-T產(chǎn)生過程中的T細(xì)胞純化步驟比較局限，而靶向CD8和CD4的LV只遞送目的基因到靶細(xì)胞群怖侦，未來可能有助于改善CAR-T細(xì)胞的產(chǎn)生篡悟，可作為一種有前景的治療方法。淋巴細(xì)胞基因修飾的其他治療應(yīng)用也可能受益于靶向淋巴細(xì)胞亞群的靶向基因遞送础钠。
基恩科生物通過對慢病毒遞送系統(tǒng)工藝的不斷改進(jìn)和優(yōu)化，針對難轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)導(dǎo)效率低的靶細(xì)胞叉谜，推出慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)增強(qiáng)劑旗吁，GC-LVreinfircer，轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高于Polybreen停局，并且細(xì)胞毒性低很钓，對細(xì)胞增殖無影響香府，可解決部分靶細(xì)胞難轉(zhuǎn)導(dǎo)的問題。
