?????眾所周知，DNA序列就是有TCGA四種堿基按照一定的排列順序排列而成穷劈，但是如何才能將每一個位置上的堿基識別出來卻是一個很難解決的問題羡洁，正是因為這要的需求死姚，測序技術也在科學家們的不斷努力下開始慢慢的發(fā)展了起來。今天我們就來介紹一下測序技術發(fā)展的前世今生笋颤。
第一代測序技術：
????第一代測序技術通常是指桑格（Sanger）和考爾森(Coulson)開創(chuàng)的鏈終止法或者是馬克西姆（Maxam）和吉爾伯特（Gilbert）發(fā)明的化學法（鏈解法）。今天這里重點講一下桑格測序法赋除，因為其他測序方法的核心也是利用了桑格測序中中斷DNA合成反應的原理阱缓。
????桑格測序法的核心原理是利用ddNTP（雙脫氧核苷酸）代替dNTP（脫氧核苷酸），ddNTP由于3’位沒有羥基举农，就會導致沒有辦法結合下一個核苷酸荆针，從而使反應終止。這樣就可以得到不同長短的序列片段颁糟，每個片段的末端都是一個ddNTP航背。
在此基礎之上，給每一個雙脫氧核苷酸加上熒光發(fā)光基團滚停，并且每一種堿基的發(fā)光基團的顏色不同沃粗，然后通過顏色來識別不同的位置堿基序是哪一個。
這里需要說明一下的就是在合成DNA的過程中除了加入ddNTP和其他一些必要的酶之外键畴，還需要加入能使DNA進行正常合成的dNTP最盅，這樣才能使DNA正常合成不同長短的DNA片段，然后再在這些片段的基礎上隨機結合ddNTP起惕，最后通過測定ddNTP的熒光信號來測定某個位置是哪一個具體堿基涡贱。如果只加入ddNTP的話，反應則永遠終止在第一步惹想，則只能測定第一個位置是哪一個具體的堿基问词。
更加詳細的內(nèi)容很難用文字來表述，推薦兩個視頻給大家：
桑格測序法基本原理：https://www.bilibili.com/video/av44735204?from=search&seid=15245763323065606962
陳巍學老師的第一代測序技術的原理：https://www.bilibili.com/video/av3174601?from=search&seid=9488703116600135042
第二代測序技術：
????二代測序技術有很多嘀粱，但是很多現(xiàn)在都已經(jīng)不用了激挪，這里我們就講解一下二代測序的巨頭——Illunima測序（占市場99%）。其原理是基于可逆終止的熒光標記dNTP來做邊合成邊測序工作锋叨，簡單地說就是將打斷的DNA片段利用橋式PCR擴增之后再利用熒光信號來進行辨別垄分，這里需要注意的有幾個點：第一，在flowcell中的每個簇對應一個片段娃磺，每個槽中都有很多個簇薄湿，之所以這樣做是為了后面在橋式PCR之后熒光信號被增強，方便測量偷卧，也提高準確度豺瘤。第二，由于堿基被進行了特殊的修飾听诸，所以每次合成只能添加一個堿基坐求，每進行一次合成就會放到測序的機器上進行一次熒光信號檢測，記錄熒光信號晌梨，推出堿基瞻赶。第三赛糟，測序完成之后派任，一輪測序完成后砸逊，會對已經(jīng)添加到序列上的堿基進行處理，也就是讓它變回原來正常的樣子掌逛，用以進行下一步的合成师逸，然后重復合成測序修飾合成測序修飾。
相比于第一代測序技術，第二代測序技術的有點就是高通量皿伺，一次可以測很多序列员辩，而且準確性也不低，缺點就是測序的長度一般在200-500bp鸵鸥。
同樣的給大家推薦兩個視頻奠滑，幫助大家理解：
Illunima測序原理：https://www.bilibili.com/video/av37902855/?spm_id_from=333.788.videocard.2
陳巍學老師的Illunima測序化學原理（不是原版，但是有字幕）：https://www.bilibili.com/video/av23072634/?spm_id_from=333.788.videocard.2
第三代測序技術：
????第三代測序技術是一種單分子測序技術妒穴，在測序過程中不需要進行PCR宋税，實現(xiàn)了對一條DNA分子的單獨測序，相比二代測序技術讼油，由于只測定一個分子的杰赛，這樣就減少了二代測序不同片段合成不同步的噪音，同時還可以測定出堿基的甲基化以及突變的情況矮台，三代測序的原理主要有兩種乏屯，一種是單分子熒光測序，一種是納米孔測序瘦赫，這里主要講一下PacＢｉｏ測序技術原理：這種測序方法主要是在一個測序板上的測序小孔中固定一個聚合酶辰晕，然后當這個聚合酶每結合一個帶熒光的堿基（熒光基團結合在焦磷酸基團上）時就會保持這種結合模式一段時間，小孔中有激發(fā)光不斷打入耸彪，這個堿基就會發(fā)出熒光伞芹，儀器根據(jù)顏色判斷是哪一種堿基，一段時間后蝉娜，焦磷酸基團會掉落唱较，因此熒光基團也會隨焦磷酸基團掉落，不影響下一輪的測定召川，然后結合照射測定掉落結合照射測定掉落反復進行南缓，直至全部測定完成。
相比二代測序技術纸镊，三代測序技術所需的時間更短，測定的長度最長可到３萬個堿基概疆，同時還可以測出堿基基團的甲基化和突變情況逗威，越來越受到人們關注。 同樣的兩個視頻推薦給大家方便理解岔冀，我也是在看了很多視頻之后才懂了這一丁半點凯旭。由于沒有找到很好的ＰａｃＢｉｏ測序技術的視頻，所以這里只能給大家放一個陳巍學老師的對于該技術的原理的講解視頻：https://www.bilibili.com/video/av79281575?from=search&seid=10411536782770729419
????每一代測序技術都有很多種使套，但是由于個人能力和時間關系罐呼，沒有辦法把每一種都展示出來，如果大家有對哪一種測序方法感興趣侦高，可以私信我嫉柴，我本身就是生信專業(yè)，所以了解每一種測序方法是職責之內(nèi)的事也是對自己的一種鍛煉奉呛，我會盡量去了解透之后為大家展示出來计螺，感謝指點。
? ? 如果文章有什么不對的地方請大家多多批評侧馅，下期文章我想主要講解拿到序列之后該怎么解讀危尿，怎么分析，請大家多多關注馁痴。
