免疫組庫(kù)（Immune Repertoire脑融，IR）是指?jìng)€(gè)體在某個(gè)特定時(shí)間其循環(huán)系統(tǒng)中所有多樣性的T細(xì)胞和B細(xì)胞的總和展懈，即V(D)J序列多樣性的集合。免疫組庫(kù)分析是指運(yùn)用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)個(gè)體免疫組庫(kù)多樣性分析冠跷，以及對(duì)T細(xì)胞和B細(xì)胞獨(dú)特性分析合是。
mixcr允許多種數(shù)據(jù)輸入，特異性免疫組庫(kù)測(cè)序或RNA-seq測(cè)序都可以作為輸入飒赃。

mixcr工作流程

實(shí)例展示

下載8個(gè)新冠樣本8個(gè)健康樣本RNA-seq的單端測(cè)序作為輸入利花。

批量下載數(shù)據(jù)：可參考RNA-seq轉(zhuǎn)錄組差異分析及可視化

#下載數(shù)據(jù)
prefetch -O /path to out/ --option-file SRR_Acc_List.txt
#將NCBI下載的數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)為fastq格式
cat SRR_Acc_List.txt|while read id;do fastq-dump --gzip -O /path to out/ /path to input/${id}.sra;done
#path to out:輸出路徑
#path to input:輸入文件路徑

#mixcr non-enriched
#single-read
cat SRR_Acc_List.txt|while read name;do mkdir ${name};done
cat SRR_Acc_List.txt|while read name;do mixcr analyze shotgun -s hsa --starting-material rna --only-productive --impute-germline-on-export --report ./report/${name}.report ./rawdata/${name}.fastq.gz ./results/${name}/${name};done
#運(yùn)行時(shí)間比較長(zhǎng)，16個(gè)樣本大約用時(shí)35h盒揉。
#推薦使用多線(xiàn)程分開(kāi)提交任務(wù)運(yùn)行晋被。

mixcr輸出結(jié)果

得到mixcr的輸出結(jié)果后vdjtools與immunarch（R包）都可以用來(lái)進(jìn)行可視化輸出。

1.準(zhǔn)備工作

mixcr與vdjtools是基于java平臺(tái)開(kāi)發(fā)的處理從原始序列到定量克隆型的大量免疫組數(shù)據(jù)的免疫分析軟件刚盈，在使用前要確保java環(huán)境是ok的羡洛。

最低配置

• Any Java-enabled platform (Windows, Linux, Mac OS X)
• Java version 7 or higher (download from Oracle web site)
• 1–16 Gb RAM (depending on number of clones in the sample)

檢查環(huán)境并下載軟件

官網(wǎng)下載 Java Runtime Environment，jre是java的運(yùn)行環(huán)境藕漱。

java -version #檢查java環(huán)境是否ok

官網(wǎng)下載mixcr的壓縮包并解壓欲侮，并添加至環(huán)境變量。
若未添加至環(huán)境變量肋联，每次運(yùn)行時(shí)需使用此代碼

java -jar path_to_mixcr\mixcr.jar ...  #path_to_mixcr = 解壓mixcr的地址

2.MIXCR

MIXCR分析流程主要包含三個(gè)程序步驟威蕉，分別是align，assemble橄仍，export韧涨。

• align：將測(cè)序結(jié)果比對(duì)到TCR或BCR的V,D,J和C的參考基因上牍戚。
• assemble：將上一步得到的結(jié)果進(jìn)行組裝，可以得到特定的基因區(qū)域序列虑粥，如CDR3序列如孝。
• export：將比對(duì)結(jié)果或組裝結(jié)果輸出，得到可閱讀的txt文件娩贷。

MIXCR支持輸入單端或雙端的測(cè)序文件第晰，可使用原始測(cè)序文件也可使用質(zhì)控后的文件，質(zhì)控方法和RNA-seq差異分析中的方法一致彬祖，使用fastp或者trimmomatic進(jìn)行質(zhì)控茁瘦，參考RNA-seq轉(zhuǎn)錄組差異分析及可視化。

3.一站式流程使用

MIXCR軟件提供了兩種analysis模式储笑，包含了上述三種參數(shù)甜熔，一站式進(jìn)行分析。

• analyze amplicon： for analysis of targeted TCR/IG library amplification (5’RACE, Amplicon, Multiplex, etc).
• analyze shotgun： for analysis of random fragments (RNA-Seq, Exome-Seq, etc).

