以嵌合抗原受體（CARs）為基礎(chǔ)的T細胞治療已顯示出對血液類癌癥的巨大成功；然而担孔，潛在的致命毒性（如細胞因子釋放綜合征）和高成本是限制CAR-T細胞臨床應用的一些缺點糕篇，有待克服拌消。
自然殺傷（NK）細胞是當前免疫學研究的焦點墩崩，迄今為止侯勉，利用NK細胞治療惡性腫瘤已經(jīng)取得了一定的成功址貌。NK細胞受體生物學的最新進展極大地改變了我們對NK細胞如何識別和殺死腫瘤細胞的理解。CAR-NK細胞由于其獨特的識別機制吹害、強大的細胞毒性作用以及臨床安全性匿值，成為癌癥再靶向治療的強力候選挟憔。此外绊谭，NK細胞降低了同種異體反應的風險达传，可以作為“現(xiàn)貨產(chǎn)品”。雖然目前如火如荼的CAR-NK療法依然面臨著許多挑戰(zhàn)和障礙宗弯，但其巨大的潛力已經(jīng)在腫瘤免疫治療領(lǐng)域展現(xiàn)出廣闊的前景蒙保。
NK細胞生物學
NK細胞是第一個被鑒定的先天性淋巴細胞（ILC）亞型邓厕，能對病毒感染和/或轉(zhuǎn)化的細胞產(chǎn)生多種效應器功能扁瓢，主要是細胞殺傷和產(chǎn)生促炎細胞因子昧互。NK細胞和其他ILC家族成員（ILC1s硅堆、ILC2s和ILC3s）與B細胞和T細胞來源于相同的淋巴祖細胞。NK細胞的細胞毒性活性使它們在功能上與CD8+T細胞最為相似民褂，而ILC1、ILC2和ILC3群體的細胞因子生成模式將這些細胞分別對應CD4+T細胞的TH1面殖、TH2和TH17亞群哭廉。
NK細胞的兩個最典型的亞群是CD56brightCD16-和CD56dimCD16+群體。CD56bright細胞在外周血中的數(shù)量較少（循環(huán)中90%的NK細胞是CD56dim）辽幌，而組織中的NK細胞主要是CD56bright乌企。CD56bright NK細胞是強有力的細胞因子產(chǎn)生者加酵，除非受到促炎性細胞因子如IL-15的刺激猪腕，否則細胞毒性較弱。相比之下钦勘，CD56dim NK細胞群可介導感染細胞和惡性細胞的連續(xù)殺傷陋葡，主要通過包含顆粒酶B和穿孔素的預先組裝的溶細胞顆粒在免疫突觸中的胞吐，最終誘導靶細胞凋亡个盆。
NK細胞的激活和抑制性受體
與B細胞和T細胞不同脖岛，NK細胞不表達體細胞重排的抗原受體，而是激活受體和抑制受體的隨機組合颊亮。通過這些不同受體的刺激信號與抑制信號的平衡產(chǎn)生對靶細胞的反應或耐受柴梆。MHC-I（主要組織相容性復合物Ⅰ類）抗原特異性的抑制性受體可密切調(diào)節(jié)NK細胞介導的細胞毒性和淋巴因子的產(chǎn)生。MHC-I特異性受體的抑制信號對于造血細胞避免NK細胞的破壞至關(guān)重要终惑。這個概念被稱為“丟失自我”绍在，最初是由 Ljunggren和Karre 提出的溜宽。這種MHC-I識別抑制性受體形成了NK細胞表面受體的三個家族炼邀，即KIRs（殺傷細胞免疫球蛋白樣受體）降铸、LIRs（白細胞免疫球蛋白樣受體）和NKG2A（自然殺傷細胞2族A）。
KIRs是免疫球蛋白超家族的成員呻顽，是識別經(jīng)典人類白細胞抗原A卵迂、B和C（HLA-Ia類）的I型跨膜分子哎垦。LIRs又稱ILTs（免疫球蛋白樣轉(zhuǎn)錄物）鸳碧，形成第二組受體，除了HLA Ia類外喊衫，主要識別非經(jīng)典HLA-G（Ib類）分子。LIRs與KIRs屬于同一個Ig超家族亿卤。NKG2A是NKG2族的一個成員，包括A珊肃、B、C忘渔、D乖阵、E钩蚊、F和H砰逻，與CD94二聚形成NKG2A/CD94受體刚操。它屬于受體的C型凝集素家族华蜒，識別非經(jīng)典HLA-EⅠ類分子作為其配體叭喜。
