Immunoreactivity against fibroblast growth factor 8 in alveolar rhabdomyosarcoma patients and its involvement in tumor aggressiveness
肺泡橫紋肌肉瘤患者對成纖維細胞生長因子8的免疫反應(yīng)性及其對腫瘤侵襲性的影響
發(fā)表期刊：Oncoimmunology
發(fā)表日期：2022 Jul 6
影響因子：7.723
DOI:? 10.1080/2162402X.2022.2096349
一、背景
????????橫紋肌肉瘤 （RMS） 是一種侵襲性小兒軟組織肉瘤艰匙，其特征是一線治療后復(fù)發(fā)時預(yù)后非常差限煞。因此，患者管理的一個主要挑戰(zhàn)仍然是識別與難治性和進行性疾病相關(guān)的標(biāo)志物员凝。在這種情況下署驻，癌癥自身抗體是疾病發(fā)作和進展的自然標(biāo)志物，可用于揭示新的治療靶點健霹。
????????FGF8最初被描述為一種雄性激素誘導(dǎo)的生長因子旺上，來自小鼠乳腺癌細胞SC-3的條件培養(yǎng)基，是一種分泌的糖蛋白糖埋，屬于人類成纖維細胞生長因子（FGFs）的大家族宣吱。FGF8基因經(jīng)過選擇性剪接，在人類中產(chǎn)生了四個異構(gòu)體（a阶捆、b凌节、e和f）。其中FGF8b具有最大的有絲分裂和轉(zhuǎn)化活性洒试，在胚胎發(fā)生過程中起著重要作用倍奢，同樣已被證明在幾種激素相關(guān)和非相關(guān)癌癥中過度表達。
二垒棋、材料與方法
1.數(shù)據(jù)來源
1）RMS患者的48份血漿樣本和50例腫瘤活檢樣本卒煞；在疾病復(fù)發(fā)時還收集了12個匹配的腫瘤樣本；15名小兒健康受試者（HS）叼架，12名男性和4名女性作為對照
2）48未經(jīng)治療的份血液樣本
3）人類RH30畔裕、RD衣撬、MCF-7和A549細胞系
2.實驗流程
1） 酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)、抗FGF8的間接ELISA檢測
2） 總IgG測量
3） 定量RT-PCR扮饶、細胞裂解具练、免疫印跡和免疫沉淀
4） 免疫組化、免疫細胞化學(xué)甜无、免疫熒光扛点、傷口愈合試驗、細胞存活率測定
5） 統(tǒng)計學(xué)分析：Mann-Whitney檢驗或單因素方差分析檢驗岂丘、Wilcoxon秩檢驗陵究；生存分析；Cox單變量和多變量比例危險分析
三奥帘、實驗結(jié)果
01 - 極高危RMS患者的FGF8自身抗體及其預(yù)后作用
????????為了確定高危RMS患者的異常調(diào)控蛋白铜邮，作者通過免疫反應(yīng)結(jié)合分析（IRBP），將先前在轉(zhuǎn)移性PAX3-FOXO1陽性（PF+）ARMS中發(fā)現(xiàn)的腫瘤抗原與PAX3-FOXO1融合蛋白調(diào)控下的基因進行交叉檢查寨蹋。為了驗證腫瘤來源的FGF8免疫反應(yīng)性并排除炎癥作為產(chǎn)生自身抗體的一般機制松蒜，作者使用內(nèi)部ELISA檢測作為金標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，將抗FGF8自身抗體值與患者的總漿液IgG進行標(biāo)準(zhǔn)化钥庇。通過IRBP分析證實了血漿樣本中檢測到的FGF8自身抗體的存在（圖1c）牍鞠，并證實了患者和對照組之間的明顯差異（圖1d；健康受試者评姨，HS）。相比之下萤晴，兩組的總IgG水平相近吐句，支持FGF8自身抗體的抗腫瘤作用，而不是簡單地反映炎癥反應(yīng)的存在店读。兩組數(shù)據(jù)在統(tǒng)計學(xué)上有相關(guān)性嗦枢，證實了這些初步觀察（圖1e）。
