原創(chuàng) 二由 [單細胞天地] 2022-05-19 20:00

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文章題目：A Cd9⁺Cd271⁺ stem/progenitor population and the SHP2 pathway contribute to neonatal-to-adult switching that regulates tendon maturation
期刊：Cell Reports
影響因子: 1區(qū) 9.423
發(fā)表時間: 2022年4月26日
DOI：https://doi.org/10.1016/j.celrep.2022.110762

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文獻概述

問題：成熟腱鞘的再生能力低研侣，受傷的肌腱很少能完全恢復(fù)。恢復(fù)功能性肌腱需要更全面地了解肌腱成熟的細胞和分子機制鞭缭。與我們對胚胎期肌腱發(fā)育的深入了解相比消痛，對肌腱的成熟知之甚少钩述。

方法：結(jié)合了跟腱體內(nèi)模型，單細胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)和功能驗證

結(jié)論：第7-14天是肌腱成熟的關(guān)鍵過渡階段故爵，神經(jīng)生長因子（NGF）分泌Cd9⁺Cd271⁺干細胞/祖細胞群和受體酪氨酸激酶（RTK）信號通路腰懂，主導(dǎo)這一過程梗逮。而SHP2是RTK信號傳導(dǎo)的關(guān)鍵成分，影響肌腱成熟悯恍。

圖片摘要

實驗結(jié)果

第7天（P7）至P14是肌腱成熟的關(guān)鍵階段

肌腱隨時間逐漸發(fā)展成熟库糠。為了系統(tǒng)地評估肌腱成熟，比較了P1涮毫，P4瞬欧，P7，P10罢防，P14和P28的跟腱艘虎。P1處圓形核細胞浸潤了新生兒肌腱。從P1到P4咒吐，細胞表現(xiàn)出逐漸細長的核形態(tài)野建。細胞數(shù)量從P1到P14逐漸減少。到P28時恬叹，每個區(qū)域只剩下幾個細胞候生。細胞外基質(zhì)在產(chǎn)后肌腱生長期間在P7處開始可見卷曲生長，并在P14處變得明顯绽昼。在發(fā)育過程中纖維直徑的變化也增加了唯鸭，新生兒肌腱僅由均勻的膠原纖維組成。

圖

在此過程中基因表達的變化硅确，重點是細胞分化（Scx目溉，Mkx，Egr1和Nes）和基質(zhì)產(chǎn)生（Col1a1和Tnmd）基因菱农。在不同的時間點進行了主成分分析（PCA）缭付。前兩個組分在不同的時間點（P4和P7與P14和P28）適當?shù)胤蛛x肌腱組織，P10位于中間循未。PCA圖（G）顯示了P7-P14時間軸上的過渡陷猫。結(jié)果表明，P7-P14是產(chǎn)后肌腱成熟過程的關(guān)鍵過渡狀態(tài)。

scRNA-seq確定了早期產(chǎn)后肌腱的細胞異質(zhì)性

在P7和P14處對小鼠尾部肌腱細胞進行了scRNA-seq绣檬。從800個單細胞經(jīng)過濾后得到734個細胞舅巷，并分組為六個細胞群『友剩基于差異表達基因的生物學(xué)功能和肌腱相關(guān)基因的表達注釋：肌腱成纖維細胞1（簇0），肌腱成纖維細胞2（簇1）赋元，肌腱成纖維細胞3（簇2）忘蟹，干細胞（簇3），增殖細胞（簇4）和神經(jīng)元細胞（簇5）搁凸。