NK細胞的殺傷作用不僅需要通過抑制性受體檢測轉(zhuǎn)化細胞上的MHC-I分子，還需要通過激活性受體激活NK細胞级乍。自然細胞毒性受體（NCR）是一組自然殺傷細胞表面激活性受體，包括NKp46外遇、NKp30和NKp44捐晶。這些受體以及NKG2D和DNAM-1（DNAX輔助分子-1）識別病毒感染或惡性轉(zhuǎn)化細胞表面表達的配體菲语。一些共受體（2B4、NKp80惑灵、NTB-A和CD59）也被表達山上，它們只有與其他激活性受體結(jié)合才能發(fā)揮作用。CD16（或FcγRIII）也是一種激活性受體英支，主要由CD56dim NK細胞亞群表達佩憾，對IgG包被靶細胞的抗體依賴性細胞毒性（ADCC）至關(guān)重要。
CAR-T和CAR-NK
CAR-NK細胞和CAR-T細胞一樣存在胞外干花、跨膜和胞內(nèi)信號傳導域妄帘。NK細胞通過另外兩個共刺激分子，即NKG2D和CD244（2B4）增加其細胞毒性能力和細胞因子的產(chǎn)生池凄。因此抡驼，比CAR-T細胞具有更強的腫瘤特異性靶向性和細胞毒性。CAR-NK細胞療法可能在未來成為CAR-T療法的替代方案肿仑，因為CAR-NK細胞具有以下超越CAR-T的幾個獨特特征致盟。
首先，異基因NK細胞對于過繼性細胞治療（ACT）是相當安全的柏副，因為它們通常不介導發(fā)生GVHD勾邦。此外，NK細胞僅分泌少量IFN-γ和GM-CSF割择，不產(chǎn)生啟動CRS的IL-1和IL-6眷篇。其次，除了通過單鏈抗體識別腫瘤表面抗原來抑制癌細胞外荔泳，NK細胞還可以通過多種受體識別各種配體來抑制癌細胞蕉饼，例如自然細胞毒性受體（NKp46、NKp44和NKp30）玛歌、NKG2D和DNAM-1（CD226）昧港。最后，NK細胞在臨床樣本中非常豐富支子，可以從外周血（PB）创肥、臍帶血（UCB）、人類胚胎干細胞（HESC）、誘導多能干細胞（iPSC）甚至NK-92細胞系中產(chǎn)生叹侄。
CAR-NK細胞療法的臨床研究
CAR-NK療法的研究目前處于起步階段巩搏，臨床研究的數(shù)量逐年增加。此外趾代，在研究的靶標方面贯底，CD19抗原在血液腫瘤中最常見。在實體瘤中進展最為廣泛的CAR-NK療法包括腫瘤相關(guān)抗原HER2撒强、MUC1和PMSA等靶點禽捆。?目前，一些正在進行的臨床試驗正在調(diào)查CAR-NK細胞治療血液學腫瘤和實體瘤的安全性和有效性飘哨，這些試驗在下表列出胚想。
CAR-NK細胞治療的挑戰(zhàn)
低持久性
在缺乏細胞因子支持的情況下，輸注細胞缺乏體內(nèi)持久性是過繼NK細胞治療的主要缺點之一芽隆。雖然它可能更安全的顿仇，但它也會限制NK細胞免疫治療的效果。外源性細胞因子已被證明能增加過繼性NK細胞的增殖和耐久性摆马；然而，它們也可能導致不希望的副作用鸿吆，包括抑制性免疫亞群的生長囤采，如Tregs。轉(zhuǎn)移到所需的腫瘤部位快速歸巢到腫瘤床對于過繼性細胞治療效果至關(guān)重要惩淳，并且受NK細胞和腫瘤細胞釋放的趨化因子之間復雜相互作用的控制蕉毯。然而，NK細胞歸巢到腫瘤部位的效率一直存在爭議思犁，因此促使人們不斷努力去進行改進代虾。