????????接下來屯断，為了分析自身抗體文虏、臨床病理參數(shù)和患者預(yù)后之間的關(guān)系，作者在一個更大的PF+病例群中測量了FGF8自身抗體殖演，沒有發(fā)現(xiàn)明顯的關(guān)聯(lián)氧秘，然而，當(dāng)根據(jù)FGF8自身抗體的中位豐度來區(qū)分患者時趴久，低滴度的自身抗體患者比高滴度的自身抗體患者的無事件生存率明顯更差（圖2a）丸相，3年無事件生存率為13%，而后者為45.8%彼棍。在這種情況下灭忠，兩組的總生存率差異不顯著（圖2b）膳算。多變量Cox回歸分析證實了這些發(fā)現(xiàn)，因為診斷時的FGF8自身抗體在無事件生存方面具有預(yù)后作用弛作，獨立于任何其他評估的臨床特征涕蜂。值得注意的是，在高FGF8 IgG水平的患者中映琳，EFS和OS相似机隙，而在低FGF8 IgG的患者中，OS優(yōu)于EFS刊头，這是由于一些患者盡管發(fā)生復(fù)發(fā)黍瞧，但卻獲得了疾病緩解。也就是說原杂，5名診斷時患有局部疾病和1名轉(zhuǎn)移性腫瘤的患者出現(xiàn)了復(fù)發(fā)（2名轉(zhuǎn)移性復(fù)發(fā)印颤，3名區(qū)域淋巴結(jié)復(fù)發(fā)，1名局部復(fù)發(fā)）穿肄，但在治療后達到完全緩解年局。所有這些人都從二線治療中獲益，包括一名在診斷后6個月后發(fā)生第二次遠處轉(zhuǎn)移的轉(zhuǎn)移性患者咸产。因此矢否，F(xiàn)GF8自身抗體代表了疾病進展的替代標(biāo)志物，而不是總體生存率脑溢。
02 - FGF8在PF+RMS細胞系中過度表達
????????為了證明ARMS患者更強的自身抗體反應(yīng)性與腫瘤中更高的FGF8表達有關(guān)僵朗，作者首先測量了正常對照細胞（間充質(zhì)干細胞、胎兒和成人骨骼肌細胞）的FGF8 mRNA水平屑彻。與正常肌肉和間質(zhì)干細胞（CTR）验庙、PF-胚胎性RMS（ERMS）、尤因肉瘤（EWS）社牲、非霍奇金淋巴瘤（NHL）和各種來源的細胞系粪薛，包括白血病、肺癌和乳腺癌搏恤、骨肉瘤违寿、滑膜肉瘤、神經(jīng)母細胞瘤相比熟空，F(xiàn)GF8在PF+ ARMS細胞系中過度表達（圖3a）藤巢。FGF8b/e/f異構(gòu)體也是如此，而FGF8a在所有細胞系中均一表達的痛阻。為了檢查FGF8蛋白在RMS細胞中的表達菌瘪，使用了PF+（RH30, ARMS）和PF-（RD, ERMS）細胞系。與RNA數(shù)據(jù)相對應(yīng)，在RH30細胞中觀察到更強的FGF8蛋白的細胞質(zhì)染色俏扩，而RD細胞中的信號很弱且僅限于核周區(qū)域（圖3b,c）糜工。當(dāng)評估細胞內(nèi)和分泌的FGF8蛋白時，兩個細胞系在血清48小時后的裂解液和培養(yǎng)基中的差異得到了證實（圖3d,e）录淡。
????????最后捌木，由于FGF8屬于更廣泛的具有旁分泌和自分泌功能的生長因子家族，這里將表達分析擴展到其他FGF家族成員嫉戚。與正常對照組相比刨裆，F(xiàn)GF8亞家族成員FGF17在PF+ RMS細胞系中也顯著上調(diào)（圖S3），但是差異遠小于FGF8彬檀，同時在PF+和PF- RMS細胞系之間沒有觀察到帆啃。相比之下，F(xiàn)GF18是FGF8亞家族的第三個成員窍帝，也是一些最具侵襲性的成人上皮癌的預(yù)后標(biāo)志物努潘，在RMS細胞中完全沒有表達。與PF-ERMS細胞相比坤学，F(xiàn)GF7在PF+ARMS細胞中的表達也明顯較高疯坤，但與正常細胞中的表達相似。相反的是FGF1和FGF2是兩個重要的家族成員深浮，在正常和病理情況下具有廣泛的有絲分裂活性压怠，在腫瘤細胞系中的表達與正常細胞一樣多。
03 - FGF8誘導(dǎo)的信號傳導(dǎo)在PF+RMS細胞中是活躍的
