hello掷漱，新的一周，周一是開始榄檬，不知道大家感覺2022年初怎么樣呢卜范？？鹿榜？是不是覺得很不錯(cuò)海雪？？犬缨？不過我工作了幾年領(lǐng)悟了一個(gè)道理喳魏，那就是干什么事情都要低調(diào)，別張揚(yáng)怀薛，做好自己的事情刺彩，就是對(duì)自己最大的負(fù)責(zé)。好了枝恋，我們要繼續(xù)單細(xì)胞空間的聯(lián)合分析了创倔，文章在Recurrence of cancer cell states across diverse tumors and their interactions with the microenvironment，目前空間轉(zhuǎn)錄組的文章大部分還是老外在發(fā)焚碌，國內(nèi)寥寥無幾畦攘，可能對(duì)空間轉(zhuǎn)錄組的認(rèn)識(shí)及運(yùn)用不足，希望我們的分享十电，能讓大家更加深刻認(rèn)識(shí)到空間轉(zhuǎn)錄組的作用知押。

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先來總結(jié)一下重點(diǎn)內(nèi)容

• 免疫療法在多種癌癥中的臨床成功暗示了癌細(xì)胞與腫瘤微環(huán)境 (TME) 之間相互作用的共性，腫瘤前沿的部分上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化 (pEMT) 癌細(xì)胞群與癌癥相關(guān)的成纖維細(xì)胞相互作用并介導(dǎo)侵襲鹃骂。
• NMF識(shí)別腫瘤細(xì)胞狀態(tài)（NMF是是單細(xì)胞空間分析的一個(gè)重點(diǎn)台盯，大家可以參考文章10X單細(xì)胞空間數(shù)據(jù)分析之表征細(xì)胞狀態(tài)和生態(tài)型（EcoTyper）、10X單細(xì)胞空間數(shù)據(jù)分析之表征細(xì)胞狀態(tài)和生態(tài)型（EcoTyper示例代碼））
• 癌細(xì)胞狀態(tài)可能反映了常見的物理限制以及與其微環(huán)境中細(xì)胞成分的相互作用畏线，免疫療法在一系列癌癥類型中的成功表明癌細(xì)胞和免疫細(xì)胞之間存在保守的相互作用静盅，這導(dǎo)致我們質(zhì)疑與免疫系統(tǒng)的相互作用是否塑造了一系列發(fā)生的癌細(xì)胞狀態(tài)。尤其是干擾素反應(yīng)模塊可能涉及癌細(xì)胞和 TME 之間的相互作用寝殴。
• 空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)解卷積蒿叠，分析空間細(xì)胞分布（單細(xì)胞空間聯(lián)合還是非常重要的）
• 根據(jù)癌細(xì)胞狀態(tài)來查詢細(xì)胞鄰域的組成。使用鄰域和鄰近度量將這種分析擴(kuò)展到所有細(xì)胞類型和模塊對(duì)蚣常，確定了細(xì)胞狀態(tài)與 TME 細(xì)胞類型的其他一致的共定位（空間共定位分析也非常重要）市咽。

ABSTRACT

雖然遺傳腫瘤異質(zhì)性早已得到認(rèn)可，但最近的工作揭示了癌細(xì)胞在表觀遺傳和轉(zhuǎn)錄水平上的顯著差異抵蚊。在單個(gè)癌癥類型中對(duì)單細(xì)胞水平的腫瘤進(jìn)行分析表明魂务，轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性被組織成癌細(xì)胞狀態(tài)曼验，這意味著不同的細(xì)胞狀態(tài)可能代表在腫瘤維持和進(jìn)展中具有互補(bǔ)作用的穩(wěn)定和功能單元。然而粘姜，尚不清楚這些狀態(tài)在多大程度上跨越了腫瘤類型，構(gòu)成了癌癥的一般特征熔酷。此外孤紧，癌細(xì)胞狀態(tài)在腫瘤進(jìn)展中的作用及其與腫瘤微環(huán)境細(xì)胞的特異性相互作用仍有待闡明。在這里拒秘，對(duì) 15 種癌癥類型進(jìn)行泛癌單細(xì)胞 RNA-Seq 分析号显，并確定了 16 個(gè)基因模塊的catalog，其表達(dá)定義了復(fù)發(fā)性癌細(xì)胞狀態(tài)躺酒，包括“壓力”押蚤、“干擾素反應(yīng)”、“上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化” '羹应，'metal response’, '揽碘，'basal'和'纖毛'。使用小鼠模型园匹，發(fā)現(xiàn)干擾素反應(yīng)模塊的誘導(dǎo)因腫瘤位置而異雳刺，并且在消除淋巴細(xì)胞后減弱。此外裸违，空間轉(zhuǎn)錄組分析進(jìn)一步將癌細(xì)胞中的干擾素反應(yīng)與腫瘤微環(huán)境中的 T 細(xì)胞和巨噬細(xì)胞聯(lián)系起來掖桦。分析工作為研究癌細(xì)胞狀態(tài)如何與腫瘤微環(huán)境相互作用以形成能夠免疫逃避、耐藥性和轉(zhuǎn)移的有組織的系統(tǒng)提供了一個(gè)框架供汛。

Introduction

癌癥中的轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性越來越被認(rèn)為是腫瘤進(jìn)展枪汪、轉(zhuǎn)移和治療失敗的驅(qū)動(dòng)因素。單細(xì)胞 RNA 測(cè)序 (scRNA-Seq) 能夠?qū)蝹€(gè)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行無偏見的轉(zhuǎn)錄組分析怔昨，并揭示同一腫瘤的惡性細(xì)胞之間存在 striking 異質(zhì)性雀久。此外，有證據(jù)表明轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性被組織成共表達(dá)基因的模塊朱监。來自膠質(zhì)母細(xì)胞瘤岸啡、少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤、星形細(xì)胞瘤赫编、頭頸癌和黑色素瘤等的數(shù)據(jù)表明巡蘸，在腫瘤內(nèi)，癌細(xì)胞的分化程度是異質(zhì)的擂送，從干細(xì)胞或祖細(xì)胞樣到完全分化悦荒。這些在多種癌癥類型中進(jìn)行的研究也表明存在與應(yīng)激反應(yīng)、干擾素反應(yīng)和缺氧相關(guān)的癌細(xì)胞狀態(tài)嘹吨。雖然在多項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn)了某些狀態(tài)搬味，但仍有待建立跨癌癥類型的細(xì)胞狀態(tài)的一般 catalog。這樣一個(gè)連貫的框架——如果存在的話——將能夠?qū)ふ也煌┌Y類型的共同主題，并了解腫瘤是如何獨(dú)立于其起源而組織的碰纬。

除了惡性細(xì)胞外萍聊，腫瘤還由復(fù)雜的微環(huán)境組成，包括免疫細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞悦析，它們?cè)谀[瘤發(fā)生中也起著關(guān)鍵作用寿桨。 特別是，免疫療法在多種癌癥中的臨床成功暗示了癌細(xì)胞與腫瘤微環(huán)境 (TME) 之間相互作用的共性强戴。 TME 的特定 elements 與癌細(xì)胞狀態(tài)之間存在因果關(guān)系亭螟。 在一項(xiàng)頭頸癌研究中，腫瘤前沿的部分上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化 (pEMT) 癌細(xì)胞群與癌癥相關(guān)的成纖維細(xì)胞相互作用并介導(dǎo)侵襲骑歹。 在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和三陰性乳腺癌中预烙，TME 因子似乎誘導(dǎo)惡性細(xì)胞呈干細(xì)胞樣狀態(tài)。 這些工作表明需要對(duì)癌細(xì)胞狀態(tài)進(jìn)行系統(tǒng)分析道媚，特別關(guān)注與 TME 的非惡性細(xì)胞類型的關(guān)系扁掸。