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三個肌腱成纖維細胞簇高度表達的I型膠原蛋白（Col1a1和Col1a2----原纖維細胞外基質(zhì)（ECM）的基本構(gòu)成）媚值。由于最大的簇0（n = 255）主要由P7肌腱細胞和高度表達的胚胎基因Pbx4組成，因此該組為未成熟的細胞簇护糖。來自0簇細胞參與核糖核蛋白復(fù)合物的生物合成和mRNA代謝過程的調(diào)節(jié)褥芒，表明早期產(chǎn)后肌腱細胞生長的活性生物合成特征。肌腱成纖維細胞2（簇1嫡良，n = 187）和肌腱成纖維細胞3（簇2锰扶，n = 158）主要由來自P14的細胞組成，兩者都顯示出經(jīng)典ECM基因的高表達（Tnmd寝受、Fmod 和 Thbs4）坷牛，為成熟細胞簇。簇1中的細胞也高度表達Fbn1和Mfap5很澄，與膠原原纖維組織有關(guān)京闰。相反，簇2中的細胞主要由于機械刺激而表現(xiàn)出富集甩苛，對應(yīng)于Sparc和Serpinf1的高表達（但是這個在簇1中表達也很高）蹂楣。其余三簇主要來自P7肌腱。將簇3（n = 66）注釋為具有高表達干細胞相關(guān)基因：Pou3f1（Oct6）讯蒲，Thy1（Cd90）痊土，Nes和Ly6a（Sca-1），GO顯示在“干細胞群維持”中也顯著富集爱葵。將簇4（n = 37）分配為具有特異性表達增殖標記Mki67的增殖細胞和G2M細胞周期階段的高得分施戴。神經(jīng)元細胞（簇5（n = 31）高度表達神經(jīng)元標志物Sox2 和 Nrgn，GO富集到了“神經(jīng)發(fā)生調(diào)節(jié)”的生物過程萌丈。

在P7和P14肌腱中發(fā)現(xiàn)了Cd9⁺Cd271⁺ TSPC亞群和RTK信號通路

為了進一步表征未成熟肌腱和成熟肌腱之間的差異赞哗，亞群進一步聚類。未成熟的肌腱細胞簇（簇0）可以進一步細分為6個簇辆雾。亞簇0和1中的細胞表現(xiàn)出典型腱細胞基因的高表達肪笋，如Col1a1，Fmod，Lum和Tnmd藤乙。亞簇0也呈現(xiàn)出間充質(zhì)祖標記物Cd9的高表達猜揪，因此被注釋為Cd9亞群，也表達軟骨細胞相關(guān)基因（如Sox9坛梁，Acan和Col2a1）而姐。Cd9細胞主要參與對缺氧，ECM組織和軟骨細胞肥大的反應(yīng)划咐。P7和P14肌腱中都存在Cd9簇拴念。Cd9細胞主要富集于細胞周期停滯、干細胞分化褐缠、胚胎形態(tài)發(fā)生和發(fā)育成熟途徑政鼠。還高表達早期腱細胞的代表性標志物Scx，Mkx和Tnc队魏。亞簇2和亞簇3高度表達的間充質(zhì)干細胞標記物公般，如Thy1（Cd90），Cd44和Ly6a（Sca-1）胡桨。亞簇2也高度表達肌腱標志物Nes官帘，因此被指定為Nes TSPCs。亞簇3顯示出內(nèi)皮標志物（如Cd34和Pdgfra）的高表達昧谊，因此被注釋為內(nèi)皮簇遏佣。在未成熟的肌腱細胞中鑒定出一個具有Krt2，Krt10和Krt1高表達的上皮簇（亞簇4）和一個免疫細胞簇（亞簇5）揽浙，具有高表達的巨噬細胞標志物Cd68和趨化因子CCL9状婶。

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Nes TSPC，Txnip和Cd9簇表現(xiàn)出最強的細胞通訊馅巷。其中膛虫，Nes TSPC和Txnip簇顯示出最多的細胞間相互作用。相比之下钓猬，免疫和上皮細胞簇與其他簇的相互作用最弱稍刀，表明它們的環(huán)境支持作用。

中間的Cd9⁺Cd271⁺ TSPC群體通過RTK信號通路驅(qū)動未成熟肌腱過渡

擬時序分析顯示肌腱的增殖和干細胞群在開端敞曹，而成熟的肌腱成纖維細胞2和肌腱成纖維細胞3簇的P14在軌跡末端账月。（這里又是最開始的單細胞數(shù)據(jù)）

