hello，大家好慧库，我這個(gè)loser又來了跷跪，又是單細(xì)胞空間聯(lián)合，不知道大家的單細(xì)胞空間數(shù)據(jù)分析的怎么樣了齐板？吵瞻？？發(fā)文章了沒甘磨？橡羞？？

今天我們分享的文獻(xiàn)在Temporal and spatial dynamics mapping reveals follicle development regulated by different stromal cell populations济舆，希望有朝一日卿泽，我也可以成為知識(shí)的創(chuàng)造者~~~~

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Abstract

follicle發(fā)育是一個(gè)復(fù)雜的動(dòng)態(tài)過程。follicle被包裹在基質(zhì)中滋觉，一旦follicle發(fā)育签夭，follicle就會(huì)在不斷生長(zhǎng)的過程中從皮層移動(dòng)到髓質(zhì)齐邦，最后到達(dá)皮層排卵。許多這些過程不能僅用毛囊來解釋覆致。通過對(duì)小鼠出生后follicle發(fā)育關(guān)鍵時(shí)間點(diǎn)的單細(xì)胞和空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序侄旬，發(fā)現(xiàn)ovarian基質(zhì)細(xì)胞不僅是構(gòu)成 ovarian的主要細(xì)胞群之一，其細(xì)胞群和空間位置也與follicle發(fā)育密切相關(guān)煌妈。通過對(duì)細(xì)胞通訊的分析發(fā)現(xiàn)， ovarian基質(zhì)細(xì)胞是細(xì)胞間通訊的主要傳遞者宣羊，它們發(fā)出的許多信號(hào)被顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞接收璧诵，參與follicle發(fā)育。 ovarian基質(zhì)細(xì)胞不是同質(zhì)細(xì)胞群仇冯。將單細(xì)胞類型與其空間位置信息相結(jié)合之宿，將 ovarian基質(zhì)細(xì)胞分為四種類型，即結(jié)構(gòu)性基質(zhì)細(xì)胞苛坚、濾泡周基質(zhì)細(xì)胞、基質(zhì)祖細(xì)胞和類固醇基質(zhì)細(xì)胞，每種類型在follicle發(fā)育中發(fā)揮不同的功能席赂。對(duì)不同空間位置和不同類型基質(zhì)細(xì)胞的深入研究將擴(kuò)大對(duì)follicle發(fā)育動(dòng)態(tài)的理解裕循，為 ovarian相關(guān)疾病的治療帶來新的靶點(diǎn)和新方法。

Introduction

ovarian由兩部分組成：實(shí)質(zhì)和間質(zhì)娇昙。follicle是 ovarian的功能單位尺迂，包括 ovarian實(shí)質(zhì)，決定了女性的生殖壽命冒掌。它由卵母細(xì)胞和嵌入 ovarian基質(zhì)中的體細(xì)胞層（顆粒細(xì)胞和膜細(xì)胞）組成噪裕。 ovarian的大部分，包括皮質(zhì)和髓質(zhì)股毫，由具有不同特征的基質(zhì)組成膳音。大多數(shù)follicle嵌入 ovarian皮質(zhì)的基質(zhì)中，并在 ovarian髓質(zhì)的基質(zhì)中成熟铃诬。歷史上祭陷， ovarian生物學(xué)的研究主要集中在受卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞（GCs）控制的follicle發(fā)生上，而follicle發(fā)生中存在許多未解決的問題氧急，僅靠這兩種細(xì)胞類型無法解釋颗胡。除了構(gòu)成follicle的細(xì)胞外，嵌入follicle的 ovarian基質(zhì)對(duì)follicle發(fā)生有很大貢獻(xiàn)吩坝，但沒有得到足夠的重視毒姨，因?yàn)樗抢斫鈌ollicle發(fā)生復(fù)雜過程的關(guān)鍵。

ovarian基質(zhì)由一般成分組成钉寝，例如免疫細(xì)胞弧呐、血管闸迷、神經(jīng)、細(xì)胞外基質(zhì)和未完全表征的基質(zhì)細(xì)胞的混合群體俘枫。大部分 ovarian基質(zhì)包含未完全表征的基質(zhì)細(xì)胞腥沽，包括成纖維細(xì)胞樣、梭形細(xì)胞形和間質(zhì)細(xì)胞鸠蚪。ovarian基質(zhì)細(xì)胞在follicle發(fā)生中具有重要作用今阳，特別是在原始follicle的激活和膜細(xì)胞的分化中。次級(jí)follicle可以使用體外培養(yǎng)系統(tǒng)單獨(dú)生長(zhǎng)茅信，而原始和初級(jí)follicle必須在含有基質(zhì)成分的器官培養(yǎng)物中激活盾舌。此外，所有在體外培養(yǎng)后成功生產(chǎn)人中期 II (MII) 卵子的研究都使用機(jī)械方法而不是酶消化來從 ovarian組織中分離follicle蘸鲸，因?yàn)槊赶瘯?huì)對(duì)follicle造成損害妖谴，同時(shí)還能保持殘留基質(zhì)細(xì)胞的緊密結(jié)合，這些細(xì)胞與follicle進(jìn)行密集的細(xì)胞間通訊酌摇，并可能具有分化成其他關(guān)鍵細(xì)胞類型的能力膝舅，例如膜細(xì)胞。此外窑多，基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)可以改善早期follicle的生長(zhǎng)和存活仍稀，這對(duì)于將體外培養(yǎng)系統(tǒng)成功轉(zhuǎn)化為靈長(zhǎng)類動(dòng)物和人類follicle至關(guān)重要。 ovarian基質(zhì)細(xì)胞不僅為follicle發(fā)育提供結(jié)構(gòu)支持怯伊，而且與follicle具有復(fù)雜的雙向旁分泌信號(hào)琳轿。幾種生長(zhǎng)因子是follicle發(fā)生的關(guān)鍵調(diào)節(jié)分子，包括成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子耿芹、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 β崭篡、血小板衍生生長(zhǎng)因子、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子和胰島素樣生長(zhǎng)因子吧秕。然而琉闪，follicle和基質(zhì)細(xì)胞之間的特定細(xì)胞 - 細(xì)胞分泌信號(hào)仍不清楚。