在這里，通過系統(tǒng)分析 15 種癌癥類型來描述復(fù)發(fā)性癌細(xì)胞狀態(tài)及其與 TME 的關(guān)系衰琐，以使用以基因?yàn)橹行牡姆椒ㄗR(shí)別復(fù)發(fā)性癌細(xì)胞狀態(tài)catalog也糊。通過分析來自先前發(fā)表的數(shù)據(jù)以及新收集的腫瘤的 scRNA-Seq 數(shù)據(jù)，確定了 16 個(gè)連貫基因模塊并量化了它們?cè)诿總€(gè)樣本的惡性細(xì)胞中的表達(dá)羡宙。該catalog包括所有研究腫瘤中存在的模塊狸剃，以及特定于特定癌癥類型的其他模塊。為了進(jìn)一步研究癌細(xì)胞狀態(tài)狗热，使用實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛠頂_亂腫瘤微環(huán)境并測(cè)試對(duì)癌細(xì)胞狀態(tài)的不同影響钞馁。雖然一些狀態(tài)與癌癥生物學(xué)的已知方面有關(guān)，但提供證據(jù)表明這些過程是異質(zhì)的由同一腫瘤的細(xì)胞部署匿刮，并且這種異質(zhì)性在廣泛的癌癥類型中重現(xiàn)僧凰。對(duì)干擾素反應(yīng)模塊的詳細(xì)分析進(jìn)一步引導(dǎo)我們研究其在 TME 擾動(dòng)背景下的體內(nèi)依賴性，并確定其在癌癥類型中與巨噬細(xì)胞和 T 細(xì)胞的接近性熟丸⊙荡耄總體而言，癌細(xì)胞狀態(tài)catalog是腫瘤組成的coherent representation光羞，并為分析和測(cè)試腫瘤發(fā)生的特征提供了框架绩鸣。

Result

Recurring gene modules across diverse cancer types

在手術(shù)后立即收集了 19 個(gè)新鮮的原發(fā)性未治療患者腫瘤，涵蓋 9 種癌癥類型纱兑。分離每個(gè)腫瘤以獲得單細(xì)胞懸浮液呀闻，并在沒有事先分選的情況下處理 scRNA-Seq，以確保對(duì)腫瘤細(xì)胞組成進(jìn)行公正的評(píng)估潜慎。腫瘤收集包括 9 種癌癥類型：卵巢癌 (OVCA)捡多、子宮內(nèi)膜癌 (UCEC)蓖康、乳腺癌 (BRCA)、前列腺癌 (PRAD)垒手、腎癌 (KIRC)蒜焊、肝癌 (LIHC)、結(jié)腸癌 (COAD) 和胰腺癌 (PDAC) 科贬，以及一種非上皮癌類型山涡，胃腸道間質(zhì)瘤 (GIST)。首先通過使用標(biāo)記基因唆迁、singleR 注釋和推斷的拷貝數(shù)變異的組合分析轉(zhuǎn)錄組，并控制雙細(xì)胞的可能性來識(shí)別數(shù)據(jù)集中的惡性細(xì)胞竞穷。在樣本中唐责，注釋了 9,036 個(gè)惡性細(xì)胞和 18,546 個(gè)非惡性細(xì)胞。為了擴(kuò)展數(shù)據(jù)集瘾带，還對(duì)先前報(bào)道中的腫瘤進(jìn)行了這種分析鼠哥，包括額外的 PDAC 和 LIHC，以及其他腫瘤類型：膽管癌 (CHCA)看政、肺腺癌 (LUAD)朴恳、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌 (HNSC)、皮膚鱗狀細(xì)胞癌 (SKSC)允蚣、多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤 (GBM) 和少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤 (OGD)于颖，最終得到來自 15 種癌癥類型的 62 個(gè)未經(jīng)治療的原發(fā)性腫瘤的總共 19,942 個(gè)惡性細(xì)胞。

定義細(xì)胞狀態(tài)的方法包括首先對(duì)底層基因模塊進(jìn)行分類嚷兔，最近的工作已將基因模塊確定為細(xì)胞狀態(tài)的定義特征森渐。這是一種靈活的方法，因?yàn)樗试S細(xì)胞表達(dá)模塊的組合冒晰，因此允許細(xì)胞狀態(tài)的復(fù)雜性同衣。使用非負(fù)矩陣分解 (NMF) 分析惡性細(xì)胞（NMF是是單細(xì)胞空間分析的一個(gè)重點(diǎn)，大家可以參考文章10X單細(xì)胞空間數(shù)據(jù)分析之表征細(xì)胞狀態(tài)和生態(tài)型（EcoTyper）壶运、10X單細(xì)胞空間數(shù)據(jù)分析之表征細(xì)胞狀態(tài)和生態(tài)型（EcoTyper示例代碼））耐齐，以將基因模塊識(shí)別為共表達(dá)基因的集合。方法檢測(cè)樣本中共同表達(dá)的基因蒋情，即在細(xì)胞子集中連貫表達(dá)的基因埠况。為了在腫瘤中尋找重復(fù)出現(xiàn)的基因模塊，隨后比較了已識(shí)別模塊的基因組成恕出。因此询枚，通過在基因模塊而不是表達(dá)矩陣的水平上進(jìn)行整合，樣品和研究中技術(shù)變化的影響是有限的浙巫。盡管這些模塊在各種癌癥類型中的獨(dú)立鑒定——因此不假定復(fù)發(fā)——發(fā)現(xiàn)在不同腫瘤中獲得的模塊顯著重疊金蜀。重要的是刷后，this finding of recurrence rather than uniqueness would not be the result of batch effects。

基因模塊的重現(xiàn)能夠構(gòu)建一個(gè)包含 16 個(gè)共有模塊（以下稱為“模塊”）的catalog渊抄，每個(gè)模塊的中位數(shù)為 37 個(gè)基因尝胆。為了確定一個(gè)模塊是否顯著存在于每個(gè)腫瘤的癌細(xì)胞群中，使用了基因集過度分散度量护桦。一些模塊富集特定的器官系統(tǒng)（如大腦或婦科器官）含衔，而其他模塊則跨越多個(gè)器官系統(tǒng)和組織學(xué)。還在代表輸卵管二庵、乳房和肝臟的正常上皮細(xì)胞的獨(dú)立數(shù)據(jù)集中測(cè)試了模塊的過度分散贪染，以query模塊是否反映了正常組織中發(fā)現(xiàn)的異質(zhì)性的重構(gòu)。對(duì)于大多數(shù)模塊催享，發(fā)現(xiàn)正常上皮樣本中的過度分散較低杭隙，這表明它們?cè)谡＝M織中沒有差異表達(dá)。然而因妙，在正常組織中確實(shí)在一定程度上檢測(cè)到模塊catalog這一事實(shí)表明痰憎，這些模塊并不是癌癥特有的，而是從現(xiàn)有的模塊中選擇出來的攀涵，并且表達(dá)得更加不均勻铣耘。還研究了模塊的基因組成和癌癥類型特異性，將與細(xì)胞過程相關(guān)的模塊與與細(xì)胞身份相關(guān)的模塊區(qū)分開來以故。