????????FGF8通過與質(zhì)膜上的成纖維細胞生長因子受體（FGFR1-4）結(jié)合而發(fā)揮其作用飞苇，一些證據(jù)表明菌瘫，異常表達的FGFRs在RMS腫瘤發(fā)生中起重要作用。為了探索FGF8下游的信號傳導(dǎo)布卡，作者首先測量了PF+和PF?RMS細胞系面板中的GFFR表達突梦，至于FGF8，與PF- ERMS細胞相比羽利，在PF+ ARMS細胞和大多數(shù)分析的非RMS細胞系中觀察到顯著的FGFR2和FGFR4蛋白表達（圖4a和S4）。
????????當(dāng)在正常生長培養(yǎng)條件下評估時刊懈，PF+ARMS細胞的基礎(chǔ)FGFR4和FGFR2磷酸化也較高这弧，表明這兩種受體的激活更強（圖4b）。通過向PF+ ARMS（RH4）和PF- ERMS（RD）細胞的培養(yǎng)液中添加外源性FGF8來研究了生長因子依賴性信號虚汛。正如預(yù)期的那樣匾浪，F(xiàn)GF8誘導(dǎo)了成纖維細胞生長因子受體底物2（FRS2）的快速但短暫的激活，F(xiàn)RS2是負(fù)責(zé)受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的膜錨蛋白卷哩，而PF+ RH4細胞中ERK1/2激酶的磷酸化更為持久（圖4c蛋辈，左圖）。在RD細胞中，沒有觀察到FRS2的治療依賴性磷酸化冷溶，而在相同的實驗條件下渐白，磷酸化ERK1/2狀態(tài)略有變化（圖4c，右圖）逞频。細胞運動是一種生長因子誘導(dǎo)的機制纯衍，通過MAPK激活在癌細胞中發(fā)生，僅在PF + RH4細胞中受FGF8刺激苗胀，如在生長因子暴露后48小時進行的傷口愈合測定中觀察到的那樣（圖4d）襟诸。然后在NVP-BGJ398（Infigratinib）存在或不存在的情況下評估劑量依賴性FGF8誘導(dǎo)的ERK1/2磷酸化。正如預(yù)期的那樣基协，NVP-BGJ398在PF + RH4細胞中完全消除了ERK1 / 2磷酸化歌亲，而在PF?RD細胞中未觀察到任何變化（圖4e）挑宠。此外设江，當(dāng)PF+ ARMS（RH30忿晕；RH4）和PF- ERMS細胞（RD钞它，RH36）在NVP-BGJ398存在下生長時健田，藥物敏感性與FGF8 mRNA表達水平密切相關(guān)虹脯，因為ARMS細胞系表現(xiàn)出極端的藥物敏感性淑仆，而ERMS細胞完全不受影響（圖4f）漆诽。
????????最后亭畜，為了確定FGF8相關(guān)的細胞信號在基因表達水平上的影響扮休，作者測量了重組FGF8處理后時間依賴性的DUSP6、SPRY4拴鸵、GDF15和ETV5的轉(zhuǎn)錄玷坠。結(jié)果顯示除ETV5外，DUSP6劲藐、SPRY4八堡、GDF15在PF+ RH4細胞中都被FGF8迅速上調(diào)，而在PF- RD中沒有進一步誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄（圖5a聘芜，b）兄渺。給予FGF8也增加了RH4細胞中纖溶酶原激活劑（PLAU）和基質(zhì)金屬肽酶-9（MMP9）的基因表達，這是幾種癌癥的入侵汰现、轉(zhuǎn)移和血管生成的兩個重要基因（圖5c）挂谍。
04 - FGF8在PF+RMS患者中的表達水平非常高
????????為了評估FGF8在RMS患者中的表達，作者收集了50個腫瘤活體組織瞎饲，并通過qRT-PCR測量FGF8 mRNA口叙。與上述報告的結(jié)果一致，F(xiàn)GF8在RMS腫瘤組織中過度表達（圖6a）嗅战，特別是在PF+的腫瘤中（圖6b）妄田，PF+ARMS和PF-ERMS病例的石蠟包埋組織切片染色證實了這一點（圖6c）。通過查詢在線可訪問的基因組數(shù)據(jù)庫，與PF-RMS（圖S5a）和其他以病理基因融合為特征的小兒軟組織和骨肉瘤（圖S5b）相比疟呐，證實PAX3/7-FOXO1攜帶的RMS中FGF8過度表達脚曾。這種差異在本研究一個小隊列中得到了驗證，其中包括脫髓鞘小圓細胞瘤（DSRCT）萨醒、骨肉瘤（OS）和尤文氏肉瘤（ES）（圖5c）斟珊，提供了FGF8是PF+ARMS的可靠腫瘤標(biāo)記物的最終證據(jù)。