盡管有這些新見解砸彬，但對(duì) ovarian基質(zhì)細(xì)胞的理解仍然有限颠毙，許多問題仍未得到解答。 ovarian基質(zhì)細(xì)胞的不完整表征和分類導(dǎo)致研究中的混淆砂碉，這些研究報(bào)告了有關(guān)基質(zhì)細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)而沒有進(jìn)一步鑒定蛀蜜。 ovarian基質(zhì)細(xì)胞不是指單個(gè)同質(zhì)細(xì)胞群。最近的單細(xì)胞 RNA 測(cè)序 (scRNA-seq) 研究證實(shí)了多個(gè)基質(zhì)細(xì)胞clusters的存在增蹭，但缺乏對(duì)整個(gè) ovarian基質(zhì)細(xì)胞類型的全面和完整的表征滴某。基質(zhì)細(xì)胞的分布和亞型可能會(huì)因其在 ovarian中的位置而異（例如，皮質(zhì)與髓質(zhì)）霎奢。隨著follicle的生長(zhǎng)和排卵以及黃體的發(fā)育户誓，基質(zhì)細(xì)胞的分布也可能發(fā)生變化，伴隨著周期性的結(jié)構(gòu)變化幕侠。整個(gè)生殖壽命的變化也很明顯帝美，包括纖維化膠原蛋白的增加，如老年小鼠晤硕、女性和靈長(zhǎng)類動(dòng)物的 ovarian所示悼潭。對(duì)于這些不完全表征的基質(zhì)細(xì)胞類型，仔細(xì)的本體論舞箍、進(jìn)一步的標(biāo)記識(shí)別以及對(duì)區(qū)域細(xì)微差別的關(guān)注是關(guān)鍵的下一步女责。

scRNA-seq雖然可以在單細(xì)胞水平獲得基因“時(shí)間動(dòng)態(tài)表達(dá)”的信息，但還是不可避免地丟失了組織樣本的空間信息创译。 因此，無法獲得有關(guān)基質(zhì)細(xì)胞的足夠信息墙基，因?yàn)樗鼈冊(cè)趂ollicle發(fā)育過程中表現(xiàn)出空間變化软族。 隨著空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，分析有能力更好地表征 ovarian基質(zhì)細(xì)胞和follicle發(fā)育過程中的變化残制，并且隨著研究人員了解它們?cè)谏砗筒±磉^程中的個(gè)體作用立砸，可以用更精確的名稱來指代它們。 因此初茶，進(jìn)行了 scRNA-seq 和空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析颗祝，涵蓋了代表不同follicle發(fā)育階段的五個(gè)重要時(shí)間過程，以充分了解 ovarian基質(zhì)細(xì)胞在follicle發(fā)育中的作用恼布，并完全表征和分類 ovarian基質(zhì)細(xì)胞螺戳。

在這項(xiàng)研究中，生成了小鼠出生后 ovarian follicle發(fā)育的單細(xì)胞圖譜和時(shí)空基因表達(dá)動(dòng)態(tài)折汞，闡明了 ovarian基質(zhì)細(xì)胞在follicle發(fā)育中的重要作用倔幼。 細(xì)胞間通訊分析描繪了follicle發(fā)育不同階段的細(xì)胞類型組之間復(fù)雜的細(xì)胞間通訊關(guān)系，并揭示 ovarian基質(zhì)細(xì)胞是 ovarian中調(diào)節(jié)follicle發(fā)育的主要外向信號(hào)細(xì)胞類型爽待。 將 ovarian基質(zhì)細(xì)胞完全表征為四個(gè)亞群损同，即結(jié)構(gòu)基質(zhì)細(xì)胞、濾泡周基質(zhì)細(xì)胞鸟款、基質(zhì)祖細(xì)胞和類固醇基質(zhì)細(xì)胞膏燃，并進(jìn)一步進(jìn)行標(biāo)記鑒定。 這些基質(zhì)細(xì)胞亞群中的每一個(gè)在follicle發(fā)育中發(fā)揮不同的作用何什。

Result

A single-cell map and spatiotemporal gene expression dynamics of follicle development in the postnatal ovaries of mice

為了生成小鼠 ovarian的細(xì)胞圖组哩，說明follicle發(fā)育過程中的時(shí)間和空間變化，通過單細(xì)胞 RNA 測(cè)序 (scRNA-seq) 和空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法（10× Genomics Visium 載玻片和高分辨率顯微鏡）。 五個(gè)時(shí)間點(diǎn)的 ovarian被整合到scRNA-seq 分析中：出生后第 3 天禁炒、第 5 天而咆、第 7 天、3 周和 8 周幕袱。 三個(gè)時(shí)間點(diǎn)的 ovarian被整合到 10× Visium 分析中：出生后第 7 天暴备、第 3 周和第 8 周。 后一種方法允許探索follicle發(fā)育中的細(xì)胞特征们豌，以獲得詳細(xì)的細(xì)胞群和時(shí)間變化涯捻。

能夠生成 58,319 個(gè)細(xì)胞的 ovarian圖譜，并根據(jù)其標(biāo)記的表達(dá)識(shí)別出 21 個(gè)被分配細(xì)胞身份的clusters望迎。 為了進(jìn)一步識(shí)別clusters障癌，根據(jù)已知的細(xì)胞類型標(biāo)記基因分配clusters。 細(xì)胞特異性標(biāo)記基因是卵母細(xì)胞（Sycp3）辩尊、顆粒細(xì)胞（Amhr2）涛浙、基質(zhì)細(xì)胞（Col1a1）、內(nèi)皮細(xì)胞（Cdh5）摄欲、上皮細(xì)胞（Krt19）轿亮、免疫細(xì)胞（Ptprc）、平滑肌細(xì)胞（Des）和 類固醇生成細(xì)胞 (Ptgfr)胸墙。 這些clusters可分為九個(gè)主要細(xì)胞類別：（i）基質(zhì)細(xì)胞我注，（ii）顆粒細(xì)胞，（iii）卵母細(xì)胞迟隅，（iv）內(nèi)皮細(xì)胞但骨，（v）上皮細(xì)胞，（vi）免疫細(xì)胞智袭，（vii）平滑細(xì)胞 肌肉細(xì)胞奔缠，（viii）類固醇生成細(xì)胞，和（ix）未定義的體細(xì)胞补履。 為了進(jìn)一步獲得基因特征的動(dòng)態(tài)模式添坊，鑒定了九個(gè)主要的細(xì)胞類別clusters特異性標(biāo)記基因。 在這些細(xì)胞類型中箫锤，基質(zhì)細(xì)胞和GCs占了絕大多數(shù)贬蛙。