正如預(yù)期的那樣蜗细，恢復(fù)了一個(gè)由細(xì)胞周期基因（例如 TOP2A、PCNA）組成的高度復(fù)發(fā)模塊据德，在采樣時(shí)捕獲任何循環(huán)腫瘤中的癌細(xì)胞亞群鳄乏。 另一個(gè)在腫瘤類型中反復(fù)出現(xiàn)的過程是應(yīng)激反應(yīng)（例如，JUN棘利、FOS橱野、HSPA1B）跑芳，先前已經(jīng)描述并顯示其在黑色素瘤的耐藥性中起作用弟断。 分析還在下面提供了空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)，這些數(shù)據(jù)為在沒有解離的情況下癌細(xì)胞中這種狀態(tài)的體內(nèi)存在提供了額外的支持宴杀。

一種已在轉(zhuǎn)移性卵巢癌中發(fā)現(xiàn)的干擾素反應(yīng)模塊被檢測(cè)為廣泛存在茅郎，表明惡性細(xì)胞中的干擾素反應(yīng)在一系列實(shí)體瘤類型中是異質(zhì)的蜗元。除了干擾素刺激的基因（如 STAT1 和 IFIT1）外，該模塊還包含抗原呈遞的成分系冗，這是干擾素的一種充分表征的作用奕扣，包括 HLA-A 等 MHC I 基因和包括 HLA-DRA 在內(nèi)的 MHC II 基因。雖然 MHC II 表達(dá)通常與專業(yè)抗原呈遞細(xì)胞相關(guān)掌敬，但該途徑也已顯示在正常上皮細(xì)胞和癌細(xì)胞中表達(dá)惯豆。干擾素反應(yīng)通常用作招募和激活免疫細(xì)胞的防御反應(yīng)池磁，并已在癌癥中進(jìn)行了廣泛研究。在這種情況下楷兽，干擾素配體可能由癌細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞 (DC)（對(duì)于 I 型干擾素地熄，IFNα 和 IFNβ）或由自然殺傷 (NK) 和 T 細(xì)胞（對(duì)于 IFNγ）分泌⌒旧保或者端考，干擾素反應(yīng)可能是癌細(xì)胞固有的，即獨(dú)立于其他細(xì)胞類型的信號(hào)激活揭厚；事實(shí)上却特，最近一項(xiàng)比較體外癌細(xì)胞系基因模塊的研究也發(fā)現(xiàn)了干擾素反應(yīng)模塊，支持了不依賴于 TME 的反應(yīng)的可能性筛圆。

在一系列癌癥類型中還發(fā)現(xiàn)了與代謝過程相關(guān)的兩個(gè)模塊：缺氧模塊（例如 VEGF核偿、ADM）和氧化磷酸化模塊（例如 ATP5H、LAMTOR2）顽染。 實(shí)體瘤中對(duì)缺氧的代謝適應(yīng)，隨著糖酵解增加和血管生成的誘導(dǎo)轰绵，與癌癥進(jìn)展粉寞、耐藥性、侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)左腔。盡管如此唧垦，最近的研究表明氧化磷酸化在幾種癌癥類型中的作用，這表明癌細(xì)胞可能 依靠糖酵解和氧化磷酸化來產(chǎn)生能量液样。 金屬硫蛋白基因的另一個(gè)基因模塊——我們?cè)诖朔Q為金屬反應(yīng)模塊——可能在幾種癌癥類型的增殖和耐藥性中起作用振亮。

另一組模塊對(duì)應(yīng)于細(xì)胞身份，似乎與起源的組織和細(xì)胞有關(guān)鞭莽。所分析的大多數(shù)腫瘤是上皮起源的坊秸，因此我們確定了與已知上皮細(xì)胞類型標(biāo)志物重疊的模塊：如預(yù)期在 LUAD 中特別存在的肺泡模塊（例如，AGER澎怒、CAV1）褒搔，以及基底（例如， KRT5 和 KRT15)喷面、鱗狀細(xì)胞模塊 (例如 KLK10星瘾、LY6D) 和腺細(xì)胞模塊 (例如 CLU、MUC5B)惧辈。由纖毛相關(guān)基因（例如 FOXJ1琳状、PIFO）組成的模塊存在于婦科腫瘤以及 LUAD 和 GBM 中。在卵巢和子宮內(nèi)膜腫瘤中盒齿，該模塊僅存在于子宮內(nèi)膜樣樣本（OVCA NYU2-3念逞、UCEC NYU2-3）中困食，而不存在于高級(jí)漿液樣本（OVCA NYU1、UCEC NYU1）中肮柜，表明纖毛形成是一種特征子宮內(nèi)膜樣組織學(xué)陷舅。該模塊在正常輸卵管和肺上皮組織中的存在表明其在癌癥中的差異表達(dá)反映了起源組織的異質(zhì)性。在腫瘤內(nèi)觀察到的分化模塊的異質(zhì)表達(dá)可以從臨床病理學(xué)角度提供對(duì)腫瘤結(jié)構(gòu)的更詳細(xì)的理解审洞，其中評(píng)估每個(gè)腫瘤的分級(jí)和組織學(xué)亞型莱睁。

跨越多種癌癥類型的兩個(gè)模塊與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化 (EMT) 相關(guān)：一個(gè)完整的間充質(zhì)模塊 (cEMT)（例如，COL1A1芒澜、FN1）和一個(gè)缺乏規(guī)范的部分間充質(zhì)模塊 (pEMT)（例如仰剿，LAMC2、VIM）痴晦。 間充質(zhì)標(biāo)志物南吮，如膠原基因。 pEMT 模塊最近在 HNSC10 和 SKSC31 中得到了表征誊酌，但也在 GBM7 中發(fā)現(xiàn)部凑，這表明來自不同譜系的細(xì)胞在癌癥中會(huì)聚到這種特性上。 我們?cè)谏贁?shù)樣本中檢測(cè)到 cEMT 模塊的存在碧浊，但在一系列癌癥類型中：主要是 PDAC涂邀、CHCA、LUAD 和 GBM箱锐。 最近的一項(xiàng)研究表明比勉，pEMT 和 cEMT 可以發(fā)生在一系列癌癥類型中，并且可能代表兩種途徑驹止，它們?nèi)诤狭碎g充質(zhì)分化賦予的表型特性浩聋，包括遷移和耐藥性。 使用 TCGA 數(shù)據(jù)臊恋，我們確實(shí)發(fā)現(xiàn) pEMT 基因模塊的表達(dá)與無進(jìn)展生存期降低有關(guān)衣洁。

最后，確定了三個(gè)神經(jīng)系統(tǒng)癌癥特異性模塊：星形膠質(zhì)細(xì)胞 (AC) 樣（例如 APOE抖仅、ALDOC）闸与、少突膠質(zhì)祖細(xì)胞 (OPC) 樣（例如 OLIG1、OLIG2）和神經(jīng)祖細(xì)胞（NPC）- 像（例如岸售，DLX1践樱、DLX5）模塊。