#environment：Linux
# for enriched targeted TCR/IG libraries
mixcr analyze amplicon
    -s hsa \ # or mmu
    --starting-material dna  \#or rna
    --5-end v-primers \#or no-v-primers
    --3-end j-primers  \#or j-c-intron-primers or c-primers
    --adapters adapters-present \#or no-adapters
    R1.fastq.gz R2.fastq.gz  ./path/mixcr_result/sample1

The following parameters are optional:

# for non-enriched or random fragments
mixcr analyze shotgun
    -s hsa # or mmu
    --starting-material dna  #or rna
    [OPTIONS] input_file1 [input_file2] analysis_name

上述兩種分析模式可滿(mǎn)足大多要求南蓬，更多參數(shù)細(xì)節(jié)參考mixcr用戶(hù)手冊(cè)

4.逐級(jí)分析

沒(méi)有特殊的分析需求這部分可略過(guò)纺非。

4.1 Alignment

mixcr align [options] input_file1 [input_file2] output_file.vdjca

Alignment parameters

-OvParameters.geneFeatureToAlign是比對(duì)過(guò)程中的一個(gè)重要參數(shù)跳夭，有三個(gè)常用value涂圆。

• – VRegion（默認(rèn)值）：如果你的免疫組庫(kù)是使用多重PCR構(gòu)建的5端文庫(kù)則使用這個(gè)選項(xiàng)。
• – VTranscript：以RNA為起始材料進(jìn)行的非模板特異性擴(kuò)增币叹，例如5'RACE润歉。使用這個(gè)選項(xiàng)有助于提高測(cè)序信息5'端的利用率，有助于提高V基因的準(zhǔn)確性颈抚。
• – VGene：DNA為起始材料踩衩，5'端的信息（包括V區(qū)內(nèi)含子，leader sequence贩汉，5'UTR）應(yīng)該存在于測(cè)序信息中驱富。

如果想獲得TCR或BCR的全部克隆型（包括FR和CDR區(qū)域），使用- VTranscript或者- VGene匹舞。

4.1.1 分析RNA-seq數(shù)據(jù)

Analysis of RNA-Seq data performed with -p rna-seq option is almost equivalent to the following set of aligners parameters:

• (most important) turned off floating bounds of V and J alignments:
  – -OvParameters.parameters.floatingLeftBound=false
  – -OjParameters.parameters.floatingRightBound=false
• higher thresholds:
  – -OvParameters.parameters.absoluteMinScore=80 (was 40)
  – -OjParameters.parameters.absoluteMinScore=70 (was 40)
  – -OminSumScore=200 (was 120; see below)
• more strict scoring for all alignments (V, J, C):
  – -OxParameters.parameters.scoring.gapPenalty=-21
  – -OxParameters.parameters.scoring.subsMatrix=’simple(match=5,mismatch=-12)’

4.2 Assemble clones

這一步使用到上一步得到的.vdjca文件褐鸥，提取特定的基因序列，最后輸出.clns文件赐稽。

mixcr assemble [options] alignments.vdjca output.clns

-OassemblingFeatures參數(shù)用來(lái)設(shè)置需要組裝的區(qū)域叫榕。默認(rèn)值是CDR3浑侥。如果要組裝全序列，使用VDJRegion選項(xiàng)晰绎。

mixcr assemble -OassemblingFeatures="[V5UTR+L1+L2+FR1,FR3+CDR3]" alignments.vdjca output.clns

(note:assemblingFeatures must cover CDR3).

Other global parameters are:

example：

mixcr assemble -ObadQualityThreshold=10 alignments.vdjca output.clns
mixcr assemble -OmaxBadPointsPercent=0 alignments.vdjca output.clns #In order to prevent mapping of low quality reads (filter them off) one can set maxBadPointsPercent to zero

4.3Export

將比對(duì)結(jié)果或組裝結(jié)果輸出锭吨，得到可閱讀的txt文件。

#
mixcr exportAlignments [options] alignments.vdjca alignments.txt
mixcr exportClones [options] clones.clns clones.txt

5.結(jié)果解讀

參考mixcr官方手冊(cè)export部分寒匙。

可視化處理

參考使用vdjtools進(jìn)行免疫組庫(kù)分析