為了系統(tǒng)地繪制由 scRNA-seq 識(shí)別的細(xì)胞類型在 ovarian內(nèi)的位置，使用了 10× Visium Spatial Transcriptomics 技術(shù)谚攒。在第 7 天阳准、第 3 周和第 8 周檢查了三個(gè) ovarian樣本，它們代表了三個(gè)重要的 ovarian發(fā)育階段馏臭∫坝總體而言讼稚，使用統(tǒng)一流形近似（UMAP）和投影對(duì)九個(gè)轉(zhuǎn)錄不同的clusters進(jìn)行分類和可視化∪粕颍可以清楚地看到九個(gè)clusters的位置锐想，伴隨著follicle和黃體。然后乍狐，將時(shí)空數(shù)據(jù)與 scRNA-seq 數(shù)據(jù)相結(jié)合赠摇，使用 SPOTlight 推斷復(fù)雜 ovarian組織內(nèi)細(xì)胞類型和狀態(tài)的位置（關(guān)于SPOTlight，大家可以參考文章10X空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析梳理浅蚪、10X單細(xì)胞空間聯(lián)合分析方法匯總及算法總結(jié)藕帜、10X單細(xì)胞空間分析回顧之SPOTlight）。如下所示惜傲，將八個(gè)明確識(shí)別的細(xì)胞類別映射到 10×Visium 時(shí)空 ovarian組織中洽故，發(fā)現(xiàn)基質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和 GC 是卵母細(xì)胞周圍的三個(gè)細(xì)胞類別盗誊∈鄙酰可以看到 ovarian細(xì)胞類型的所有空間位置。

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Genetic dynamics signatures of the granulosa cell lineage during follicle development

顆粒細(xì)胞（GCs）是follicle中不可或缺的一部分哈踱，直接與卵母細(xì)胞相互作用撞秋。為了通過UMAP分析在調(diào)查期間剖析GC在發(fā)育過程中的異質(zhì)性，將GC群體確定為11個(gè)clusters嚣鄙。為了獲得基因特征的動(dòng)態(tài)模式，鑒定了GC clusters特異性標(biāo)記基因串结。根據(jù)這些分析哑子，繪制了一個(gè)遺傳動(dòng)態(tài)模型，包括在follicle發(fā)育過程中的低分化肌割、mural卧蜓、卵丘、類固醇生成和增殖性 GC把敞。已知在早期發(fā)育階段 GC 中表達(dá)的基因是 Wt1 和 Foxl2弥奸；對(duì)于mural GC，Cyp19a1奋早；對(duì)于卵丘細(xì)胞盛霎，Slc38a3 和 Amh；對(duì)于類固醇生成的 GC耽装，Cyp11a1 和 Lhcgr愤炸。標(biāo)記基因 Wt1、Slc38a3掉奄、Cyp19a1 和 Cyp11a1 在 10× Visium 切片中可視化规个，與真實(shí)的組織學(xué)位置相匹配。低分化GCs的比例隨著時(shí)間的推移而降低，而卵丘GCs诞仓、mural GCs和類固醇GCs的比例隨著時(shí)間的推移而增加缤苫，并在3周或8周達(dá)到峰值。結(jié)果與 ovarian和follicle發(fā)育過程中的 GC 動(dòng)力學(xué)相匹配墅拭。然而活玲，沒有發(fā)現(xiàn)任何明顯的邊界來將原始follicle到竇follicle的 GC 分組。

為了剖析整個(gè)調(diào)查期間 GC 的命運(yùn)決定帜矾，根據(jù)上面報(bào)道的基因表達(dá)翼虫，它們沿著偽時(shí)間軌跡排列。獲得了三個(gè)狀態(tài)（在偽時(shí)間分析中使用的術(shù)語屡萤，其中“state”被分配來標(biāo)記 Monocle 中軌跡樹的片段）珍剑。此外，代表基因（上面確定的 3 個(gè)follicle形成階段的標(biāo)記基因）的表達(dá)以及偽時(shí)間軌跡與我們的推斷一致死陆。根狀態(tài)包含大部分差異較小的 GC招拙；狀態(tài) 1 包含大部分積云 GC、mural GC 和增殖 GC措译；狀態(tài) 3 包含大多數(shù)類固醇生成 GC别凤。在這樣的偽時(shí)間軌跡中，3 個(gè)分支暗示了具有細(xì)胞標(biāo)記的 GC 的 3 個(gè)分化階段领虹，例如 Wnt6规哪、Wt1、Hmgb2 和 Cyp11a1塌衰。對(duì)這三個(gè)州的代表性基因的 GO 分析顯示了相關(guān)的途徑诉稍。此外，分析了兩種主要細(xì)胞群（基質(zhì)細(xì)胞和 GC）與其他細(xì)胞類型之間的細(xì)胞串?dāng)_最疆。如下圖所示杯巨，除了 GC 和其他細(xì)胞類型之間廣泛的細(xì)胞間通訊外，基質(zhì)細(xì)胞和其他 ovarian細(xì)胞類型之間的細(xì)胞間通訊也更強(qiáng)努酸。

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Ovarian stromal cells are the main outgoing signaling cell type in ovarian cell communication during follicle development（ ovarian基質(zhì)細(xì)胞是follicle發(fā)育過程中 ovarian細(xì)胞通訊的主要傳出信號(hào)細(xì)胞類型）