這些模塊在一系列癌癥類型中的廣泛應(yīng)用突出了分化程序的重新部署以及癌癥和正常組織中不同的表達(dá)水平凸丸。 此外拷邢，雖然已鑒定的許多基因與癌癥生物學(xué)的各個(gè)方面有關(guān)，但單細(xì)胞方法使我們能夠證明它們?cè)谀[瘤的惡性細(xì)胞中異質(zhì)表達(dá)屎慢，并且通常在惡性上皮細(xì)胞與正常上皮細(xì)胞中以更高的水平表達(dá)瞭稼。

為了測(cè)試是否也可以使用獨(dú)立方法檢測(cè) 16 個(gè)模塊的catalog忽洛，使用了 SCENIC，這是一種識(shí)別表達(dá)相關(guān)且受相同轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)的基因的方法环肘。 發(fā)現(xiàn)catalog的每個(gè)模塊與幾個(gè) SCENIC 調(diào)節(jié)子有顯著重疊欲虚。例如，干擾素響應(yīng)模塊與幾個(gè)用轉(zhuǎn)錄因子 STAT1 和 IRF1 注釋的 SCENIC 調(diào)節(jié)子重疊悔雹。

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Defining cancer cell states by gene module expression

在建立了癌癥基因模塊的catalog之后复哆，接下來試圖了解它們通常是如何在單個(gè)細(xì)胞水平上assembled。 特別是腌零，query細(xì)胞是否受限于它們可以表達(dá)的模塊或模塊組合梯找。 為此，對(duì)每個(gè)惡性細(xì)胞的每個(gè)模塊的表達(dá)進(jìn)行評(píng)分益涧。 例如锈锤，在 SKSC Ji1 樣本中，基底闲询、鱗狀和循環(huán)模塊的表達(dá)是相互排斥的久免，但這些模塊中的每一個(gè)都與壓力或 pEMT 模塊共表達(dá)。 更一般地說扭弧，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)細(xì)胞表達(dá)模塊的組合妄壶，盡管并非所有組合都是可能的。 這些結(jié)果支持這樣一種觀點(diǎn)寄狼，即在定義癌細(xì)胞狀態(tài)時(shí)，檢查表達(dá)的完整基因模塊集至關(guān)重要氨淌。

由于模塊在癌癥類型中重復(fù)出現(xiàn)泊愧，推斷細(xì)胞模塊評(píng)分可以作為比較不同患者癌細(xì)胞的自axes。最值得注意的是盛正，該空間中的癌細(xì)胞不按患者或癌癥類型分組删咱，而是按其最高表達(dá)的模塊分組。這與以下發(fā)現(xiàn)形成鮮明對(duì)比：在基因表達(dá)空間中豪筝，癌細(xì)胞按患者聚集痰滋，并在去除單個(gè)基因引起的變異時(shí)突出顯示癌癥類型的共性。如 SKSC Ji1 所述续崖，某些模塊之間存在一定程度的共表達(dá)：例如 pEMT 與壓力和干擾素反應(yīng)共表達(dá)敲街。Together with the fact that cells do not form distinct clusters，這支持了癌細(xì)胞狀態(tài)通常不代表離散實(shí)體的觀點(diǎn)严望。然而多艇，確實(shí)觀察到了與表達(dá)循環(huán)或纖毛模塊的細(xì)胞相對(duì)應(yīng)的離散clusters。These clusters are also identified when examining tumors individually in gene expression-based dimensionality reductions, and are therefore not artifacts of the module score dimensionality reduction像吻。

由于某些模塊也存在于非癌癥樣本中峻黍，這里query表達(dá)每個(gè)模塊的細(xì)胞比例是否在惡性和非惡性上皮細(xì)胞之間變化复隆。 為此，將惡性細(xì)胞中的模塊表達(dá)頻率與匹配樣本的非惡性細(xì)胞中的模塊表達(dá)頻率進(jìn)行了比較姆涩，雖然對(duì)于 LUAD挽拂、SKSC 和 THCA，與成對(duì)的相鄰正常樣本的上皮細(xì)胞進(jìn)行了比較骨饿，但在 PDAC 中亏栈，來自相同樣本的非惡性導(dǎo)管細(xì)胞用作成對(duì)的正常比較。

與正常情況相比样刷，pEMT 模塊在所有三種癌癥類型中的表達(dá)頻率更高仑扑，這與 EMT 在上皮癌中的常見發(fā)生率一致。 相對(duì)于正常置鼻，干擾素反應(yīng)模塊在 LUAD 和 SKSC 中表現(xiàn)出增加的表達(dá)頻率镇饮，但在 PDAC 中沒有變化。 這可以部分解釋為箕母，用作參考的導(dǎo)管細(xì)胞是腫瘤本身的一部分储藐，并且暴露于 TME。

正常肺和皮膚有鱗狀細(xì)胞成分嘶是，始終觀察到腫瘤樣本中鱗狀細(xì)胞表達(dá)沒有差異钙勃。相反，相對(duì)于正常導(dǎo)管細(xì)胞聂喇，在 PDAC 中誘導(dǎo)了鱗狀模塊辖源，表明惡性細(xì)胞群中存在鱗狀分化。basal模塊也觀察到了類似的趨勢(shì)希太】巳模基于bulk轉(zhuǎn)錄組學(xué)已經(jīng)提出了幾種 PDAC 分類，包括經(jīng)典（腺體基因的高表達(dá)誊辉，包括 TFF1 和 CEACAM6）和基礎(chǔ)亞型（鱗狀和基礎(chǔ)基因的高表達(dá)矾湃，包括 LY6D 和 KRT15）之間的區(qū)別。雖然鱗狀細(xì)胞胰腺癌很少見堕澄，但 PDAC 中鱗狀細(xì)胞表達(dá)頻率的增加表明部分化生向鱗狀細(xì)胞程序是常見的邀跃。 LUAD 和 PDAC 中腺模塊的表達(dá)相對(duì)于它們的正常對(duì)應(yīng)物沒有變化，但在 SKSC 中相對(duì)于正常皮膚增加蛙紫。這種模式表明拍屑，惡性細(xì)胞群保留了與其來源細(xì)胞類型相關(guān)的模塊的表達(dá)（例如，SKSC 中鱗狀模塊的保留）并進(jìn)一步部署了來自其他細(xì)胞類型的基因模塊（SKSC 中腺模塊的表達(dá)增加）坑傅。

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Expression of the interferon response is modulated by the tumor microenvironment（干擾素反應(yīng)的表達(dá)受腫瘤微環(huán)境的調(diào)節(jié)）