除了FGF8與PAX3/7-FOXO1融合狀態(tài)有關(guān)外富纸，觀察到10歲以上和1歲以下的患者與1至10歲的兒童相比囤踩，F(xiàn)GF8的水平也較高。診斷時有轉(zhuǎn)移性疾病的患者（IRS第四組）的FGF8水平反而高于有局部疾病的患者（IRS第二晓褪、三組）堵漱，但這種差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義。值得注意的是涣仿，將腫瘤組織中的FGF8表達與自身抗體滴度相匹配勤庐，發(fā)現(xiàn)這兩個變量之間存在顯著負(fù)相關(guān)（圖6d）。當(dāng)根據(jù)FGF8 IgG和mRNA中值（I至IV組）對患者進行分組時好港，那些高自身抗體滴度和低轉(zhuǎn)錄物水平的患者（圖6d愉镰，IV組，左上角）比其他mRNA/自身抗體組合有明顯更多的機會不出現(xiàn)不良事件钧汹，如復(fù)發(fā)或疾病進展（圖6d）丈探。
05 - FGF8在復(fù)發(fā)性RMS腫瘤中呈上調(diào)狀態(tài)
????????最近，在融合陽性RMS的小鼠模型中拔莱，盡管有PAX3-FOXO1的誘導(dǎo)碗降，但FGF8在復(fù)發(fā)腫瘤中仍保持高水平，并在沒有致癌融合蛋白的情況下作為促進生長和生存的關(guān)鍵因子塘秦。然而讼渊，由于PAX3/7-FOXO1靶向治療并不是用來治愈RMS患者的治療方法，為了了解在小鼠中觀察到的FGF8上調(diào)是否會引起更廣泛的RMS耐藥現(xiàn)象尊剔，作者在分析PAX-FOXO1表達動態(tài)的同時爪幻，還測量了其在匹配的原發(fā)腫瘤和復(fù)發(fā)中的表達情況。發(fā)現(xiàn)在復(fù)發(fā)的ARMS腫瘤中须误，與匹配的原發(fā)腫瘤相比笔咽，F(xiàn)GF8的表達進一步增加（圖7a，左）霹期，同時存在不相關(guān)的PAX-FOXO1表達變化（圖7a，右）拯田。也就是說历造，雖然所有患者復(fù)發(fā)時的FGF8水平都增加了，但PAX-FOXO1 mRNA僅在兩名患者中增加（ARMS_5和ARMS_6），在其他患者中減少（ARMS_2吭产、ARMS_3和ARMS_7）或保持不變（ARMS_1和ARMS_4）侣监。同樣，在五名患者中臣淤，有兩名患者的原發(fā)融合陰性ERMS腫瘤中FGF8的基線量非常低橄霉，在復(fù)發(fā)時有所增加（圖7b；ERMS_1和ERMS_4）邑蒋，盡管差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義姓蜂。最后，當(dāng)固體和液體活檢的匹配在診斷和復(fù)發(fā)時都是可行的医吊，F(xiàn)GF8 mRNA和抗FGF8自身抗體水平的趨勢顯然是相反的钱慢。事實上，雖然前者在復(fù)發(fā)時增加卿堂，但后者卻減少了束莫，這進一步支持了之前報道的FGF8 mRNA和自身抗體的反相關(guān)關(guān)系（圖6d），以及表達FGF8的RMS將受益于體液反應(yīng)受損而進展和擴散的假設(shè)草描。
四览绿、結(jié)論
????????本研究首次證明，高風(fēng)險的PAX3/7-FOXO1融合陽性的ARMS患者帶有循環(huán)的自身抗體穗慕，能夠改善診斷時的風(fēng)險分層饿敲。證明了致瘤性和血管生成性的FGF8生長因子是PF+ARMS診斷和治療的一個新的抗原，正如診斷時出現(xiàn)的特異性抗FGF8自身抗體所提示的那樣揍诽，被宿主免疫系統(tǒng)早期感知到诀蓉。通過進行生存分析，顯示FGF8自身抗體滴度可以準(zhǔn)確預(yù)測高危ARMS患者的復(fù)發(fā)暑脆，盡管臨床診斷為局部或轉(zhuǎn)移性疾病渠啤。鑒于循環(huán)FGF8自身抗體的無創(chuàng)性和容易檢測，這種方法可能有助于更準(zhǔn)確地考慮具有明顯類似腫瘤分期添吗，但可能有不同結(jié)果的患者沥曹，確定預(yù)測復(fù)發(fā)和治療失敗的患者特定的免疫反應(yīng)差異。