為了分析這些細(xì)胞類型在小鼠 ovarian中的通訊服爷，進(jìn)一步進(jìn)行了 CellChat 分析（關(guān)于CellChat，大家可以參考文章10X單細(xì)胞（10X空間轉(zhuǎn)錄組）通訊分析之CellChat获诈、10X單細(xì)胞（10X空間轉(zhuǎn)錄組）通訊分析CellChat之多樣本通訊差異分析）仍源，以確定follicle發(fā)育過程中這些細(xì)胞類型之間的細(xì)胞通訊。第 3 天舔涎、第 5 天镜会、第 7 天、第 3 周和第 8 周的推斷交互次數(shù)分別為 723终抽、455戳表、522桶至、329 和 602，第 3 天的交互強(qiáng)度匾旭，第 5 天镣屹、第 7 天、第 3 周和第 8 周分別為 22.525价涝、6.705女蜈、10.16、3.534 和 4.065色瘩。發(fā)現(xiàn)第 3 天伪窖、第 7 天和第 8 周是細(xì)胞通訊的最強(qiáng)時(shí)間點(diǎn)。因此居兆，更多地關(guān)注第 3 天覆山、第 7 天和第 8 周。ovarian中的九種細(xì)胞類型之間存在非常復(fù)雜的細(xì)胞通訊泥栖，而基質(zhì)細(xì)胞是信號(hào)最強(qiáng)的細(xì)胞類型簇宽。進(jìn)一步的信號(hào)傳導(dǎo)作用分析表明，在六個(gè)重要的 ovarian發(fā)育時(shí)期吧享，基質(zhì)細(xì)胞在細(xì)胞間通訊中表現(xiàn)出最強(qiáng)的外向相互作用魏割。 GCs 是在第 3、5 和 7 天接收最多傳入受體信號(hào)的細(xì)胞類型钢颂，而上皮細(xì)胞是在 3 周和 8 周接收最多傳入受體信號(hào)的類型钞它。此外，在選定的時(shí)間過程中探索了特定類型的細(xì)胞通信殊鞭。發(fā)現(xiàn)基質(zhì)細(xì)胞經(jīng)常與所有其他細(xì)胞交流须揣。特別是，PTN钱豁、MK、ncWNT疯汁、PROS牲尺、GAS、ANGPTL 和 TWEAK 信號(hào)通路積極參與基質(zhì)細(xì)胞的輸出信號(hào)模式幌蚊。在傳出信號(hào)中谤碳，MK 在整個(gè)follicle發(fā)育階段表達(dá)。 PTN 僅在第 3 天溢豆、第 5 天和第 7 天檢測(cè)到蜒简，此時(shí)原始follicle激活和follicle發(fā)育為初級(jí)和次級(jí)follicle。比較了第 3 天和第 5 天漩仙，當(dāng)原始follicle被激活時(shí)搓茬，發(fā)現(xiàn) ncWnt犹赖、PROS、APELIN卷仑、GRN峻村、CALCR、ACTIVIN锡凝、IFN-1 和 LIFR 在第 2 天特異性表達(dá)粘昨，而 IL -1 和 ANNEXIN 在第 5 天特異性表達(dá)。其他信號(hào)通路窜锯，如 TWEAK张肾、PTN 和 MK，在第 5 天的表達(dá)水平高于第 5 天锚扎。當(dāng)比較第 7 天和第 5 天的相對(duì)信息流時(shí)吞瞪，發(fā)現(xiàn)IL-1、ANNEXIN工秩、CCL尸饺、BMP、FGF 和 ENHO 在第 5 天特異性表達(dá)助币，而 TWEAK浪听、APELIN、ANGPT眉菱、CALCR迹栓、CXCL、AMH俭缓、PERIOSTIN克伊、PROS、EDN 和 MIF 在第 7 天特異性表達(dá)华坦。其他信號(hào)通路愿吹，如 PTN 和 MK，在第 7 天的表達(dá)水平高于第 5 天惜姐。還將第 7 天的信號(hào)傳導(dǎo)與第 3 周的信號(hào)傳導(dǎo)進(jìn)行比較犁跪，發(fā)現(xiàn) PTN、TWEAK歹袁、EDN坷衍、MIF、TNF条舔、WNT 枫耳、PERIOSTEIN、CXCL孟抗、CALCR迁杨、APELIN钻心、IL-2和CSF在第7天特異性表達(dá)，而NPR2和HH在第3周特異性表達(dá)仑最。這些細(xì)胞信號(hào)通路在特定follicle發(fā)育階段發(fā)生變化扔役，表明分泌信號(hào)可能有助于follicle發(fā)育階段。由基質(zhì)細(xì)胞分泌的 MK 等分泌因子隨著follicle激活持續(xù)存在警医，直至follicle完全生長(zhǎng)亿胸，這可能代表了基質(zhì)細(xì)胞發(fā)送的支持follicle發(fā)育的重要信息。分析繪制了follicle發(fā)育中的關(guān)鍵信號(hào)通路预皇。因此侈玄，follicle發(fā)育過程中這些細(xì)胞群之間的細(xì)胞通訊提供了更多關(guān)于follicle發(fā)育調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的信息。

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Identification and genetic dynamics of ovarian stromal cell subpopulations

此外吟温，分析了 ovarian基質(zhì)細(xì)胞的 genetic dynamics序仙。當(dāng)基質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組與發(fā)育階段一起繪制時(shí)，鑒定出 11 個(gè)細(xì)胞clusters鲁豪。如前所述潘悼，鑒定了每個(gè)clusters內(nèi)的新標(biāo)記基因，其表達(dá)根據(jù)發(fā)育階段而變化爬橡。 CytoTRACE 分析表明clusters 6治唤、7 和 8 可能是基質(zhì)細(xì)胞的root（關(guān)于CytoTrace，大家可以參考文章10X單細(xì)胞軌跡分析（擬時(shí)分析）之cytotrace）糙申。對(duì)已識(shí)別clusters的特殊細(xì)胞標(biāo)志物的特征圖分析表明宾添，Tcf21 在整個(gè) ovarian基質(zhì)中的表達(dá)最高，Lum 表達(dá)主要在cluster 0柜裸、1缕陕、2、4疙挺、5 和 10 中扛邑。 Star 和 Cyp17a1 主要在cluster 1 和 9 中表達(dá)，Enpep 主要在cluster 3铐然、7 和 8 中表達(dá)蔬崩，干細(xì)胞標(biāo)記物 Aldh1a2 主要在cluster 6 中表達(dá)〗蹙簦基因 Lum、Cyp17a1奥裸、Enpep和 Aldh1a2 在 10× Visium 切片中可視化险掀，并使用原位雜交 (ISH)、免疫組織化學(xué) (IHC) 或免疫熒光 (IF) 進(jìn)行驗(yàn)證湾宙。follicle周圍基質(zhì)細(xì)胞中的 Lum 表達(dá)支持follicle的生長(zhǎng)樟氢。 Cyp17a1不僅位于follicle周圍的膜細(xì)胞中冈绊，而且還位于膜外的一些基質(zhì)細(xì)胞中。此外埠啃，Enpep 表達(dá)與follicle發(fā)育有關(guān)死宣，并通過 ISH 得到證實(shí)。 Aldh1a2主要在 ovarian上皮和 ovarian皮質(zhì)基質(zhì)中表達(dá)碴开。結(jié)果表明毅该，ovarian基質(zhì)細(xì)胞不是指單一的同質(zhì)細(xì)胞群，可以借助 scRNA-seq 和空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法進(jìn)行明確分類潦牛。