癌細(xì)胞狀態(tài)可能反映了常見的物理限制以及與其微環(huán)境中細(xì)胞成分的相互作用丽涩。值得注意的是，免疫療法在一系列癌癥類型中的成功表明癌細(xì)胞和免疫細(xì)胞之間存在保守的相互作用，這導(dǎo)致我們質(zhì)疑與免疫系統(tǒng)的相互作用是否塑造了一系列發(fā)生的癌細(xì)胞狀態(tài)矢渊。尤其是干擾素反應(yīng)模塊可能涉及癌細(xì)胞和 TME 之間的相互作用继准。在腫瘤中，I 型干擾素由癌細(xì)胞和 DC 分泌矮男，以響應(yīng)激活 cGAS/STING 通路的 DNA 片段移必，并導(dǎo)致 T 細(xì)胞啟動(dòng)和抗腫瘤活性。 IFNγ 主要由活化后的適應(yīng)性免疫細(xì)胞產(chǎn)生毡鉴，并導(dǎo)致 MHC I 基因的上調(diào)崔泵，最初促進(jìn)腫瘤排斥，但最終通過免疫編輯導(dǎo)致 IFN 無反應(yīng)性腫瘤猪瞬。根據(jù)這些觀察結(jié)果憎瘸，query適應(yīng)性免疫細(xì)胞是否是必要的在體內(nèi)引發(fā)癌細(xì)胞中的干擾素反應(yīng)模塊。為此陈瘦，使用了已建立的同種異體移植小鼠癌癥模型幌甘，其中 TME 很容易受到干擾。對(duì)四個(gè)原位胰腺腫瘤進(jìn)行了 scRNA-Seq痊项，以驗(yàn)證基因模塊可以在原位模型中重現(xiàn)锅风。像之前所做的那樣使用 NMF 識(shí)別基因模塊，發(fā)現(xiàn)在這個(gè)系統(tǒng)中概括了五個(gè)：循環(huán)鞍泉、壓力反應(yīng)皱埠、干擾素反應(yīng)、缺氧和腺體分化咖驮。

同時(shí)边器，從四個(gè)缺乏 T 細(xì)胞和 B 細(xì)胞的 Rag1-/- 小鼠體內(nèi)形成的原位腫瘤中收集了 scRNA-Seq 數(shù)據(jù)。分析來自這些腫瘤的惡性細(xì)胞中的基因模塊表達(dá)托修，發(fā)現(xiàn)循環(huán)忘巧、應(yīng)激反應(yīng)、缺氧和腺體分化在 Rag1-/- 和 WT 小鼠之間以相似的頻率表達(dá)诀黍。相反，干擾素反應(yīng)模塊在來自 Rag1-/- 小鼠的腫瘤中以較低頻率表達(dá)（p < 10^-10仗处，Kolmogorov-Smirnov test）眯勾。此外，相對(duì)于其他癌細(xì)胞婆誓，干擾素反應(yīng)模塊的所有基因在表達(dá)干擾素反應(yīng)的細(xì)胞中均上調(diào)吃环，這表明維持了協(xié)調(diào)反應(yīng)——盡管在較少的細(xì)胞中。干擾素反應(yīng)模塊的 MHC I 基因（B2m洋幻、H2-D1郁轻、H2-K1）在 Rag1-/- 小鼠中的總體表達(dá)較低（盡管它們?cè)诟蓴_素反應(yīng)表達(dá)細(xì)胞中保持相對(duì)上調(diào)），表明淋巴細(xì)胞耗竭對(duì) MHC I 基因的表達(dá)具有額外的影響，而 MHC I 基因與干擾素反應(yīng)無關(guān)好唯。

接下來測(cè)試了不同的腫瘤微環(huán)境是否也會(huì)調(diào)節(jié)干擾素反應(yīng)模塊的表達(dá)竭沫。 在一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中，將胰腺中的原位腫瘤（癌癥的起源部位）與腹膜中的異位腫瘤（常見的轉(zhuǎn)移部位）進(jìn)行了比較骑篙。 發(fā)現(xiàn)腹膜中的腫瘤具有較低頻率的干擾素反應(yīng)表達(dá)細(xì)胞（在 Kolmogorov-Smirnov test）蜕提。 在第二個(gè)實(shí)驗(yàn)中，比較了兩個(gè)異位部位（腹膜和肝臟）的頻率靶端，以便模擬體內(nèi)不同的轉(zhuǎn)移部位谎势。 在這里，發(fā)現(xiàn)干擾素反應(yīng)模塊在肝臟中的表達(dá)頻率高于腹膜（p < 10^-10杨名，Kolmogorov-Smirnov test）脏榆。

總的來說，這組實(shí)驗(yàn)提供了對(duì)癌癥中干擾素反應(yīng)模塊發(fā)生情況的初步評(píng)估台谍。 該模塊在多種癌癥類型须喂、器官和免疫環(huán)境中的存在表明，干擾素反應(yīng)在惡性細(xì)胞中的異質(zhì)性是腫瘤的一個(gè)共同特征典唇。 發(fā)現(xiàn)適應(yīng)性免疫系統(tǒng)對(duì)于該模塊的大多數(shù)但不是全部表達(dá)是必需的镊折。 淋巴細(xì)胞耗盡狀態(tài)下的剩余表達(dá)表明癌細(xì)胞中干擾素反應(yīng)的其他原因，或者是癌癥外在的介衔，例如 NK 細(xì)胞分泌的干擾素恨胚，或者是癌癥內(nèi)在的，這與體外干擾素反應(yīng)模塊的報(bào)道一致炎咖。 值得注意的是赃泡，這一發(fā)現(xiàn)并未區(qū)分引發(fā)干擾素反應(yīng)的信號(hào)機(jī)制和導(dǎo)致選擇腫瘤內(nèi)狀態(tài)的長期免疫編輯。

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Spatial organization of malignant and non-malignant cell types in the tumor

為了進(jìn)一步分析癌細(xì)胞狀態(tài)和 TME 細(xì)胞之間的組織和相互作用乘盼，轉(zhuǎn)向基于測(cè)序的空間轉(zhuǎn)錄組學(xué) (ST)升熊。 與解離后獲得的 scRNA-Seq 不同——導(dǎo)致任何空間信息的丟失——基于陣列的 ST 數(shù)據(jù)不是以單細(xì)胞分辨率捕獲組織內(nèi)每個(gè)位置的 mRNA，而是每個(gè)點(diǎn)捕獲約 10 個(gè)細(xì)胞绸栅。 因此级野，試圖通過整合十個(gè)腫瘤（OVCA NYU1、OVCA NYU3粹胯、UCEC NYU3蓖柔、BRCA NYU0、BRCA NYU1风纠、BRCA NYU2况鸣、PDAC NYU1、GIST NYU1竹观、GIST NYU2镐捧、LIHC NYU1）的配對(duì)數(shù)據(jù)來利用這兩種模式的特性潜索。 十個(gè)腫瘤 ST 數(shù)據(jù)集中的每一個(gè)都由 6mm x 6mm 區(qū)域上的約 2,000 個(gè)spot（范圍從 1,351 到 2,624）組成。 ST 陣列上的光點(diǎn)相隔 100μm懂酱，能夠深入了解腫瘤微環(huán)境竹习，例如，旁分泌信號(hào)在這樣的距離內(nèi)發(fā)揮作用玩焰。

由于每個(gè)spot是一種或多種細(xì)胞類型的細(xì)胞組合由驹，因此其轉(zhuǎn)錄組可以表示為細(xì)胞類型轉(zhuǎn)錄組的加權(quán)和。 為了推斷每種細(xì)胞類型在每個(gè)點(diǎn)的貢獻(xiàn)昔园，使用來自配對(duì)單細(xì)胞數(shù)據(jù)的細(xì)胞類型的平均表達(dá)譜進(jìn)行了非負(fù)線性最小二乘 (NNLS) 回歸蔓榄。 然后，將每種細(xì)胞類型獲得的系數(shù)與隨機(jī)模型中獲得的系數(shù)進(jìn)行比較默刚，如果一個(gè)細(xì)胞的系數(shù)比隨機(jī)集中的平均值高出兩個(gè)以上標(biāo)準(zhǔn)偏差甥郑，則認(rèn)為該細(xì)胞存在于一個(gè)點(diǎn)中。 工作團(tuán)隊(duì)的病理學(xué)家（C.H. 和 D.F.D.）進(jìn)一步驗(yàn)證了這些注釋荤西。 作為進(jìn)一步分析的框架澜搅，根據(jù)它們的細(xì)胞類型注釋將斑點(diǎn)分為三類：“惡性”，僅包含惡性細(xì)胞邪锌，“正趁闾桑”，僅包含免疫細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞觅丰，以及“兩者”饵溅，包含組合。