一些研究人員已經(jīng)研究了各種工程方法來改善NK細胞歸巢。例如激蹲，用編碼趨化因子受體CCR7的mRNA電穿孔NK細胞棉磨，以增加向表達趨化因子CCL19的淋巴結(jié)的移動。用編碼CXCR2的病毒載體轉(zhuǎn)導的NK細胞對表達同源配體如CXCL1学辱、CXCL2乘瓤、CXCL5、CXCL6和CXCL8的腎細胞癌腫瘤表現(xiàn)出更好的運動性策泣。為了提高實體瘤患者NK細胞免疫治療的成功率衙傀，在小鼠模型中研究了幾種促進NK細胞向腫瘤部位轉(zhuǎn)運的新技術(shù)；然而萨咕，這些方法的有效性還需要在臨床試驗中進行驗證统抬。
免疫抑制腫瘤微環(huán)境
TME包括免疫抑制分子、免疫抑制細胞和妨礙免疫細胞功能的不利環(huán)境，是CAR-NK細胞治療的主要障礙聪建。TGF-β钙畔；腺苷；吲哚胺2,3-雙加氧酶（IDO）和前列腺素E2（PGE2）是TME中發(fā)現(xiàn)的可損害NK細胞活性的免疫抑制細胞因子和代謝物妆偏。Treg細胞刃鳄；調(diào)節(jié)性B細胞；髓源性抑制細胞钱骂；腫瘤相關(guān)巨噬細胞（TAM）叔锐；血小板；成纖維細胞和一些不利的代謝因素见秽，如缺氧愉烙、酸度和營養(yǎng)缺乏，在惡性環(huán)境中會導致免疫抑制解取。
因此步责，研究人員正致力于開發(fā)能夠防止某些免疫抑制作用的CAR-NK細胞。例如禀苦，通過使用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除TGF-βR2基因或者阻斷NK細胞上的高親和力A2A腺苷受體蔓肯。TME導致NK細胞耗竭的另一個重要方法是免疫檢查點分子。為了克服這個問題振乏，基因組編輯被用來消除NK細胞的檢查點成分蔗包，以改善其功能。
慢病毒低轉(zhuǎn)導效率
基于慢病毒的轉(zhuǎn)導系統(tǒng)是細胞內(nèi)基因修飾和傳遞的最常用的方法之一慧邮。然而调限，由于自然特性，NK細胞對慢病毒具有抗性误澳，這使得基于慢病毒的轉(zhuǎn)導成為一個挑戰(zhàn)耻矮。為了改進病毒轉(zhuǎn)導，人們使用了各種化學物質(zhì)忆谓，例如裆装，可以使用魚精蛋白硫酸鹽或葡聚糖去除細胞膜上的電荷。
CAR-NK細胞療法的未來展望
識別靶抗原
CARs設計中最關(guān)鍵的一步是識別高度一致表達的靶腫瘤抗原倡缠。大多數(shù)腫瘤相關(guān)抗原（TAAs）也由一些健康細胞表達米母，因此，不可避免帶來“靶向非腫瘤”的效應毡琉。此外铁瞒，同一腫瘤的單細胞克隆中這些TAA的表達可能存在巨大差異。為了克服這個問題桅滋，人們設計了雙特異性CAR慧耍，可以同時靶向多個抗原身辨。
這可以通過多種方式實現(xiàn)，例如芍碧，可以同時注射針對不同抗原的不同CAR-NK細胞煌珊；或者設計一種能夠識別多種抗原的CAR，這一目標可以通過“串聯(lián)CAR”實現(xiàn)泌豆，其中兩個結(jié)合點連接到單個分子上定庵，以提高免疫突觸的效率。此外踪危，通過使用一個稱為“雙順反子CAR”的載體可以在同一免疫細胞上產(chǎn)生多個CAR蔬浙。
提高NK細胞活性
幾個免疫檢查點調(diào)節(jié)和抑制NK細胞活性。這些免疫檢查點起到了“天然剎車”的作用贞远，以防止自身免疫疾病或過度激活引起的免疫病理狀況畴博。這些檢查點的基因缺失或阻斷可以幫助CAR-NK細胞保持過度活躍，更快地擺脫癌癥和轉(zhuǎn)移蓝仲。