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Fate transition of stromal cells along pseudotime trajectories and clear stromal cell classification

為了剖析整個(gè)研究期間基質(zhì)細(xì)胞的命運(yùn)決定眶掌，根據(jù)基因表達(dá)沿偽時(shí)間軌跡對(duì)它們進(jìn)行排序“屯耄可以看到第3天朴爬、第5天和第7天的大部分細(xì)胞處于root狀態(tài)，而基質(zhì)細(xì)胞在第7天開始分化橡淆。這一發(fā)現(xiàn)表明第7天是基質(zhì)細(xì)胞分化的時(shí)間點(diǎn)召噩。細(xì)胞偽時(shí)間軌跡顯示 5 個(gè)基質(zhì)細(xì)胞狀態(tài)和 2 個(gè)分支點(diǎn)。clusters 6 和 10 處于根狀態(tài)的起點(diǎn)逸爵。結(jié)合 CytoTRACE 的結(jié)果和特定的細(xì)胞標(biāo)志物進(jìn)行綜合分析具滴，發(fā)現(xiàn)cluster 6 可能是基質(zhì)細(xì)胞的祖細(xì)胞。該cluster的特征在于與生物過程相關(guān)的基因的表達(dá)痊银，例如“PI3K-Akt 信號(hào)通路”抵蚊、“粘著斑”和“內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工”，這些基因在狀態(tài) 1 細(xì)胞溯革，表明基質(zhì)細(xì)胞具有幼稚的典型功能贞绳。編碼“脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化”、“MAPK 信號(hào)通路”和“FoxO 信號(hào)通路”成員的基因?qū)儆跔顟B(tài) 3致稀，證實(shí)了基質(zhì)細(xì)胞中存在類固醇激素產(chǎn)生冈闭。狀態(tài) 5 由編碼參與“亨廷頓病”、“肌萎縮側(cè)索硬化”和“氧化磷酸化”的蛋白質(zhì)的基因組成抖单，這表明這些基質(zhì)細(xì)胞處于高功能狀態(tài)萎攒。基因Ptn和Gstm6主要表達(dá)在狀態(tài)1矛绘，Enpep主要表達(dá)在狀態(tài)5耍休，Star主要表達(dá)在狀態(tài) 3。此外货矮，鑒定出4個(gè)具有不同模式的基因組羊精，4個(gè)基因組的特異代表基因，即 Sfrp1囚玫、Fhl2喧锦、Tmem100 和 Cebpb读规。

綜合以上所有結(jié)果，將 ovarian基質(zhì)細(xì)胞分為 4 個(gè)亞群：結(jié)構(gòu)基質(zhì)細(xì)胞燃少、濾泡周基質(zhì)細(xì)胞束亏、基質(zhì)祖細(xì)胞和類固醇基質(zhì)細(xì)胞。 多模態(tài)交叉分析 (MIA) 也證實(shí)了 10× Visium 切片中基質(zhì)細(xì)胞的分類阵具。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證 ovarian基質(zhì)細(xì)胞分類碍遍，在 E11.5 和 8 周之間的 11 個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)follicle和小鼠 ovarian周圍的人 ovarian組織進(jìn)行了分析。分析中包括具有直徑為 2 mm 和 5 mm 的follicle的人類 ovarian組織怔昨。根據(jù)已知的細(xì)胞標(biāo)志物雀久， ovarian細(xì)胞可分為5個(gè)細(xì)胞亞群，基質(zhì)細(xì)胞可分為6個(gè)clusters趁舀。ENPEP+ 濾泡周圍基質(zhì)細(xì)胞和 CYP17A1+ 類固醇生成基質(zhì)細(xì)胞包圍了人類follicle赖捌。然后，在 E11.5 和 1 天之間的六個(gè)時(shí)間點(diǎn)將數(shù)據(jù)與 ovarian整合矮烹，并確定了 11 種 ovarian細(xì)胞類型越庇。在這些細(xì)胞類型中，基質(zhì)細(xì)胞和 GC 也占人口的絕大多數(shù)奉狈÷卑Γ基質(zhì)細(xì)胞分為 10 個(gè)cluster，大多數(shù) Aldh1a2+ 基質(zhì)祖細(xì)胞在 E11.5 和偽時(shí)間軌跡的根部出現(xiàn)仁期。

Combining mouse and human single-cell data, the results confirmed our classification of ovarian stromal cells.