作為一種獨(dú)立的斑點(diǎn)分類方法妇萄，還直接比較了 10 個(gè)配對(duì)數(shù)據(jù)集的spot和單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組蜕企。通過調(diào)用相互最近鄰 (MNN) 集成和聯(lián)合降維，發(fā)現(xiàn)來自兩種模態(tài)的數(shù)據(jù)得到了很好的集成冠句。單個(gè)細(xì)胞在外圍形成clusters轻掩，表明不同的細(xì)胞類型。 ST 點(diǎn)要么與單個(gè)單細(xì)胞clusters混合懦底，表示純population唇牧，要么橋接多個(gè)cluster，表示細(xì)胞類型的組合聚唐。將 NNLS 方法確定的spot類別疊加到該圖上丐重，始終觀察到“惡性”spot與惡性細(xì)胞cluster混合，“正彻安悖”spot位于非惡性細(xì)胞類型區(qū)域弥臼，“Both”spot跨越惡性和非惡性單細(xì)胞clusters宴咧。作為第二個(gè)例子根灯，LIHC ST 數(shù)據(jù)集顯示了兩個(gè)空間上不同的腫瘤結(jié)節(jié)，左側(cè)有惡性和非惡性細(xì)胞之間的大量混合，右側(cè)幾乎只有惡性細(xì)胞烙肺。聯(lián)合降維分析反映了兩個(gè)相應(yīng)的惡性clusters纳猪，當(dāng)單獨(dú)考慮單細(xì)胞降維時(shí)，它們并不明顯桃笙。該分析強(qiáng)調(diào)了整合成對(duì)的空間和單細(xì)胞數(shù)據(jù)集以在其空間環(huán)境中錨定單細(xì)胞的潛力氏堤。

為了進(jìn)一步測(cè)試 NNLS 方法注釋spot的準(zhǔn)確性，對(duì)兩個(gè)源自患者的黑色素瘤異種移植物 (PDX) 進(jìn)行了配對(duì)的 scRNA-Seq 和 ST搏明。 在這種情況下鼠锈，只有惡性細(xì)胞是人類來源的，因此表達(dá)人類基因星著，使我們能夠可靠地識(shí)別惡性細(xì)胞或spot购笆。 在完整的小鼠和人類轉(zhuǎn)錄組上使用 NNLS 方法，首先為spot身份建立了“基本事實(shí)”虚循。 然后同欠，通過將小鼠基因轉(zhuǎn)換為人類直系同源基因來模擬患者樣本，從而消除物種信息横缔。 以這種方式使用 NNLS 注釋點(diǎn)導(dǎo)致每個(gè)樣本的特異性分別為 99% 和 89%铺遂，從而支持其準(zhǔn)確性。

每個(gè)樣本中“normal”和“both”spot的存在使我們能夠query在惡性細(xì)胞存在的情況下組織的細(xì)胞類型組成如何變化茎刚。在也含有惡性細(xì)胞的spot中襟锐，內(nèi)皮細(xì)胞的比例始終較低，表明腫瘤的血管化不完全斗蒋。相反捌斧，在“both”spot中發(fā)現(xiàn)的中性粒細(xì)胞數(shù)量較多。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞被廣泛定義為 M1 - 抗腫瘤/促炎 - 和 M2 - 促腫瘤/抗炎泉沾。在單細(xì)胞數(shù)據(jù)中捞蚂，檢測(cè)到兩種巨噬細(xì)胞群，一種表達(dá)促炎基因（例如跷究，TNF姓迅、SPP1、ISG15）俊马，另一種以抗原呈遞和補(bǔ)體為特征（例如丁存，HLA-DRA、C1QA柴我、CD163） .為了比較 M1 和 M2 巨噬細(xì)胞相對(duì)于癌細(xì)胞的位置解寝，對(duì)每個(gè)包含巨噬細(xì)胞的點(diǎn)進(jìn)行評(píng)分，以了解其表達(dá)兩個(gè)群體的特征艘儒，并計(jì)算 M1-M2 分?jǐn)?shù)聋伦，這能夠比較整個(gè)點(diǎn)的巨噬細(xì)胞極性類別夫偶。在六個(gè)婦科樣本（卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌和乳腺癌）中觉增，我們發(fā)現(xiàn)“both”點(diǎn)的 M1-M2 評(píng)分明顯高于“normal”點(diǎn)兵拢，這表明在癌細(xì)胞附近具有強(qiáng)大的抗腫瘤巨噬細(xì)胞活性。這與在結(jié)直腸癌中進(jìn)行的一項(xiàng)研究的結(jié)果形成對(duì)比逾礁，該研究在腫瘤中檢測(cè)到相對(duì)于鄰近正常組織更高的 M2说铃。這些結(jié)果表明在幾個(gè) 100μms 內(nèi)存在圍繞惡性細(xì)胞的炎癥宿主反應(yīng)，突出了以高分辨率研究腫瘤結(jié)構(gòu)的價(jià)值嘹履。除了 M1/M2 二分法腻扇，巨噬細(xì)胞具有多種表型，包括促血管生成巨噬細(xì)胞和間充質(zhì)像巨噬細(xì)胞一樣砾嫉，正在成為腫瘤-免疫相互作用的關(guān)鍵參與者衙解。對(duì) T 細(xì)胞亞型（細(xì)胞毒性、輔助性和調(diào)節(jié)性）的類似分析并未顯示跨樣本的一致結(jié)果焰枢。

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Cancer cell state analysis of tumor cellular neighborhoods（空間臨近分析）

在確定了每個(gè)腫瘤內(nèi)的惡性和非惡性細(xì)胞類型之后蚓峦，接下來試圖根據(jù)癌細(xì)胞狀態(tài)來查詢細(xì)胞鄰域的組成。為此济锄，繪制了每個(gè) ST 樣本中的癌細(xì)胞狀態(tài)暑椰，對(duì)每個(gè)“惡性”點(diǎn)的每個(gè)模塊的表達(dá)進(jìn)行評(píng)分。為了確定這種評(píng)分方法的有效性荐绝，首先再次轉(zhuǎn)向 PDX 數(shù)據(jù)一汽，并對(duì)模塊表達(dá)的“惡性”點(diǎn)進(jìn)行評(píng)分。由于在該系統(tǒng)中可以明確地區(qū)分人類惡性細(xì)胞與小鼠 TME 細(xì)胞低滩，首先使用單細(xì)胞數(shù)據(jù)來確認(rèn)這些模塊由惡性細(xì)胞本身差異表達(dá)召夹，并排除了源自 TME 污染的偽影的可能性。例如恕沫，pEMT 模塊包括通常由成纖維細(xì)胞表達(dá)的基因监憎，但檢測(cè)到它存在于惡性細(xì)胞中。正如預(yù)期的那樣婶溯，干擾素反應(yīng)模塊不存在鲸阔，因?yàn)榕c Rag-/- 小鼠一樣，這些小鼠缺乏淋巴細(xì)胞迄委。