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對DEG進行了聚類分了五組。簇1中的基因從一開始就下降澳迫，主要是細胞分裂（Mki67局齿，Top2a和Prc1）的調(diào)節(jié)和參與形態(tài)發(fā)生（Gal）的發(fā)育生長。簇2中的基因主要參與調(diào)節(jié)細胞分化（Thy1和Nes）和凋亡過程（Bax和Cav1）橄登，表現(xiàn)出沿偽時間軸逐漸下調(diào)抓歼。簇3和4基因最初上調(diào)讥此，然后下調(diào)，分別與上皮到間充質(zhì)的轉(zhuǎn)變（Notch1谣妻，Foxa1和Fuz）和絲裂原激活蛋白激酶（MAPK）活性（Cybb萄喳，Mapk311，Ret和Dusp5）的激活有關(guān)蹋半。最后他巨，簇5中的基因在成熟過程結(jié)束時達到峰值，參與ECM組織（Ctsk减江，Prg4和Thbs4）闻蛀，對缺氧的反應(yīng)（Ang和Loxl2）以及對機械刺激的細胞反應(yīng)（Dcn和Serpine2）。免疫熒光染色結(jié)果證實您市，PRG4和THBS4的表達從第7天增加到第14天。

將細胞分為三種不同的狀態(tài)：早期役衡，中期和晚期茵休。中間過渡狀態(tài)下Cd9Cd271簇的比例顯著增加，在成熟后期狀態(tài)下降低手蝎。TGF-β和RTK信號通路主要在中期和后期得到豐富榕莺。具體而言，與早期狀態(tài)相比棵介，F(xiàn)GF信號通路钉鸯，血小板衍生生長因子（PDGF）信號通路和NGF通路在中間狀態(tài)下富集。與中間階段相比邮辽，只有胰島素生長因子（IGF）信號通路在晚期得到增強唠雕。Tgfb2從早期到后期被下調(diào)。Pdgfra從中間階段上調(diào)到晚期吨述，而其配體Pdgfa表達降低岩睁。Ngf，Igf1和Fgfr1促進肌腱成熟揣云。

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NGF能有效促進肌腱成熟

在肌腱成熟期間激活了幾種RTK家族生長因子信號通路捕儒。選擇FGF，PDGF-AA邓夕，IGF1和NGF來驗證它們在肌腱成熟過程中的作用刘莹。采用了組織外植體模型。首先檢查了這些生長因子治療組中肌腱相關(guān)基因的表達焚刚。qRT-PCR結(jié)果顯示点弯，Tnmd在所有生長因子處理組中的表達均增加。然而矿咕，只有NGF治療組顯示肌腱主TF Scx的表達顯著增加蒲拉，免疫熒光染色結(jié)果進一步驗證了這一點肃拜。NGF治療還上調(diào)了其他肌腱相關(guān)基因的表達，如Col1a1雌团，Col3a1燃领，Bgn和Dcn。主要在成熟腱細胞中表達的Prg4也顯著上調(diào)锦援。NGF組膠原纖維的平均直徑及分布范圍顯著大于對照組猛蔽。這些發(fā)現(xiàn)全面證明NGF信號傳導(dǎo)可以有效促進肌腱成熟。

后面還有一部分就是實驗驗證了SHP2參與肌腱成熟期間NGF觸發(fā)的信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)并在其中發(fā)揮不可或缺的作用灵寺。

總結(jié)

1. 系統(tǒng)地評估肌腱成熟的關(guān)鍵過渡階段
2. 揭示肌腱成熟期間細胞組成
3. NGF 分泌性 Cd9⁺Cd271⁺ TSPC 介導(dǎo)關(guān)鍵性過渡階段
4. NGF/SHP2 通路調(diào)節(jié)肌腱成熟