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Specific regulon networks of ovarian stromal cells during follicle development

為了更深入地了解上述四組細(xì)胞的功能桑驱，使用 SCENIC 進(jìn)一步研究了基質(zhì)細(xì)胞特異性 TF 的調(diào)節(jié)子（轉(zhuǎn)錄因子（TF））活性。在follicle發(fā)育過程中確定了幾個(gè)重要的 TF跛蛋“镜模基于具有默認(rèn)過濾參數(shù)的 5,481 個(gè)過濾基因的 51 個(gè)調(diào)節(jié)子活性，調(diào)節(jié)子活性與發(fā)育階段相匹配赊级，并列出了具有代表性的調(diào)節(jié)子押框。如圖所示，一系列 TF 顯示出更加動(dòng)態(tài)的模式理逊。例如橡伞，Maf、Wt1晋被、Gata6 和 Erg1 主要在早期發(fā)育階段活躍兑徘。隨著follicle發(fā)育的繼續(xù)，F(xiàn)oxo1羡洛、Runx1挂脑、Stat1 和 Smarca4 似乎主要在follicle成熟的 3 周和 8 周階段被激活。由于基質(zhì)細(xì)胞在第 7 天開始在細(xì)胞偽時(shí)間軌跡中分化成不同的命運(yùn)，專注于這個(gè)時(shí)間點(diǎn)最域。 Yy1、Jdp2锈麸、Cebpb 和 Maff 主要在第 7 天活躍镀脂。Bclaf1 的調(diào)節(jié)子活性在第 7 天特別關(guān)閉。這些調(diào)節(jié)子活性模式可能為 ovarian基質(zhì)細(xì)胞命運(yùn)的確定提供新的見解忘伞。

此外薄翅，當(dāng)將調(diào)節(jié)子活性與 ovarian基質(zhì)細(xì)胞亞群聯(lián)系起來時(shí)，發(fā)現(xiàn)一些 TF 顯著代表特定的 ovarian基質(zhì)細(xì)胞亞群氓奈。 Gata6 和 Wt1 主要在沒有濾泡周圍基質(zhì)細(xì)胞的基質(zhì)細(xì)胞亞群中活躍翘魄。 E2f1 和 Ezh2 主要在濾泡周基質(zhì)細(xì)胞中活躍。 Maff 和 Irf1 等 TF 主要在類固醇基質(zhì)細(xì)胞中活躍舀奶。 Irx3暑竟、Runx1 和 Smad3 主要在基質(zhì)祖細(xì)胞亞群中活躍。

ovarian基質(zhì)細(xì)胞的特定調(diào)節(jié)子網(wǎng)絡(luò)的產(chǎn)生確定了與不同 ovarian基質(zhì)細(xì)胞亞群相關(guān)的幾個(gè)重要 TF育勺，幫助研究人員在體外探索 ovarian基質(zhì)細(xì)胞的命運(yùn)但荤。

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Stromal-derived MK coculture promotes follicle development

由于 MK 信號(hào)在整個(gè)follicle發(fā)育階段表達(dá)，將 midkine 添加到與包裹在藻酸鹽中的follicle共培養(yǎng)中涧至，以進(jìn)一步證實(shí)外向 ovarian基質(zhì)細(xì)胞信號(hào)在follicle發(fā)育中的作用腹躁。 ovarian基質(zhì)細(xì)胞是外向 MK 信號(hào)的主要來源，并且GC是主要目標(biāo)南蓬。受體-配體分析表明纺非，Ncl、Sdc4赘方、(Itga6+ Itgb1) 和 Lrp1 是 MK 信號(hào)傳導(dǎo)的主要貢獻(xiàn)者烧颖。從第 3 天、第 5 天蒜焊、第 7 天倒信、第 3 周和第 8 周對(duì)小鼠 ovarian進(jìn)行了 Mdk ISH 分析。Mdk 主要位于 ovarian基質(zhì)中泳梆，在第 5 天小鼠 ovarian中表達(dá)最高鳖悠。隨著follicle的發(fā)育，Mdk表達(dá)主要發(fā)生在生長(zhǎng)follicle周圍的基質(zhì)中优妙，而在竇狀follicle或黃體周圍減少乘综，表明它可能在follicle發(fā)育和成熟中起重要作用。然后研究了 Mdk 配體的表達(dá)和定位套硼。 ISH和IHC均顯示Ncl和Lrp1主要在生長(zhǎng)follicle的GCs中表達(dá)卡辰。接下來，將純化的 MK 添加到培養(yǎng)基中，以在體外與早期次級(jí)follicle共培養(yǎng)九妈。結(jié)果表明反砌，midkine 顯著促進(jìn)了follicle生長(zhǎng)的增加。這些結(jié)果證實(shí)了 ovarian基質(zhì)細(xì)胞與follicle的串?dāng)_作用促進(jìn)了follicle的發(fā)育。

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Perifollicular stromal cells can differentiate into theca-like cells in vitro

為了研究基質(zhì)細(xì)胞亞群在follicle發(fā)育中的作用，使用 ENPEP-PE 抗體通過流式細(xì)胞儀分選獲得了follicle周圍基質(zhì)細(xì)胞式廷。 ENPEP+ 濾泡周圍基質(zhì)細(xì)胞比 ENPEP- 細(xì)胞更像成纖維細(xì)胞啤它。免疫熒光分析顯示 ENPEP+ 濾泡周圍基質(zhì)細(xì)胞表達(dá) ENPEP 和 COL1A1 但不表達(dá) FOXL2。 ENPEP-細(xì)胞不表達(dá) ENPEP 或 COL1A1 并且具有高水平的 FOXL2 表達(dá)。 qPCR 分析顯示 ENPEP+ 濾泡周圍基質(zhì)細(xì)胞具有較高水平的 Pdgfa、Enpep 和 Mdk，而較低水平的 Amhr2 和 Foxl2锭吨。在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，ENPEP+ 濾泡周圍基質(zhì)細(xì)胞在傳代到第三代 (P3) 時(shí)不能增殖寒匙，這表明 ENPEP+ 濾泡周圍基質(zhì)細(xì)胞可以在體外分化零如。膜細(xì)胞標(biāo)志物 Star 和 Cyp17a1 的免疫熒光和 qPCR 分析證實(shí)，ENPEP+ 濾泡周圍基質(zhì)細(xì)胞在長(zhǎng)期體外培養(yǎng)中分化為膜樣細(xì)胞锄弱。結(jié)果揭示了 ovarian基質(zhì)細(xì)胞類型分類的重要性埠况。這些結(jié)果表明，濾泡周基質(zhì)細(xì)胞不僅具有旁分泌作用棵癣，而且還具有分化功能辕翰。