為了表征每個(gè)“惡性”點(diǎn)周圍的細(xì)胞類型組成褐筛，計(jì)算了每種細(xì)胞類型的兩個(gè)分?jǐn)?shù)指數(shù)，旨在捕捉它們的微環(huán)境叙身。 將“鄰域分?jǐn)?shù)”定義為包含該細(xì)胞類型的周圍斑點(diǎn)的分?jǐn)?shù)渔扎。 因此，該分?jǐn)?shù)直接測(cè)量相鄰點(diǎn)的細(xì)胞類型組成信轿。 鄰近度分?jǐn)?shù)衡量感興趣spot與每種細(xì)胞類型的接近程度晃痴，并計(jì)算為與該類型細(xì)胞的最短距離的倒數(shù)妓忍。

將每個(gè)腫瘤的“惡性”點(diǎn)上的模塊分?jǐn)?shù)和細(xì)胞類型鄰域圖關(guān)聯(lián)起來，揭示了 TME 的癌細(xì)胞狀態(tài)和細(xì)胞類型如何共同定位以形成“鄰域”愧旦。更密切地研究這種相關(guān)性證實(shí)了模塊評(píng)分和巨噬細(xì)胞鄰域評(píng)分之間這種正相關(guān)的重要性。當(dāng)使用鄰近分?jǐn)?shù)計(jì)算巨噬細(xì)胞的存在時(shí)定罢，也觀察到一致的關(guān)系笤虫。為了探索所有樣本的這種關(guān)系，計(jì)算了巨噬細(xì)胞鄰域的相關(guān)分?jǐn)?shù)（±log10（p 值））祖凫。與干擾素反應(yīng)的相關(guān)性在所有樣本中均為正相關(guān)琼蚯，并且對(duì)于 10 個(gè)樣本中的 8 個(gè)具有顯著性。任何其他模塊都不是這種情況惠况。這表明巨噬細(xì)胞可能會(huì)引發(fā)干擾素反應(yīng)模塊的表達(dá)遭庶，或者表達(dá)干擾素反應(yīng)的癌細(xì)胞可能會(huì)募集巨噬細(xì)胞。事實(shí)上稠屠，最近的一項(xiàng)研究表明峦睡，刺激腫瘤中的干擾素反應(yīng)途徑會(huì)導(dǎo)致巨噬細(xì)胞的募集和激活。

使用鄰域和鄰近度量將這種分析擴(kuò)展到所有細(xì)胞類型和模塊對(duì)权埠，確定了細(xì)胞狀態(tài)與 TME 細(xì)胞類型的其他一致的共定位榨了。 除巨噬細(xì)胞外，根據(jù)這兩種測(cè)量方法攘蔽，表達(dá)干擾素反應(yīng)的癌細(xì)胞與 T 細(xì)胞共定位龙屉，這與淋巴細(xì)胞導(dǎo)致干擾素反應(yīng)增加的體內(nèi)發(fā)現(xiàn)一致。 需要進(jìn)一步的工作來確定這些交互的模式和方向性满俗。 接受 EMT 的癌細(xì)胞與成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞呈正相關(guān)转捕，與其他惡性細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)，這與它們?cè)谀[瘤界面富集并與癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞相互作用的發(fā)現(xiàn)一致唆垃。

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為了進(jìn)一步研究巨噬細(xì)胞和 T 細(xì)胞與表達(dá)干擾素反應(yīng)的惡性細(xì)胞的共定位五芝，轉(zhuǎn)向 CO-Detection by indEXing (CODEX) - 一種多重蛋白質(zhì)染色測(cè)定 - 能夠以單細(xì)胞分辨率進(jìn)行空間分析。對(duì)于用于空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)的四個(gè)樣本（OVCA NYU1辕万、UCEC NYU3与柑、LIHC NYU1、GIST NYU1）蓄坏，我們對(duì) 23 個(gè)標(biāo)記進(jìn)行了染色价捧，包括 HLA-DRA 作為干擾素反應(yīng)的標(biāo)記。使用有監(jiān)督的門控策略涡戳，確定了 TME 的惡性細(xì)胞和細(xì)胞结蟋，包括巨噬細(xì)胞、T 細(xì)胞渔彰、內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞嵌屎。 PanCytokeratin (PanCK)/EPCAM 陽性細(xì)胞的一個(gè)子集也對(duì) HLA-DRA 呈陽性推正，這在蛋白質(zhì)水平上提供了 MHCII 在腫瘤的惡性細(xì)胞中差異表達(dá)的證據(jù)。因此宝惰，將惡性細(xì)胞定義為干擾素反應(yīng)陽性或陰性植榕，并比較了它們與巨噬細(xì)胞和 T 細(xì)胞的接近程度。同樣尼夺，使用鄰近度和鄰域這兩個(gè)指標(biāo)來研究細(xì)胞共定位尊残。例如，對(duì)于巨噬細(xì)胞淤堵，惡性細(xì)胞與巨噬細(xì)胞的“接近度”定義為 1/(1+距離)寝衫，取最近巨噬細(xì)胞的距離；并且“鄰域”被定義為在 100μm 半徑內(nèi)注釋為巨噬細(xì)胞的細(xì)胞分?jǐn)?shù)拐邪。對(duì)于給定樣本中的每個(gè)圖塊慰毅，使用干擾素陽性細(xì)胞和干擾素陰性細(xì)胞的平均測(cè)量值來計(jì)算對(duì)數(shù)比。對(duì)于巨噬細(xì)胞和 T 細(xì)胞扎阶，四個(gè)樣本的鄰近度和鄰域度量的平鋪對(duì)數(shù)中位數(shù)比率均為陽性汹胃，表明干擾素反應(yīng)陽性的惡性細(xì)胞相對(duì)于干擾素反應(yīng)優(yōu)先與這兩種細(xì)胞類型共定位-陰性惡性細(xì)胞。這表明至少一部分癌細(xì)胞狀態(tài)與 TME 相互作用东臀，要么由免疫細(xì)胞或基質(zhì)細(xì)胞引發(fā)统台，要么改變其周圍環(huán)境的細(xì)胞類型組成。

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Discussion

單細(xì)胞方法極大地促進(jìn)了我們對(duì)腫瘤內(nèi)異質(zhì)性的理解啡邑，一些研究已經(jīng)證明了癌細(xì)胞的狀態(tài)贱勃。 雖然在個(gè)別癌癥類型中發(fā)現(xiàn)了這種狀態(tài)，但我們?cè)谶@里提供了第一個(gè)對(duì)惡性細(xì)胞之間轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性的泛癌分析谤逼。 我們對(duì)癌癥類型的系統(tǒng)分析使我們提出了支持復(fù)發(fā)性癌細(xì)胞狀態(tài)的基因模塊的統(tǒng)一catalog贵扰。 基于對(duì)個(gè)別癌癥類型的研究結(jié)果，確定了涵蓋此處研究的 15 種癌癥類型的 16 個(gè)模塊 - 包括循環(huán)流部、壓力反應(yīng)戚绕、干擾素反應(yīng)、缺氧和 pEMT - 以及對(duì)特定器官系統(tǒng)中的細(xì)胞特性更具體的模塊 - 包括 基底枝冀、鱗狀舞丛、腺狀和纖毛分化。 我們預(yù)計(jì)未來的工作將擴(kuò)大癌細(xì)胞狀態(tài)及其癌癥類型或器官類型特異性以及泛癌特征的列表果漾。