例如俱病，一種新的NK-92細胞系被設計成靶向PD-L1、ER保留的IL-2和高親和力CD16的CAR袱结，稱為PD-L1靶向haNK（t-haNK）亮隙。令人興奮的臨床前數(shù)據(jù)表明，這些細胞在體外對15種腫瘤細胞株具有特異的抗腫瘤作用垢夹，在體內(nèi)對三陰性乳腺癌咱揍、膀胱腫瘤和肺癌具有很強的抗腫瘤作用。
另一個提高CAR-NK細胞活性的重要策略是腫瘤代謝的調(diào)節(jié)棚饵，但這一策略尚未得到應有的重視。在缺氧條件下掩完，腺苷是通過CD39和CD73代謝ATP產(chǎn)生的噪漾，它們參與免疫逃避，阻止NK細胞運輸?shù)侥[瘤部位且蓬，并阻止NK細胞成熟欣硼。NKG2D工程化的CAR-NK細胞在抗CD73抗體抑制后顯示出治療肺癌的良好效果。
克服免疫抑制微環(huán)境
腫瘤具有多種免疫抑制因子恶阴，如TGF-β诈胜、IL-10、PD-1或精氨酸酶冯事。有幾種方法可以降低TGF-β的抑制作用焦匈。例如，TGF-β激酶抑制劑和NK細胞的組合被發(fā)現(xiàn)可以恢復NK細胞的細胞毒性昵仅，并且保留NKG2D和CD16的表達缓熟。此外累魔，使用帶有細胞外TGF-β受體結(jié)構(gòu)域的混合型CARs已被發(fā)現(xiàn)在提高NK-92細胞的抗腫瘤潛能方面相當成功。通過敲除實體瘤中的SMAD3够滑，NK細胞的細胞毒性活性已得到增強垦写。
提高安全性
提高基于CAR-NK細胞治療安全性的重要方法可能包括通過加入自殺基因或開發(fā)雙特異性CAR分子來修飾CAR結(jié)構(gòu)，以更好地靶向腫瘤特異性抗原彰触。
CAR-NK細胞可以以CAR依賴和CAR非依賴的方式同樣靶向腫瘤梯投；因此，NK細胞的這一特性可以被用來發(fā)揮增強的腫瘤殺傷作用和開發(fā)非信號CAR况毅。這些非信號CAR缺乏直接殺傷信號分蓖，但通過促進NK細胞在靶細胞上的駐留和粘附，可以增強NK細胞的特異性殺傷俭茧。另一個有趣的策略是設計能夠調(diào)節(jié)TME的CAR-NK咆疗，這種CAR-NK被命名為“裝甲”CAR-NK細胞。這些非常特殊的CAR-NK細胞表達幾種外源基因母债，可以調(diào)節(jié)局部TME以防止任何有害影響午磁。
提高可及性
為了克服實體瘤中CAR-NK細胞的可及性，可以使用幾種方法毡们，包括局部給藥迅皇、腹腔給藥和聚焦超聲引導給藥。例如衙熔，在模擬人類胸膜惡性腫瘤的原位模型中發(fā)現(xiàn)胸膜注射非常有效登颓，其功能持續(xù)時間甚至比靜脈注射獲得的時間更長。局部給予CAR免疫細胞也可能有助于減少治療劑量红氯。
總的來說框咙，NK細胞免疫生物學領(lǐng)域的進展和進步為更好和更新穎的免疫療法奠定了基礎(chǔ)，NK細胞優(yōu)秀的抗腫瘤作用使其成為細胞免疫治療的焦點痢甘。CAR-NK細胞療法是一個很有前途的臨床研究領(lǐng)域喇嘱，與CAR-T細胞相比，CAR-NK細胞具有自己獨特的優(yōu)點塞栅，但仍面臨著一些挑戰(zhàn)者铜。這些挑戰(zhàn)包括細胞的持久性，克服免疫抑制微環(huán)境放椰，以及轉(zhuǎn)導效率等作烟。相信解決好這些問題，基于NK細胞優(yōu)秀的抗腫瘤血統(tǒng)砾医，極有可能在CAR修飾的武裝下為腫瘤治療帶來新的突破拿撩。
參考資料：
小藥說藥
CAR-NK Cells: From Natural Basis to Design for Kill. Front Immunol.?2021; 12: 707542.