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Discussion

ovarian和follicle發(fā)育在哺乳動(dòng)物中是一個(gè)復(fù)雜的過程，要全面了解其調(diào)控需要整合從 ovarian中各種細(xì)胞類型收集的數(shù)據(jù)的多種類型和空間位置狈谊。在這里喜命，對(duì)小鼠 ovarian內(nèi)五個(gè)不同發(fā)育階段（從原始follicle激活階段到成熟follicle階段，第 3 天到第 8 周）的所有細(xì)胞類型進(jìn)行了 scRNA-seq 和空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析河劝，以提供新的和全面的見解進(jìn)入小鼠 ovarian和follicle發(fā)育的調(diào)節(jié)壁榕。在這項(xiàng)研究中，鑒定了follicle的小生境細(xì)胞赎瞎，例如基質(zhì)細(xì)胞牌里、GC、上皮細(xì)胞务甥、內(nèi)皮細(xì)胞和免疫細(xì)胞牡辽。此外，分析揭示了每個(gè)發(fā)育階段基質(zhì)細(xì)胞與其他細(xì)胞類型之間的轉(zhuǎn)錄譜和細(xì)胞通訊的獨(dú)特特征敞临。此外态辛，確定了四個(gè)以前未完全表征和分類的基質(zhì)細(xì)胞clusters：結(jié)構(gòu)基質(zhì)細(xì)胞、濾泡周圍基質(zhì)細(xì)胞挺尿、基質(zhì)祖細(xì)胞和類固醇基質(zhì)細(xì)胞奏黑。結(jié)構(gòu)性基質(zhì)細(xì)胞分布在整個(gè) ovarian中炊邦，主要執(zhí)行支持功能。follicle周圍基質(zhì)細(xì)胞分布在生長(zhǎng)的follicle周圍熟史，不僅通過分泌信號(hào)調(diào)節(jié)follicle發(fā)育馁害，還可以分化和補(bǔ)充follicle細(xì)胞□迤ィ基質(zhì)祖細(xì)胞主要位于 ovarian皮質(zhì)蜗细，是所有基質(zhì)細(xì)胞類型的祖細(xì)胞。生成類固醇的基質(zhì)細(xì)胞分布在 ovarian髓質(zhì)中并合成類固醇激素怒详。這些確定的細(xì)胞類型和 ovarian發(fā)育中特定階段的基因表達(dá)為未來的功能研究提供了有價(jià)值的信息。

隨著 scRNA 和空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)的發(fā)展以補(bǔ)充詳細(xì)的成像研究踪区，有能力更好地表征 ovarian細(xì)胞群昆烁，并在了解它們?cè)谏砗筒±磉^程中的個(gè)體作用時(shí)用更精確的名稱來指代它們。以往關(guān)于follicle發(fā)育的研究大多集中在follicle體上缎岗，而忽略了基質(zhì)細(xì)胞的功能静尼。研究發(fā)現(xiàn)基質(zhì)對(duì)follicle發(fā)育至關(guān)重要，僅關(guān)注follicle是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的传泊。 ovarian基質(zhì)細(xì)胞亞群復(fù)雜鼠渺，區(qū)域差異可能影響基質(zhì)細(xì)胞的分布和亞型。多個(gè) ovarian基質(zhì)細(xì)胞群的特征不完全眷细，但已經(jīng)通過 scRNA 與空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)的結(jié)合鑒定了四種類型的 ovarian基質(zhì)細(xì)胞拦盹。單細(xì)胞 RNA 測(cè)序?qū)嶒?yàn)已經(jīng)在識(shí)別主要 ovarian細(xì)胞類型、過渡階段和細(xì)胞識(shí)別標(biāo)記方面取得了進(jìn)展溪椎。然而普舆，在先前的研究中，關(guān)于 ovarian基質(zhì)細(xì)胞的數(shù)據(jù)仍然難以捉摸并且相對(duì)稀缺校读。最近來自小鼠和人類的 scRNA 數(shù)據(jù)顯示了 ovarian基質(zhì)細(xì)胞的異質(zhì)性沼侣，但這些研究主要集中在 GC 和卵母細(xì)胞上。單細(xì)胞測(cè)序無法提供細(xì)胞群的空間信息歉秫，導(dǎo)致 ovarian基質(zhì)細(xì)胞的表征不完整蛾洛。

follicle與支持的基質(zhì)細(xì)胞保持接觸，這些細(xì)胞提供了觸發(fā)follicle生長(zhǎng)激活的局部生化控制途徑雁芙≡欤基質(zhì)到follicle旁分泌信號(hào)對(duì)follicle發(fā)育非常重要。為了探索 ovarian基質(zhì)細(xì)胞和 ovarian其他細(xì)胞群之間的細(xì)胞間通訊兔甘，闡明基質(zhì)細(xì)胞對(duì)follicle周圍微環(huán)境的影響至關(guān)重要扶供。在這項(xiàng)研究中，繪制了 ovarian內(nèi)各種細(xì)胞類型之間的分泌信號(hào)網(wǎng)絡(luò)裂明，并揭示了 ovarian基質(zhì)細(xì)胞作為主要外向分泌信號(hào)的作用椿浓。分析鑒定的分泌信號(hào)（如 MDK）為基質(zhì)細(xì)胞在follicle微環(huán)境中的作用提供了新的見解太援。因此，通過將基質(zhì)細(xì)胞整合到當(dāng)前的三維培養(yǎng)系統(tǒng)中扳碍，可以顯著增強(qiáng)共培養(yǎng)的影響提岔。先前的研究還表明，由基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)的骨形態(tài)發(fā)生蛋白 BMP-4 和 BMP-7 與原始follicle向初級(jí)follicle的轉(zhuǎn)變有關(guān)笋敞。這些過程中涉及的旁分泌信號(hào)被假設(shè)為未知因素的復(fù)雜的時(shí)間依賴性協(xié)同作用碱蒙。