癌細(xì)胞狀態(tài)不能明確定義為細(xì)胞類型球切。 結(jié)果表明，這可能來自模塊組合的表達(dá)：由于這些通常不是相互排斥的绒障，這導(dǎo)致連續(xù)變化而不是離散cluster吨凑。 相反，當(dāng)基因模塊與其他基因模塊相互排斥時(shí)，可能會(huì)觀察到不同的狀態(tài)鸵钝，如循環(huán)和纖毛基因模塊的情況糙臼。 因此，我們的分析支持這樣一種觀點(diǎn)恩商，即腫瘤轉(zhuǎn)錄變異的基本單位是基因模塊变逃，其組合產(chǎn)物定義了癌細(xì)胞狀態(tài)。 需要進(jìn)一步的工作來解開與基因模塊在確定細(xì)胞狀態(tài)時(shí)的共表達(dá)和互斥性方面相關(guān)的關(guān)系怠堪。

在癌細(xì)胞中觀察到的許多異質(zhì)性似乎是由于重新部署了通常在其他細(xì)胞和發(fā)育環(huán)境中表達(dá)的模塊揽乱。 事實(shí)上，我們的癌癥基因模塊目錄包括細(xì)胞生理學(xué)（循環(huán)）研叫、特定過程和反應(yīng)（應(yīng)激、缺氧璧针、氧化磷酸化嚷炉、干擾素和金屬反應(yīng)）和發(fā)育程序（EMT、肺泡探橱、基底申屹、鱗狀、腺體隧膏、 纖毛哗讥、AC 樣、OPC 樣胞枕、NPC 樣）杆煞。 相對(duì)于它們的正常對(duì)應(yīng)物，癌細(xì)胞利用現(xiàn)有的基因模塊腐泻，以不同的水平和更異質(zhì)的方式表達(dá)它們决乎。 例如，干擾素反應(yīng)模塊雖然通常與對(duì)病原體的細(xì)胞免疫反應(yīng)相關(guān)派桩，但在惡性細(xì)胞中被異質(zhì)激活构诚。

目前尚不清楚癌細(xì)胞之間的異質(zhì)性在多大程度上是由它們接收的信號(hào)的異質(zhì)性引起的，或者是由于細(xì)胞之間的內(nèi)在差異——遺傳的铆惑、表觀遺傳的或隨機(jī)的范嘱。我們對(duì)多種癌癥類型的癌癥狀態(tài)的觀察提供了證據(jù)，表明癌細(xì)胞狀態(tài)不是由基因定義的员魏，而是代表細(xì)胞可塑性定躏。此外，體外和體內(nèi)研究表明柒爸，癌細(xì)胞表現(xiàn)出高度的可塑性萄涯，可以從一種狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榱硪环N狀態(tài)。特別是闻书，由單一狀態(tài)播種的群體恢復(fù)與原始腫瘤相同的狀態(tài)比例名斟。因此脑慧，雖然各個(gè)state的身份具有高度可塑性，但它們的整體分布可能是一個(gè)穩(wěn)定的屬性砰盐。有趣的是闷袒，在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中，具有不同遺傳驅(qū)動(dòng)因素的腫瘤具有相同的狀態(tài)集岩梳，但每種狀態(tài)的比例不同囊骤。根據(jù)這種觀點(diǎn)，腫瘤發(fā)生的早期階段會(huì)產(chǎn)生致癌背景冀值，隨后的表觀遺傳變化將導(dǎo)致惡性人群之間的異質(zhì)性也物。

在這里確定的幾個(gè)基因模塊可能會(huì)啟用 Hanahan 和 Weinberg 提出的標(biāo)志，從而提高癌癥標(biāo)志不需要由所有單個(gè)細(xì)胞組裝的可能性列疗。相反滑蚯，細(xì)胞狀態(tài)可能會(huì)在腫瘤生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行相互作用，從而導(dǎo)致整個(gè)腫瘤具有更高的適應(yīng)度抵栈。例如告材，血管生成的誘導(dǎo)或免疫監(jiān)視的下調(diào)可能由一部分癌細(xì)胞介導(dǎo)，以造福于其他細(xì)胞古劲。為了理解這些復(fù)雜的關(guān)系斥赋，至關(guān)重要的是要考慮腫瘤的物理限制，包括相鄰細(xì)胞之間的信號(hào)傳導(dǎo)产艾、氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)的擴(kuò)散疤剑，以及分離到具有不同成分的壁龕中。觀察到的干擾素反應(yīng)表達(dá)細(xì)胞與 T 細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的共定位突出表明闷堡，可以通過分析腫瘤結(jié)構(gòu)來理解癌細(xì)胞狀態(tài)的功能作用骚露。最近的研究還表明，在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中缚窿，巨噬細(xì)胞在惡性細(xì)胞中引發(fā)間充質(zhì)狀態(tài)棘幸。此外，在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌中倦零，發(fā)現(xiàn)表達(dá) pEMT 的細(xì)胞位于腫瘤的前緣误续，這一發(fā)現(xiàn)似乎適用于幾種癌癥類型。

癌癥中干擾素反應(yīng)的存在已被廣泛研究扫茅，并已嘗試?yán)迷摲磻?yīng)進(jìn)行治療蹋嵌。 在這里，發(fā)現(xiàn)參與干擾素反應(yīng)的基因在此處研究的所有 15 種癌癥類型的腫瘤的惡性細(xì)胞中被共同調(diào)節(jié)和異質(zhì)表達(dá)葫隙，這表明這種狀態(tài)的存在是腫瘤發(fā)生的必要特征栽烂。 事實(shí)上，缺乏 IFNγ 受體的腫瘤無法在小鼠模型中發(fā)育。 然而腺办，矛盾的是焰手，在同時(shí)含有干擾素反應(yīng)性和無反應(yīng)性細(xì)胞的腫瘤中，無反應(yīng)性細(xì)胞的頻率增加怀喉。 因此书妻，表達(dá)干擾素反應(yīng)模塊的細(xì)胞亞群似乎支持腫瘤內(nèi)其他細(xì)胞的生長。 這可以通過這些基因的雙重功能來解釋 - MHCI 和 MHCII 引發(fā)細(xì)胞的免疫檢測(cè)增強(qiáng)躬拢，但 PDL1 導(dǎo)致免疫耐受性的普遍增加躲履。

Understanding cancer cell states has critical implications for therapeutic advances, as intratumoral heterogeneity is a recognized cause of treatment failure and relapse. In particular, the study of the relationships between cancer cell states and the TME – with an emphasis on immune cell populations – may shed light on the contribution of heterogeneity to tumor fitness, and highlight vulnerabilities that can be exploited for targeted therapy

Method（有一些分析方法需要額外關(guān)注）

細(xì)胞注釋

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識(shí)別惡性細(xì)胞

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NMF(重點(diǎn))

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Module annotation and receptor-ligand analysis

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空間轉(zhuǎn)錄組解卷積（NNLS）

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空間位點(diǎn)注釋

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生活很好，有你更好