眾所周知，一個公司開通公眾號的目的肯定是營銷坏晦，我們也是（真的）椿每。小編給自己起了個名字“BigM”后就開始想方案。著名的營銷學(xué)之父Philip Kotler認(rèn)為“優(yōu)秀的企業(yè)滿足需求英遭，杰出的企業(yè)創(chuàng)造市場”间护。
所以BigM覺得先要用通俗易懂的語言，把什么是單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序給大家講懂了挖诸，才能激發(fā)你們的需求汁尺，創(chuàng)造我們的市場。就這樣多律，我們的第一個系列板塊“白話單細(xì)胞”誕生了痴突，代號Vernacular（白話）。
通常我們搜索單細(xì)胞測序時狼荞，十家公司中有九家都會展示封面這張微流控示意圖辽装，告訴大家我們用的是最主流且穩(wěn)定的10x Genomics單細(xì)胞捕獲技術(shù)（當(dāng)然，奇景生物也是這么做的）相味。今天咱們的主角就是這張圖拾积，先說一說這神奇的微流控技術(shù)怎么就能捕獲單細(xì)胞了？
? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?圖1
要捕獲單細(xì)胞先得準(zhǔn)備幾樣?xùn)|西丰涉，主要是Gel Beads拓巧、Oil和要被捕獲的細(xì)胞們（Cells）。圖1中從管道左側(cè)進(jìn)入的小圓球就是Gel Beads一死，五顏六色可不是為了好看肛度，而是代表著每個Gel Beads都不一樣。
? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 圖2
每個Gel Bead表面都長著非常多的小觸角（Primer）投慈，常用的是圖2右側(cè)最上面那種Poly(dT) primer承耿。區(qū)分細(xì)胞的關(guān)鍵就在圖2中綠色的10x BC（Barcode序列標(biāo)簽），同一個Gel Bead上的小觸角中Barcode序列完全相同伪煤。而圖2中橙色的UMI序列標(biāo)簽用于測序后定量加袋，同一個Gel Bead上的小觸角中UMI各不相同。Poly(dT)就不用說了带族，抓細(xì)胞中帶PloyA尾的那些RNA用的锁荔。
? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?圖3
萬事俱備，只欠東風(fēng)。這東風(fēng)來自空氣泵阳堕，可以將Gel Beads和Cells均勻的沿著不同微流控孔道進(jìn)行推送跋理，一個Gel Bead遇到一個Cell，最終在油井（圖1中Oil in Well）里配對結(jié)緣形成“油包水”結(jié)構(gòu)恬总。接下來發(fā)生的事情就順理成章了前普，Gel Beads釋放內(nèi)部的化學(xué)物質(zhì)使細(xì)胞破裂并釋放RNA。小觸角用Poly(dT)抓住帶PloyA尾的RNA壹堰，通過反轉(zhuǎn)錄形成cDNA拭卿，并帶上了Barcode和UMI標(biāo)簽（圖3）。
測序得到的序列（Reads）中贱纠，不僅有RNA序列峻厚，還有對應(yīng)的Barcode和UMI標(biāo)簽。RNA序列與參考基因組比對谆焊，確定來自于哪個基因惠桃。同時，將這些序列按照Barcode歸歸類辖试，相同Barcode的序列來自于同一個細(xì)胞辜王。另外，還記得嗎罐孝？Gel Bead上UMI各不相同呐馆，如果同一個細(xì)胞中的序列有相同的UMI，那大概率是PCR引入的重復(fù)莲兢，我們只計數(shù)一次汹来，矯正計數(shù)的準(zhǔn)確性。這樣怒见，我們就得到了單個細(xì)胞維度俗慈，不同基因的準(zhǔn)確表達(dá)量了。
看到這里10x Genomics單細(xì)胞捕獲的原理差不多講完了遣耍，如果大伙覺得聽明白了，請關(guān)注+轉(zhuǎn)發(fā)炮车，BigM吃個雞腿以后還能再講三百回合舵变。想上“提高班”的話，可以留下來再聽兩句瘦穆。
10x Genomics技術(shù)確實不錯纪隙，但會出現(xiàn)哪些常見問題？
01 多細(xì)胞｜細(xì)胞們不一定會老老實實的束手就擒扛或，總會做一些搗亂的事情绵咱，比如多個細(xì)胞和一個Gel Bead配對形成油包水結(jié)構(gòu)。來自多個細(xì)胞的RNA熙兔，由于具有相同的Barcode悲伶，會被認(rèn)為是單個細(xì)胞的RNA表達(dá)量艾恼，影響后續(xù)分析。這樣該怎么辦呢麸锉？
拆招：微流控推送Gel Beads的速率通常會高于細(xì)胞钠绍，寧愿找不到細(xì)胞配對，也別讓多個細(xì)胞爭搶一個Gel Bead花沉。通過這種方法柳爽，每一萬個細(xì)胞中多細(xì)胞率通常可以控制在4%以下碱屁。除此之外磷脯，我們在分析中也可以使用DoubletFinder等軟件，從算法上預(yù)測多細(xì)胞數(shù)據(jù)娩脾，并進(jìn)行去除赵誓。
02? 背景噪音｜等待被捕獲的Cells之間，混有一些游離的RNA晦雨。（這種情況如何去除）這些RNA與細(xì)胞一起進(jìn)入油包水結(jié)構(gòu)架曹，并被標(biāo)記上Barcode和UMI進(jìn)行測序。甚至油包水結(jié)構(gòu)中沒有細(xì)胞闹瞧，而只有游離RNA被捕獲測序绑雄。
拆招：在樣本獲取、運輸奥邮、制備過程中万牺，保證細(xì)胞活性，避免死亡或破碎細(xì)胞中的RNA游離出來洽腺。同時脚粟，對于細(xì)胞活性較低的樣本，我們也可以采用去死細(xì)胞的方法對樣本進(jìn)行處理蘸朋，提高細(xì)胞活性核无。除此之外，在Cell Ranger進(jìn)行單細(xì)胞測序數(shù)據(jù)分析環(huán)節(jié)藕坯，我們也可以對背景噪音進(jìn)行去除团南。
關(guān)注+轉(zhuǎn)發(fā)，下期“Vernacular｜白話單細(xì)胞”再約炼彪。