在這項(xiàng)研究中，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)被生長(zhǎng)的follicle包圍并與膜細(xì)胞相鄰的 ovarian基質(zhì)細(xì)胞亞群夯巷，稱為 ovarian濾泡周基質(zhì)細(xì)胞赛惩。 ovarian濾泡周基質(zhì)細(xì)胞不僅可以發(fā)送分泌信號(hào)（如 MDK），還可以分化成類固醇基質(zhì)細(xì)胞趁餐，表達(dá)膜細(xì)胞標(biāo)志物 Star 和 Cyp17a1喷兼。研究結(jié)果支持膜細(xì)胞是從周圍的基質(zhì)細(xì)胞中募集的，并確定了一種特殊的基質(zhì)細(xì)胞亞群后雷。膜細(xì)胞在follicle發(fā)生過程中發(fā)揮多種必要作用季惯；它們合成雄激素，在發(fā)育過程中提供與 GC 和卵母細(xì)胞的串?dāng)_臀突，并在發(fā)育階段為生長(zhǎng)中的follicle提供結(jié)構(gòu)支持勉抓，以產(chǎn)生成熟且可受精的卵母細(xì)胞。以前認(rèn)為候学，膜細(xì)胞是通過激活的初級(jí)follicle分泌的因子從周圍的基質(zhì)組織中募集的藕筋。這些招募因素的確切來源和身份目前尚不清楚。長(zhǎng)期以來梳码，人們一直認(rèn)為這些特化細(xì)胞起源于成纖維細(xì)胞樣基質(zhì)細(xì)胞念逞。推定的未分化祖細(xì)胞膜不表達(dá) LH 受體 (LHR) 或類固醇生成酶，因此對(duì) LH 沒有反應(yīng)边翁，這表明膜細(xì)胞分化的起始是促性腺激素獨(dú)立的翎承。最近，研究還表明符匾，鞘干細(xì)胞的自體移植可恢復(fù)非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物的 ovarian功能叨咖。使用的鞘干細(xì)胞是總 ovarian基質(zhì)細(xì)胞，而不是單細(xì)胞群啊胶。研究通過細(xì)胞分選鑒定并獲得了功能性濾泡周圍基質(zhì)細(xì)胞甸各，這些細(xì)胞可以分化成膜細(xì)胞。這一發(fā)現(xiàn)為 ovarian早衰（POI）干細(xì)胞療法的發(fā)展提供了新的思路焰坪。

假設(shè)基質(zhì)細(xì)胞來自一群非特化的間充質(zhì)干細(xì)胞趣倾，但它們的起源和生理作用仍然難以捉摸，需要更多令人信服的數(shù)據(jù)某饰。已經(jīng)確定Aldh1a2是 ovarian基質(zhì)祖細(xì)胞的標(biāo)記基因儒恋，主要在 ovarian表面上皮細(xì)胞和 ovarian皮質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)善绎。 Aldh1a2+ ovarian基質(zhì)祖細(xì)胞主要處于假時(shí)間軌跡中基質(zhì)細(xì)胞發(fā)育的起源。還注意到诫尽，隨著時(shí)間的推移禀酱，Aldh1a2+ ovarian基質(zhì)祖細(xì)胞數(shù)量減少，這表明 ovarian功能的衰減不僅是follicle池的下降牧嫉，而且是 ovarian基質(zhì)祖細(xì)胞的下降剂跟。醛脫氫酶 1 (ALDH1) 是正常組織干細(xì)胞的標(biāo)志物，參與自我更新酣藻、分化和自我保護(hù)曹洽。研究表明， ovarian表面上皮細(xì)胞和亞表面區(qū)域中表達(dá) Aldh1a1 和 Aldh1a2 的干細(xì)胞niche辽剧。

ovarian間質(zhì)異常是許多臨床 ovarian功能障礙疾病的重要原因送淆，如多囊 ovarian綜合征（PCOS）。 PCOS是女性常見的內(nèi)分泌疾病抖仅，其特征是排卵過少或無排卵、雄激素過多癥和 ovarian多囊癥砖第。 PCOS患者 ovarian可見皮質(zhì)增厚撤卢、間質(zhì)增生和囊狀竇follicle，伴有 ovarian體積梧兼、間質(zhì)體積顯著增加放吩，間質(zhì)血流速度加快。超排卵治療挽救了異常的基質(zhì)形態(tài)羽杰，導(dǎo)致一些 PCOS 患者獲得了成熟的卵母細(xì)胞渡紫。基質(zhì)細(xì)胞異常是PCOS的一個(gè)重要原因考赛，但機(jī)制尚不清楚惕澎。血管生成素樣蛋白 (Angptl-4) 和 TWEAK11 被認(rèn)為與 PCOS 的發(fā)病機(jī)制有關(guān)，并且是 ovarian基質(zhì)細(xì)胞與其他細(xì)胞類型通訊的兩個(gè)主要信號(hào)通路颜骤。此外唧喉，研究表明， ovarian濾泡周圍的基質(zhì)細(xì)胞與follicle一起生長(zhǎng)忍抽，可以分化成膜樣細(xì)胞八孝；因此，PCOS中基質(zhì)異常的原因可能是 ovarian濾泡周圍基質(zhì)細(xì)胞功能障礙鸠项。 ovarian濾泡周圍基質(zhì)細(xì)胞的異常增殖可導(dǎo)致基質(zhì)增生干跛，增加向膜樣類固醇生成基質(zhì)細(xì)胞的分化可導(dǎo)致高雄激素血癥。因此祟绊，對(duì) ovarian濾泡周基質(zhì)細(xì)胞的分類為 PCOS 的發(fā)生和治療提供了新的見解楼入。

In summary, this work provides new insights into the crucial features of mouse follicle development, especially stromal cells. Our study paves the way for understanding the molecular regulation of ovarian stromal cells in follicle development. It also lays a solid foundation for ovarian stromal cell classification and origin identity. We obtained functional perifollicular stromal cells and identified the vital secreted factors that promote follicle development in vivo and in vitro. More importantly, we have uncovered the reciprocal relationship between the signaling pathways of follicles and their niche cells, which will provide a valuable resource for further optimizing and improving the efficiency of follicle culture in vitro. Our understanding of stromal cell subpopulations will help us better understand stromal cell hormone production and responsiveness, pathological ovarian stromal changes, such as polycystic ovary syndrome or premature ovarian insufficiency, and stromal contributions to artificial ovary technology.

Method（關(guān)注一些重點(diǎn)方法）

• 單細(xì)胞空間聯(lián)合 ---- SPOTlight

• 軌跡分析 ---- CytoTRACE 哥捕、monocle2

• 基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò) ---- SCENIC

生活很好，有你更好